This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Preparação do péptido Matrizes <ol><li> Programação do Peptide Sequências <ol><li> Conceber sequências de péptidos para a síntese utilizando o software MultiPep observador. Entre as sequências peptídicas em códigos de letras individuais. Péptido 1: TARKSTGGKA </li><li> Gerar alanina ou arginina pé bibliotecas com um comando específico (.replace, A) para rastrear os aminoácidos importantes necessários para o reconhecimento de um substrato definido. Por exemplo, no exemplo que se segue a primeira linha é a sequência de tipo selvagem e a partir da segunda linha de cada aminoácido num péptido é alterado para alanina sequencialmente. substituir, Um TARKSTG A -ARKSTG T- A -RKSTG TA A -KSTG TARGET A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G A TARKST- </li><li> Use comandos semelhantes (.replace R,.N substituir etc.), tal como descrito em 1.1.2 com todos os resíduos de aminoácido naturalmente disponíveis (eventualmente omitindo cisteína, metionina e triptofano, porque estes resíduos são propensos a oxidação e, por vezes, menor rendimento de síntese) para sintetizar um péptido de matriz para a determinação do consenso motivo da sequência substrato para uma enzima. NOTA: Como mostrado na Figura 4A, o eixo horizontal representa a sequência do péptido dada e o eixo vertical representa os aminoácidos que são seleccionadas para o comando. Semelhante à sequência mostrada em 1.1.2, uma no eixo vertical significa que uma sequencialmente Ala substitui cada posição da sequência dada na primeira fila na FIG. 4A. Do mesmo modo sequencialmente arginina substitui cada aminoácido na segunda fila e assim por diante com outros aminoácidos. Bibliotecas de matriz péptido completas são sintetizados por substituição sistemática de cada resíduo na sequência de péptido substrato fornecida com cada uma das the outros resíduos de aminoácidos naturalmente disponíveis, o que ajuda a entender a influência de cada resíduo em cada posição da sequência dada. </li><li> Como alternativa, a metilação de substratos peptídicos conhecida ou prevista pode ser facilmente verificada sintetizar bibliotecas de péptidos com os péptidos alvo do PKMT juntamente com controles de metilação positivo e negativo (ou seja, peptídeos conhecidos desnaturado ou conhecidos não ser metilado). Sintetizar peptídeos através da troca de lisina alvo putativo para alanina para confirmar a metilação da lisina-alvo, como mostrado abaixo pela programação manual. Tipo selvagem peptídeo: STGG K PRQFL Peptídeo Mutant: STGG A PRQFL NOTA: O software também tem os scripts inerentes para criar diversas bibliotecas, como mapeamento de epitopo com uma mudança de enquadramento desejada da sequência de aminoácidos para mapear importantes necessários para uma interacção. </li></ol></li><li> Preparação de Membrana, Aminoácidos umd Reagentes <ol><li> Pré-inchar a membrana SPOT em DMF (N, N-dimetilformamida) durante 10 minutos e em seguida, coloque a membrana molhado na armação SPOT sintetizador sem bolhas de ar ou rugas. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com etanol a 100%. Secam-se as membranas completamente durante pelo menos 10 min antes de iniciar o programa de síntese. </li><li> Em paralelo, preparar de fresco 0,5 M concentrações úteis de aminoácidos protegidos com Fmoc comercialmente disponíveis através da dissolução em NMP e também preparar o activador e de base como descrito na Tabela 1. </li><li> Certifique-se de que todos os recipientes de solução resíduos do sintetizador SPOT foram esvaziados e reabastecer os reservatórios de solvente com o DMF, etanol e piperidina. NOTA: A máquina está pronta para a síntese. </li></ol></li><li> A mancha de primeiro aminoácido <ol><li> Para gerar a ligação amida com o grupo amino livre sobre a membrana, activar o grupo carboxilo do amino ácido de entrada por adding o activador (N, N &#39;-diisopropilcarbodiimida) e solução de base (hidroxiimino Cianoacetato de etilo) para o derivado de aminoácido. </li><li> Spot the volumes desejados de aminoácidos ativados na membrana funcionalizado Amino-PEG usando o robô programável. NOTA: Deste modo, o C-terminal do aminoácido é acoplado ao grupo amino da membrana. </li><li> Repetir esta etapa, três vezes para garantir um melhor acoplamento do primeiro aminoácido activado. Incubar a membrana durante 20 minutos e, em seguida, lava-se com DMF, para remover os aminoácidos desacoplados. </li></ol></li><li> Bloqueio de espaços livres em áreas não-local NOTA: Após o acoplamento do primeiro aminoácido C-terminal de todos os péptidos para o grupo amino da membrana, os grupos amino entre as manchas e também alguns dos grupos amino no local dentro das áreas não formar ligações com os aminoácidos. <ol><li> Bloquear os grupos amino livres através da incubação com a solução de nivelamento (20% de anidrido acético em DMF)durante 5 min. NOTA: Este evita o acoplamento de aminoácidos nos ciclos posteriores, com a membrana em vez da cadeia peptídica em crescimento. </li></ol></li><li> A remoção do grupo Fmoc <ol><li> Após o bloqueio, lavar a membrana com DMF 4 vezes e depois incubar com 20% de piperidina em DMF durante 20 min para remover o grupo de protecção Fmoc. NOTA: Este passo leva à remoção dos grupos Fmoc protectores de amino e é chamado de desprotecção. </li><li> Em seguida, lava-se a membrana duas vezes com DMF e duas vezes com etanol e deixar secar. NOTA: Agora, a membrana está pronto para o acoplamento dos próximos amino ácidos. </li></ol></li><li> O alongamento da cadeia NOTA: A adição de cada aminoácido é chamada um ciclo. Para além do acoplamento do primeiro aminoácido, o ciclo inicia-se com a desprotecção do grupo Fmoc do aminoácido acoplado e é seguido pelo acoplamento do grupo carboxilo activado de um amino ácido de entrada para o grupo amino do pep crescentecadeia maré. <ol><li> Repita os passos 1.3 e 1.5 até que o comprimento de péptido desejado é alcançado. </li></ol></li><li> Coloração NOTA: Após o ciclo final, as matrizes de peptídeos são corados com azul de bromofenol para confirmar a síntese bem-sucedida de peptídeos. Azul de bromofenol se liga com os grupos amino livres dos péptidos. Manchas de péptidos mostrar luz cor azul após a coloração, mas a intensidade das manchas varia dependendo da sequência peptídica. Esta coloração permite a confirmação da remoção completa de piperidina, porque na presença de azul de bromofenol a piperidina não mancha os péptidos. Além disso, isto também ajuda a marcar as matrizes de péptidos para posterior utilização. <ol><li> Após desprotecção do grupo Fmoc no último ciclo de síntese, lava-se a membrana com DMF e etanol a 100%. Em seguida, tratar a membrana com azul de bromofenol (0,02% de azul de bromofenol em DMF) durante um mínimo de 5 minutos até que se torne azul completamente. </li><li> Em seguida, lava-se a membrana com DMF e ethanol seguido por secagem durante 10 min. Agora tire a membrana do sintetizador e realizar a desprotecção da cadeia lateral (seção 1.8) manualmente. Se necessário, a fotografia da membrana para registar os resultados da síntese de péptidos (Fig. 2). </li></ol></li><li> Cadeia Lateral desprotecção <ol><li> Tratar as membranas com 20 a 25 ml de mistura de desprotecção da cadeia lateral que consiste em 95% de ácido trifluoroacético (TFA) para clivar os grupos de protecção de cadeia lateral e reagentes eliminadores de água (2,5% e 2,5% de triisopropilsilano) para proteger as cadeias laterais de aminoácidos a partir de modificação durante este passo. Tomar um volume suficiente da mistura de desprotecção para assegurar que abrange a membrana completamente numa caixa resistente a produtos químicos e hermeticamente fechado e que incubar durante 1 a 2 horas enquanto se agita suavemente. </li><li> Lava-se a membrana seis vezes com 20-25 mL de DCM (diclorometano), durante 2 minutos cada e, finalmente, duas vezes com etanol a 100% e seca-se num exsicador durante a noite. NOTA: Agoraa membrana pode ser utilizado para experiências. Um esquema de síntese da matriz péptido é fornecida na Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Expressão de Proteína de PKMTs como GST Fusions <ol><li> Usando técnicas padrão, clonar o gene que codifica o PKMT comprimento completo ou o seu domínio catalítico num vector de expressão bacteriana (como pGEX-6p2) para expressar a proteína de fusão-GST. </li><li> Transferir o vector com o PKMT desejado inserir em BL21 BL21 codão ou mais E. células de E. coli pelo método de choque de calor ou qualquer outro método. </li><li> Prepara-se uma pré-cultura com 30 ml de meio de Luria-Bertani (LB), o dia de expressão e incubar a 37 ° C durante 7 a 8 horas com agitação contínua. </li><li> Em seguida, transferir 10 ml da pré-cultura em 2 L de frascos de grandes confundidos contendo 1 L de meio LB e incubar a 37 ° C no incubador com agitação contínua até que o alcance culturaes uma densidade óptica a 600 nm definido. NOTA: Enquanto isto pode ser optimizado para cada proteína, que normalmente induzem a um OD 600 nm de cerca de 0,8. A temperatura de indução tem de ser optimizados para cada proteína individual, algumas proteínas mostram boa expressão em 22 ° C e a temperaturas um pouco mais elevadas. </li><li> Deslocar as células à temperatura de indução, durante 15 min, em seguida, induzir com 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido e permitir a cultura a crescer durante 10-12 horas à temperatura de indução. </li><li> Em seguida a colheita das células por centrifugação a 5000 xg durante 15 min e, finalmente, lavar o sedimento com 30 ml de tampão de STE (10 mM de Tris, pH 8,0, NaCl 100 mM e EDTA 0,1 mM) e armazenar a -20 ° C para posterior utilização. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Descongelar o pellet celular e re-suspensão em 30 ml de tampão de sonicação (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) e perturbar por sonicação. NOTA: Este tampão needs de ser optimizados para cada proteína, eventualmente. </li><li> Centrifuga-se o lisado celular a 22000 x g durante 1 hora e, depois, recolher o sobrenadante e passar através de uma coluna contendo 600 mL de resina glutationa Sepharose 4B. </li><li> Lava-se a coluna com 50 ml de tampão de sonicação e em seguida com 100 ml de tampão de alto teor salino (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) para remover as proteínas não especificamente ligadas. Elui-se a proteína ligada com 5 ml de tampão de alto teor salino contendo glutationa 40 mM. </li><li> Dializar a proteína eluída em 2 L de tampão de diálise com baixo glicerol (20 mM de Tris, pH 7,4, KCl 100 mM, DTT 0,5 mM e glicerol a 10%) durante 2 horas e depois em tampão Tris 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e glicerol a 70% durante 8 horas ou durante a noite. Certifique-se de todos os buffers de purificação são a 4 ° C e realizar a purificação de proteínas na câmara fria para evitar a desnaturação das proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Peptide Matriz Methylation <ol><li> Pré-incubation of Peptide Arrays <ol><li> Realizar péptido matriz de metilação, quer dentro de uma caixa de tamanho apropriado ou em um saco de plástico para evitar o desperdício de enzima e caro marcado radioactivamente AdoMet. Pré-incubar o péptido matriz da membrana no saco de plástico selado contendo o respectivo tampão de metilação sem enzima e rotulado [metil-3H] -AdoMet durante 10 min. O volume de tampão depende do tamanho da matriz, por exemplo, usar 8 ml de tampão de metilação de uma especificidade completa matriz perfil peptídico. Optimizar a quantidade e a concentração da AdoMet para cada enzima. </li></ol></li><li> A metilação do péptido Matrizes <ol><li> Descartar o tampão de pré-incubação e incubação da membrana em 8 ml de tampão de metilação contendo a respectiva PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet por 1 a 2 horas. NOTA: A quantidade de enzima necessária para uma reacção de metilação depende da actividade de PKMT específico, iniciamos nossas experiências de rastreio, tipicamente com 50 nM de enzima aletaconcentração al. </li></ol></li><li> Lavagem das matrizes Peptide <ol><li> Depois descartar o tampão de metilação de um recipiente de resíduos radioactivos e lavar as matrizes de péptidos por 5 vezes com 20 ml de tampão contendo 100 mM de bicarbonato de amónio e 1% de SDS durante 5 minutos para remover a proteína ligada. Descarte o tampão de lavagem em um recipiente de lixo radioativo. </li></ol></li><li> A detecção do sinal radioativo <ol><li> Após as lavagens da membrana incubar durante 5 min em 10 ml de solução amplificar (NAMP100V). </li><li> Em seguida, descartar a solução amplificar no contentor de resíduos radioactivos para solventes orgânicos, selar a matriz peptídeo em um saco plástico e coloque-o em uma cassete de auto-radiografia. </li><li> Coloque a película auto-radiografia da matriz sobre o péptido em quarto escuro. Fechar a cassete cuidadosamente e expô-lo a -80 ° C durante o tempo necessário. Em seguida, o desenvolvimento do filme para analisar os resultados. Capturar a imagem do casal vezes com expositio diferenten vezes para evitar a saturação de substratos peptídicos fortemente metilado. </li></ol></li></ol> 4. Processamento de Dados e Análise <ol><li> Densitomï¿½rica Análise da mancha Intensities <ol><li> Digitalizar o filme em um scanner convencional e analisar as intensidades local por densitometria. Faça isso usando ImageJ (que é gratuito) ou um programa comercial. NOTA: Nós usamos o software Phoretix para esta tarefa. </li></ol></li><li> Normalização e Média dos resultados de diferentes membranas <ol><li> Conduzir as experiências de metilação péptido de matriz, pelo menos em triplicado. Normalizar as intensidades digitalizados para cada experimento por subtração de fundo e definindo a atividade em um substrato de referência como 1.0. Calcular a média dos dados para os pontos individuais e relatá-los como valores médios e desvios-padrão. </li></ol></li><li> Análise e visualização de dados <ol><li> Traçar os dados em 2D, utilizando um esquema de escala de cinza ou de cor para indicar a atividade relativa. Faça isso with Excel ou SigmaPlot imediata. Além disso, preparar um gráfico da distribuição dos desvios padrão das experiências repetidas para analisar a qualidade dos dados. </li><li> Para comparar e visualizar a exactidão do reconhecimento de cada resíduo no péptido substrato quantitativamente, calcular a preferência relativa do PKMT para cada aminoácido na posição x i por um factor de discriminação 16,17 D: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Onde v i é a taxa de metilação do péptido portador de variante de aminoácido na posição x i e &lt;v j ≠ i&gt; é a taxa média de metilação de todos os 19 péptidos que transportam um aminoácido diferente j ≠ i na posição x (incluindo o sequência de tipo selvagem). NOTA: O factor de discriminação definido por este depende do nível de fundo. Se apenas um resíduo é aceito em uma determinada posição com um fundo de 3%, a discriminaçãofator de 32,3 é obtido. Sem preferência numa posição resulta num factor de discriminação de 0. </li></ol></li></ol>

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	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Síntese SPOT como descrito aqui é um método poderoso para mapear sítios de interação proteína-proteína e investigar o reconhecimento do substrato de enzimas peptídicas modificando. No entanto, a síntese SPOT ainda apresenta certas desvantagens, porque apesar de os péptidos sintetizados pelo método SPOT são relatadas como tendo mais do que 90% de pureza 21 esta é difícil de confirmar, em cada caso. Portanto, os resultados têm de ser reproduzidas por outros métodos, por exemplo, o uso de domín...

Nas duas últimas décadas, vários relatórios demonstraram a importância de modificações pós-traducionais (PTM) de desenvolvimento celular e diversas doenças como o cancro, mas recentemente proteína lisina metilação tem emergido como um outro PTM vital. Embora inicialmente histona metilação lisina foi encontrado para ser um sinal essencial da cromatina, o trabalho mais tarde também mostraram lisina metilação de várias proteínas não histona 1-4. A transferência sequencial dos grupos metilo da S-adenosil-L-metionina para o grupo ε-amino de resíduos de lisina é catalisada por uma família de enzimas denominadas proteína Lisina metiltransferases (PKMTs) que contém mais de 60 proteínas no genoma humano. PKMTs foram inicialmente descoberto como histonas modificando enzimas que metilar resíduo de lisina específica, mas relatos posteriores demonstraram que eles também poderiam metilar proteínas não-histonas 5. Até agora, cerca de 5,000 locais de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas 6 </saté&gt;, mas as enzimas responsáveis ​​por estas modificações não são frequentemente identificados. Uma razão para isto é que a especificidade da maior parte das PKMTs não tem sido extensivamente estudada. Portanto, ocorre que recorrentemente novos substratos de PKMTs são descobertos. A falta de um conhecimento detalhado da especificidade de substrato de PKMTs dificulta a compreensão de sua função biológica e papel. Para estudar a especificidade de um PKMT em detalhe, as taxas de metilação de muitos substractos de péptidos que diferem em um ou poucos aminoácidos devem ser medidos e comparados, o que deve ser feito preferencialmente utilizando arrays de péptidos. Com base nos perfis de especificidade resultantes, os potenciais substratos de PKMTs pode ser identificado que pode ser mais estudada. Matrizes de péptidos são amplamente utilizadas ferramentas para a análise bioquímica de anticorpos, enzimas modificadoras de péptidos e o mapeamento dos locais de interacção proteína-proteína (antigénio-anticorpo, receptor-ligando) 7-9. Várias centenas de péptidos são necessários para such aplicações. Existem diferentes métodos para a síntese de péptidos, entre os quais o péptido na resina de síntese é muito usado, mas tem limitações no rendimento e é relativamente dispendioso. Esses problemas foram resolvidos com a introdução do método de síntese SPOT por Frank e seus colegas 10. O método de síntese permite a síntese de SPOT várias centenas de péptidos em paralelo e em média é barata em comparação com a síntese de resina. Os péptidos sintetizados em membrana de celulose pode ser usado, quer directamente para várias aplicações ou péptidos pode ser clivado a partir da membrana e usado como péptidos livres nos ensaios em solução ou para preparar micromatrizes de péptido 10-13. Síntese SPOT é uma variante da síntese de péptidos em fase sólida, o qual utiliza uma membrana de celulose como um suporte sólido e emprega a química padrão Fmoc-10-13. Assim, a síntese das cadeias de péptidos começa na extremidade C-terminal e prossegue em direcçãoa extremidade N-terminal, em contraste com a síntese biológica em ribossomas. Membranas de celulose são funcionalizados para a ligação do primeiro amino ácidos activados (Fig. 1). O método SPOT baseia-se na entrega sequencial de aminoácidos activados em uma gota de solvente para pontos definidos na membrana usando um sistema automático de pipetagem. A gota de líquido é distribuído sobre a membrana porosa, onde forma uma zona molhada circulares, que mais tarde actua como um reactor aberto para as reacções químicas na síntese de péptidos. O tamanho do ponto é determinado pelo volume dispensado e a capacidade de absorção da membrana, múltiplos de tais pontos estão dispostos como matrizes. A escala de síntese está correlacionada com o tamanho do local e a capacidade de carga da membrana. A distância entre os pontos e a densidade das matrizes são geridas através da variação dos tamanhos de ponto. Membrana de celulose tem várias vantagens como fase sólida em síntese de péptidos, que é barato, tolerante ao químicoals utilizados na síntese de peptídeos, estável em soluções aquosas e fácil de manusear. Além disso, a sua natureza hidrofilica a torna adequada para vários sistemas de ensaio biológicos. SPOT síntese pode ser realizada manualmente ou automatizada (para 1000 de peptídeos), dependendo do número necessário de péptidos. Um sintetizador SPOT totalmente automatizado de Intavis (Köln, Alemanha) é usado para as nossas aplicações. Ele permite a síntese de péptidos em quantidades diferentes e de comprimento diferente. Os péptidos lineares são regularmente sintetizado com um comprimento de ácido de 15 a 20 aminoácidos, em adição de péptidos até 42 aminoácidos podem também ser preparados por síntese passo a passo 14,15. No entanto, o aumento do número de aminoácidos leva a reduções nos rendimentos de acoplamento gerais, o que afecta a qualidade dos péptidos. Devido à baixa quantidade de péptidos por local, os produtos são frequentemente difíceis de purificar e a qualidade dos péptidos individuais não podem ser facilmente avaliadas. Portanto, os resultados obtidos a partir de SPOT Peptide matrizes devem ser confirmados quer com péptidos sintetizados através de métodos padrão em maior escala, que podem ser purificados e analisados ​​de acordo com as normas em síntese de péptidos ou por síntese de proteínas que contêm as sequências de péptidos desejados. Ainda assim, encontramos a síntese SPOT para ser altamente confiável e resulta geralmente ser reprodutível. SPOT síntese não é restrita a proteinogenic vários aminoácidos, aminoácidos modificados comercialmente disponíveis também podem ser utilizados para a síntese, permitindo que os péptidos a ser modificado antes e após a clivagem final do grupo de protecção da cadeia lateral e, além disso, também permite a incorporação de aminoácidos fosforilados, acetilados ou metilados 11. Bibliotecas peptídicas imobilizadas sintetizados pelo método seco pode ser utilizado directamente para muitos ensaios biológicos e bioquímicos. Nós empregamos matrizes péptido compreendendo 300-400 peptídeos para investigar a especificidade de substrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatião, os arrays de péptidos são incubadas com o respectivo PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet num tampão adequado. A metilação do respectivo substrato é analisada por após a transferência enzimática dos grupos metilo marcados radioactivamente de AdoMet para o substrato péptido através de auto-radiograf ia (Fig. 3). Por este procedimento, as matrizes peptídicos permite o estudo da metilação de diferentes substratos peptídicos, ao mesmo tempo. Uma vantagem importante deste método é que todos os péptidos são metilados em competição, de modo a que durante a fase linear da cinética de metilação, a metilação relativa de cada péptido é proporcional à constante de velocidade catalítica dividida pela constante de dissociação (k cat / K D) da enzima para o respectivo substrato péptido. Portanto, a quantidade de radioactividade incorporada dentro de cada local está directamente correlacionada com a actividade enzimática relativamente a péptido particular. Usando oresultados de uma experiência de metilação matriz péptido, o perfil de especificidade do PKMT pode ser definida e com base neste novos substratos podem ser baseiam. Matrizes de péptidos permite a validação rápida e eficiente custo da metilação de novos substratos para o nível de péptidos. Por isso, as matrizes são preparadas que contêm os novos substratos previstos em conjunto com os péptidos modificados contendo um Ala em vez de Lys nos locais-alvo, assim como péptidos de controlo positivos e negativos. Finalmente, os novos substratos podem ser preparados como proteínas, juntamente com os mutantes, em que o alvo é alterada Lys para Ala e a metilação pode ser confirmada ao nível da proteína. Dependendo dos resultados, este é então seguido por estudos biológicos referentes ao potencial papel da metilação dos substratos de proteínas recentemente descrita.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Piperidine &amp;ge;99% for Peptide Synthesis</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Dichlormethane &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Derivatized cellulose Membrane</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydrogen Carbonate</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxic, Flammable</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM high performance film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lisina metilação é uma modificação pós-tradução que emerge e tem sido identificado em várias proteínas de histonas e não-histonas, onde ele desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células e muitas doenças. Cerca de 5.000 sítios de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas, que são definidas por poucas dezenas de methyltransferases lisina proteína. Isto sugere que cada PKMT metila múltiplas proteínas, no entanto, até agora apenas um ou dois substratos foram identificados para várias destas enzimas. Analisa matriz peptídeo Para abordar este problema, nós introduzimos a especificidade do substrato base de PKMTs. Matrizes de péptidos são ferramentas poderosas para caracterizar a especificidade de PKMTs porque metilação de vários substratos com sequências diferentes podem ser analisadas numa matriz. Nós sintetizado matrizes peptídicas em membrana de celulose usando um sintetizador Intavis SPOT e analisou a especificidade de vários PKMTs. Com base nos resultados, para vários destes enzimas, romance substrates puderam ser identificados. Por exemplo, para NSD1 empregando matrizes de péptidos, que mostrou que metila K44 de H4 em vez do H4K20 relatados e em adição H1.5K168 é altamente preferido o substrato sobre o H3K36 anteriormente conhecido. Por isso, as matrizes de peptídeos são ferramentas poderosas para caracterizar bioquimicamente os PKMTs.

Matrizes de péptidos foram utilizados com sucesso para caracterizar bioquimicamente a especificidade de PKMTs, e foram identificados vários novel histonas e não-histonas substratos de PKMT por esta abordagem 5,16-19. Definindo o espectro substrato correta de um PKMT (ou qualquer enzima) é um passo essencial para a compreensão do seu mecanismo molecular e funções celulares. Como um exemplo da aplicação do método da matriz de metilação péptido SPOT, descrevem-se os resu...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K visualizações.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Bioquímica

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Imunologia e Infecção

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Preparação da Amostra e Quantitação Relativa usando Metilação Redutiva de Aminas para Estudos de Peptidômica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Biologia

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

Caracterização do Interactome do Lisossomo Neuronal com Proteômica de Marcação de Proximidade

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Neurociência

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantificação de Estoicometria de Acetilação e Succinilação de Lisinas Proteicas em Sítios Específicos Usando Espectrometria de Massa de Aquisição de Dados Independente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...