This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

펩타이드 배열 1. 준비 <ol><li> 펩타이드 시퀀스의 프로그래밍 <ol><li> MultiPep 정찰기 소프트웨어를 사용하여 합성 펩티드 서열을 디자인. 단일 문자 코드의 펩티드 서열을 입력합니다. 펩타이드 1 : TARKSTGGKA </li><li> 정의 된 기판의 인식에 필요한 중요한 아미노산을 화면에 특정 명령 (.replace, A)와 알라닌 또는 아르기닌 도보 라이브러리를 생성합니다. 다음 예에서 예를 들어 첫 번째 라인은 야생형 서열이고 두번째 행에서 각 펩타이드의 아미노산이 알라닌으로 순차적으로 변경된다. , 교체 TARKSTG -ARKSTG T- -RKSTG 맞대기 -KSTG 하는 표적 -STG TARK- -TG TARKS- -G TARKST- </li><li> 유사한 명령 (.replace의 R을 사용합니다.모든 천연 가능한 아미노산 잔기 (결국 시스테인, 메티오닌 및 트립토판을 생략 1.1.2에 기재된 바와 같이 이들 잔기 산화하는 경향이 때로는 낮은 합성 수율 때문에), N 등)를 교체 합의 판정 펩타이드 어레이를 합성 효소에 대한 기질 서열 모티브. 참고 :도 4a에 도시 된 바와 같이, 횡축은 소정의 단백질 서열을 나타내고, 세로축은 명령 선택된 아미노산을 나타낸다. 1.1.2에 도시 된 순서와 유사하게, 종축은 아라 순차적도 첫번째 행에 지정된 시퀀스의 각 위치를 대체한다는 것을 의미한다. 4A. 마찬가지로 순차적 아르기닌 등의 아미노산과 다른 상기 제 2 행에서 각 아미노산을 대체한다. 전체 어레이 펩티드 라이브러리는 체계적 번째의 각각 구비 펩티드 기질 서열 각 잔기를 대체함으로써 합성다른 예를 자연스럽게 사용할 아미노산 잔기, 이것은 주어진 시퀀스의 각 위치에서 각각의 잔기의 영향을 이해하는데 도움이 될 것이다. </li><li> 다르게는, 공지 또는 예측 된 펩티드 기질의 메틸화 용이 양성 및 음성 메틸화 컨트롤과 함께 PKMT의 표적 펩타이드 (메틸화에 공지되거나 메틸화이어야 공지 즉 펩티드) 펩티드 라이브러리를 합성 검증 될 수있다. 수동 프로그래밍에 의해 다음과 같이 대상 라이신의 메틸화를 확인하는 알라닌 추정 대상 라이신을 교환하여 펩타이드를 합성. 야생 형 펩타이드 : STGG K PRQFL 돌연변이 펩타이드 : STGG PRQFL 참고 :이 소프트웨어는 또한 상호 작용에 필요한 중요한 아미노산을지도 할 수있는 시퀀스의 원하는 프레임 시프트와 에피토프 매핑 같은 다양한 라이브러리를 만들 수있는 고유의 스크립트를 가지고있다. </li></ol></li><li> 멤브레인의 제조, 아미노산D 시약 <ol><li> 10 분 동안 DMF (N, N 디메틸 포름 아미드)의 SPOT 막 사전 팽창 한 후 기포 또는 주름없이 SPOT 합성 프레임에 젖은 막 배치합니다. </li><li> 막 100 % 에탄올로 3 회 세척 할 것. 합성 프로그램을 시작하기 전에 적어도 10 분 동안 완전히 막을 건조. </li><li> 이와 병행하여, 갓 NMP에 용해시킴으로써 이들을 시판의 Fmoc- 보호 된 아미노산의 농도는 0.5 M 작업을 준비하고, 표 1에 설명 된대로 활성제와 같은 염기를 준비한다. </li><li> SPOT 신디사이저의 모든 폐액 용기가 비워하고 있는지 확인하고, DMF, 에탄올, 피 페리 딘과 용매 저수지 리필. 참고 : 이제 기계는 합성을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 첫 번째 아미노산의이 보인다 <ol><li> 광고가 들어오는 아미노산 카르복시기를 활성화 멤브레인 자유 아미노기와 아미드 결합을 생성하려면딩 활성제 (N, N &#39;이소 프로필 카보 다이이 미드) 및 아미노산 유도체에 염기 용액 (하이드 록시 에틸 시아 노 아세테이트). </li><li> 프로그램 가능한 로봇을 이용한 PEG 아미노 관능 막 활성화 아미노산 원하는 볼륨 스팟. 주 : 이에 따라, 아미노산의 C 말단이 멤브레인의 아미노기에 결합된다. </li><li> 먼저 활성화 아미노산의 더 나은 커플 링을 보장하기 위해이 단계를 세 번 반복합니다. 비결 아미노산을 제거하는 DMF로 세척 한 다음 20 분 동안 막을 부화. </li></ol></li><li> 비 자리 분야에 무료 공간의 차단 주 : 막의 아미노기 모든 펩티드의 제 C 말단 아미노산의 커플 링 후 기미와 같은 스폿 영역 내에 아미노기의 일부 사이의 아미노기는 아미노산과 결합을 형성하지 않는다. <ol><li> 캐 용액으로 배양하여 이러한 자유 아미노기를 차단 (DMF 중 20 % 아세트산 무수물)5 분. 주 :이 막 대신 성장 펩티드 사슬과 상기 사이클로 아미노산의 커플 링을 방지한다. </li></ol></li><li> Fmoc 등 그룹의 제거 <ol><li> 블로킹 후, DMF로 4 회 세척 막을 다음의 Fmoc- 보호 그룹을 제거하기 위해 20 분 동안 DMF 20 % 피 페리 딘과 함께 배양한다. 참고 :이 단계는 아미노 보호 Fmoc 등 그룹의 제거에 이르게 그것은 탈 보호라고합니다. </li><li> 그 후, 에탄올로 두 번 DMF와 두 번 막 세척하고 건조 할 수 있습니다. 참고 : 이제 막 다음 아미노산의 결합에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 체인 신장 주 : 각 아미노산의 첨가주기라고한다. 이 외에 제 아미노산의 결합에서, 사이클은 결합 아미노산 및 Fmoc 기의 탈 보호와 함께 시작되고 그것은 증가 PEP의 아미노기 들어오는 아미노산의 활성화 된 카르복실기의 결합에 의해 이어진다조수 체인. <ol><li> 원하는 펩타이드 길이를 얻을 때까지 반복 1.3 및 1.5 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 염색 참고 : 최종주기 후, 펩타이드 배열이 펩타이드의 합성에 성공을 확인하는 브로 모 페놀 블루로 염색된다. 브로 모 페놀 블루는 펩티드의 자유 아미노기와 결합한다. 펩타이드 반점은 염색 후 밝은 파란색 색상을 표시하지만, 반점의 강도는 펩타이드 서열에 따라 달라집니다. 이 얼룩은 펩티드를 얼룩하지 않기 때문에 피 페리 딘 브로 모 페놀 블루의 존재, 피 페리 딘의 완전한 제거의 확인을 할 수 있습니다. 또한, 이것은 또한 나중에 사용할 펩티드 배열을 표시 돕는다. <ol><li> 마지막 합성 사이클 기의 Fmoc- 탈 보호 한 후, DMF, 100 % 에탄올로 막 세척 하였다. 완전히 청색으로 변할 때까지 그 다음, 5 분 이상 동안 브로 모 페놀 블루 (DMF 0.02 % 브로 모 페놀 블루)과 멤브레인을 치료. </li><li> 이후, DMF 및 ETH으로 막을 세척anol 10 분 동안 건조 하였다. 이제 신디사이저에서 막 꺼내 수동 사이드 체인 탈 보호 (1.8 절)을 수행합니다. 필요한 경우, 펩티드 합성 (도. 2)의 결과를 문서화하기 막을 사진. </li></ol></li><li> 사이드 체인 탈 보호 <ol><li> 측쇄 보호 그룹 및 소제 시약 (2.5 %의 물과 2.5 % 트리 이소 프로필 실란)에서 아미노산의 측쇄를 보호를 절단하기 위해 95 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)로 이루어지는 측쇄 탈 보호 혼합물의 20 ~ 25 ml로 멤브레인 치료 이 단계에서 수정. 완전히 밀폐 된 화학 물질 상자에서 막 다루고 있는지, 부드럽게 흔들어 섞으면 서 1 ~ 2 시간 동안 그것을 부화 탈 보호 혼합물의 충분한 볼륨을 가져 가라. </li><li> 2 분마다 DCM (디클로로 메탄)의 20 ~ 25 mL로 막 여섯 번 씻고 마지막으로 두 번 100 % 에탄올로 밤새 데시 케이 터 (실리카겔). 참고 : 지금멤브레인은 실험에 사용될 수있다. 펩티드 합성의 배열 방식은도 1에 제공된다. </li></ol></li></ol> 2. 단백질 발현 및 정제 <ol><li> GST의 용해 등 PKMTs의 단백질 발현 <ol><li> 표준 기술을 사용하여, GST 융합 단백질로서 표현 된 전체 길이 또는 PKMT (유전자 pGEX-6P2 등) 세균성 발현 벡터에의 촉매 도메인을 코딩하는 유전자를 복제. </li><li> BL21 또는 BL21 코돈 플러스 E.에 삽입 원하는 PKMT와 벡터로 이동 열 충격 방법 또는 다른 방법에 의해 대장균 세포. </li><li> 식 당일 루리아 - 베르 타니 (LB) 미디어 30㎖를 함께 예비 배양을 준비하고 연속 진탕 7-8 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 다음에, LB 미디어 L 함유 한 2 L 플라스크에 큰 배플 예비 배양 10 ㎖ 옮기고 37 ℃에서 부화 문화 도달 할 때까지 연속 진탕 배양기에서 ° C600 nm에서 광학 밀도 정의 ES. 주 : 이것은 각각의 단백질에 대해 최적화 될 수 있지만, 우리는 일상적으로 약 0.8의 OD를 600 ㎚에서 유도한다. 유도 온도가 개별적으로 각각의 단백질에 대해 최적화 될 수 있고, 어떤 단백질은 식 (22)에서 잘 보여 ° C 이상 온도에서 몇 가지. </li><li> 다음 이소 프로필 - 베타 - D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 1 mm의 유도, 15 분 동안 온도를 유도하고 세포 시프트가 유도 배양 온도에서 10-12 시간 동안 성장하는 것을 허용한다. </li><li> 이후 15 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확하고 마지막으로 추가의 사용을 위해 -20 ℃에서 STE 완충액 (10 mM 트리스 pH가 8.0, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA) 및 저장소 30 ml로 펠렛을 세척 하였다. </li></ol></li><li> 단백질 정제 <ol><li> 세포 펠렛을 해동하고 초음파 처리 완충액 (50 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤)의 30 ㎖에 재현 탁하고 초음파 처리에 의해 붕괴. 참고 :이 버퍼 Needs 결국 각각의 단백질을 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 1 시간 동안 22,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리, 나중에 상등액을 수집하여 글루타티온 세파 로즈 4B 수지의 600 μl를 함유하는 컬럼을 통해 통과한다. </li><li> 50 초음파 버퍼 ㎖의 높은 소금 버퍼 (7.5 50 mM 트리스 산도, 500 mM의 염화나트륨, 1 mM의 DTT 5 % 글리세롤) 비특이적 결합 단백질을 제거하는 100 ㎖와 다음에 열을 씻으십시오. 40 mM의 글루타치온을 함유하는 높은 염 완충액 5 ml로 결합 단백질을 용출시켰다. </li><li> 낮은 글리세롤 (20 mM 트리스의 pH 7.4, 100 mM의 KCl을, 0.5 mM의 DTT, 10 % 글리세롤)의 pH 7.4을 2 시간 이상하는 20 mM 트리스, 100 mM의 KCl을, 0.5 mm의 투석 버퍼의 2 L에 용출 된 단백질을 투석 DTT 70 % 글리세롤 8 시간 또는 하룻​​밤. 모든 정화 버퍼가 4 ° C에 있는지 확인하고 단백질 변성을 방지하기 위해 추운 방에서 단백질 정제를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 3. 펩타이드 배열 메틸화 <ol><li> 사전 incu펩타이드 배열의 bation <ol><li> 효소와 고가의 방사능 표지 AdoMet의 낭비를 방지하기 위해 적절한 크기의 상자 또는 비닐 봉투에 하나 펩타이드 배열 메틸화를 수행합니다. 10 분 동안 효소없이 각각의 메틸화 버퍼를 포함하는 밀봉 된 비닐 봉지에 펩티드 배열 멤브레인과 표지 [메틸 3H] -AdoMet 사전 품어. 예 전체 특이성 프로파일 펩타이드 어레이 메틸화 완충액 8ml의 사용을위한 버퍼의 부피는, 어레이의 크기에 의존한다. 각 효소의 양 및 AdoMet의 농도를 최적화 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 펩타이드 배열의 메틸화 <ol><li> 사전 배양 버퍼를 취소하고 각각의 PKMT를 포함 메틸화 버퍼의 8 ml의에서 막 부화 및 표시 [메틸 3H] -AdoMet 1 시간 2를위한. 주 : 메틸화 반응에 필요한 효소의 양이 특정 PKMT의 활성에 의존 우리 스크리닝 실험은 50 nM의 효소 지느러미 개시 전형적Al 농도. </li></ol></li><li> 펩타이드 배열의 세척 <ol><li> 이후 방사성 폐기물 컨테이너 메틸화 버퍼를 폐기하고 결합 된 단백질을 제거하기 위해 5 분 동안 100 mM의 중탄산 암모늄 및 1 % SDS를 함유하는 완충액 20 ml로 5 회 펩타이드 어레이를 세척 하였다. 방사성 폐기물 용기의 세척 버퍼를 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 방사성 신호의 검출 <ol><li> 세척 후 증폭 용액 (NAMP100V) 10ml에 5 분 동안 막을 배양한다. </li><li> 그런 다음, 유기 용매에 대한 방사성 폐기물 용기로 증폭 솔루션을 폐기 플라스틱 가방에 펩타이드 배열을 봉인하고 오토 라디오 카세트에 넣어. </li><li> 어두운 방에 펩타이드 배열의자가 방사선 필름을 놓습니다. 신중하게 카세트를 닫고에 노출 -80 필요한 시간 C를 °. 그 다음, 결과를 분석하기 위해 필름을 개발한다. 다른 expositio와 시대의 이미지 몇 캡처n 번 강력하게 메틸화 펩타이드 기질의 포화를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 처리 및 분석 <ol><li> 스팟 강렬의 농도계 분석 <ol><li> 기존의 스캐너에 필름을 스캔 농도계에 의해 현물 강도를 분석 할 수 있습니다. (프리웨어)이 사용 ImageJ에 또는 상용 프로그램을 수행합니다. 참고 : 우리는이 작업을 위해 Phoretix 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol></li><li> 정규화 및 다른 점막의 결과의 평균화 <ol><li> 중으로 적어도 펩타이드 어레이 메틸화 실험을. 1.0과 같은 기준 기판에 배경 차감 및 활성을 설정하여 각 실험에 대한 강도를 정규화 스캔. 각 지점의 데이터를 평균 그들에게로 평균값과 표준 편차를보고합니다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 및 디스플레이 <ol><li> 상대 활성을 나타내도록 그레이 스케일 또는 컬러 방식을 사용하여 2 차원의 데이터를 플롯. 이 위스콘신 수행일 Excel 또는 Sigmaplot은 다음과 같이. 또한, 데이터의 품질을 분석하는 실험을 반복의 표준 편차의 분포의 플롯을 준비한다. </li><li> 정량적 비교 기질 펩티드에서 각 잔기의 인식의 정확도를 표시하려면, 판정 계수 D (16, 17)에 의해 위치 (x)에서의 각 아미노산에 대한 I PKMT의 상대적인 우선 순위를 계산한다 : D의 X, I = &lt;V의 J ≠ 전&gt; / V I - 1 V (I)이 위치 (x)와 AT 아미노산 I 운반 펩타이드 변이체의 메틸화 비율 임 &lt;브이 j는 ≠ 난&gt; 포함한 위치 x에서 다른 아미노산 J ≠ I 들고 19 ​​개의 펩티드의 메틸화의 평균 속도 (인 야생형 서열). 참고 :이에 의해 정의 된 차별 요소는 배경 수준에 따라 달라집니다. 하나만 잔류 3 %의 배경, 차별 특정 위치에서 승인되면32.3의 인자를 얻을 수있다. 위치에서 어떤 환경 설정은 0의 차별 요인을 초래하지 않습니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

여기에 설명 된대로 합성 SPOT 단백질 - 단백질 상호 작용 부위를 맵핑하고 수정 펩티드 효소 기질 인식을 조사 할 수있는 강력한 방법이다. SPOT 방법에 의해 합성 된 펩타이드가이 각 인스턴스에서 확인하기 어려운 90 % 이상의 순도 21 것으로보고되었지만 때문에 SPOT 합성은 아직 특정 단점을 갖는다. 따라서, 결과는 예를 이용한 단백질 또는 도메인에 대한 표준 방법에 의해 합성, 정제 된 ?...

지난 20 년 동안, 여러 보고서는 세포 개발 및 암 등 여러 질병,하지만 최근에 단백질 리신 메틸화는 또 다른 중요한 PTM로 떠오르고있다에서 번역 후 변형 (PTM)의 중요성을 보여 주었다. 초기 히스톤 메틸화 라이신 필수적인 염색질 마크 것으로 확인되었지만, 이후의 작업은 여러 비 - 히스톤 단백질 1-4 리신 메틸화 하였다. 리신 잔기의 ε - 아미노기에 S-L 아데노 실 메티오닌의 메틸 기의 순차적 인 전송은 인간 게놈에서 60 개 이상의 단백질을 포함 리신 단백질 Methyltransferases (PKMTs)라는 효소 패밀리에 의하여 촉매된다. PKMTs 처음 특정 라이신 잔기 메틸화 나중에보고들은 또한 비 - 히스톤 단백질 5 메틸화 수 있다고 입증 히스톤 변형 효소로 발견되었다. 지금까지 약 5,000 라이신 메틸화 다른 단백질 6에 확인 된 </s최대&gt;하지만, 이러한 수정에 대한 책임이있는 효소는 종종 식별되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 가장 PKMTs의 특이성이 광범위하게 연구되어 있지 않은 점이다. 따라서, 반복적으로 PKMTs 신규 기질이 발견되어 발생한다. PKMTs의 기질 특이성의 상세한 지식의 결여는 그들의 생물학적 기능 및 역할에 대한 이해를 방해한다. 상세 PKMT의 특이성을 연구하는 하나 또는 몇 개의 아미노산이 다를 많은 펩티드 기질의 메틸화 속도는 측정해야 이상적 펩타이드 어레이를 사용하여 수행되는, 비교. 얻어진 특이성 프로파일에 기초하여, 잠재적 PKMTs 기판은 더 연구 될 수있는 식별 될 수있다. 펩타이드 어레이 널리 항체, 펩티드 변형 효소 단백질 - 단백질 상호 작용 부위 (항체 - 항원, 수용체 - 리간드) 7-9의 맵핑의 생화학 적 분석을위한 도구를 사용한다. 펩타이드 수백는 SUC에 필요한시간 응용 프로그램. 다른 방법들이 매우 일반적으로 사용되는 수지를 합성 펩타이드 중, 펩티드 합성에 사용할 수 있지만, 스루풋에 한계를 가지고 있으며, 이것은 상대적으로 고가이다. 이러한 문제는 프랭크와 동료 (10)에 의해 SPOT 합성 방법의 도입으로 해결이되었습니다. SPOT 합성법 병렬 수백 펩티드의 합성이 가능하며 평균 그것은 합성 수지에 비해 저렴하다. 셀룰로오스 막에 합성 된 펩타이드는 막에서 절단 및 솔루션 분석에서 무료 펩타이드로 사용 또는 펩티드 마이크로 어레이 10-13을 준비 할 수있는 다양한 응용 프로그램 또는 펩티드 직접 사용할 수 있습니다. SPOT 합성은 고체 지지체로서 셀룰로오스 멤브레인을 사용하며, 표준의 Fmoc- 화학을 채용 10-13 고상 펩티드 합성의 변형이다. 따라서, 펩타이드의 합성은 C 말단에서 시작 향해 진행리보솜에서 합성 생물학적 대조적 N 말단. 셀룰로오스 막은 먼저 활성화 아미노산 (도. 1)의 부착을 위해 관능 화된다. SPOT 방법은 자동 피펫 팅 장치를 이용하여 막에 정의 명소 용매 액적 활성 아미노산의 순차 전달에 기초한다. 액체의 방울은 나중에 펩타이드 합성 화학 반응을위한 오픈 반응기 역할을하는 원형 젖은 자리를 형성하는 다공성 막에 분배된다. 스폿 사이즈가 분배 용적과 멤브레인의 흡수력에 의해 결정되고, 예컨대 스폿의 배수로는 어레이로 배열된다. 합성 스케일 스폿 사이즈와 막의 적재량과 상관을 갖게 할 수있다. 스폿 및 배열 밀도 사이의 거리는 스팟의 크기를 변경함으로써 관리된다. 셀룰로오스 멤브레인 펩티드 합성 고상 같은 여러 가지 장점을 가지고, 그것은 Chemic의 행 저렴 관대수용액에서 안정하고 취급이 용이 한 펩타이드 합성에 사용 ALS. 또한, 친수성 ​​성질은 여러 생물학적 분석 시스템들에도 적합하다. SPOT 합성은 수동으로 수행하거나 필요한 펩티드의 수에 따라 (펩티드에 대한 1000) 자동화 될 수있다. Intavis (쾰른, 독일)에서 완전 자동화 SPOT 합성기는 우리의 응용 프로그램에 사용됩니다. 그것은 다른 양의 서로 다른 길이의 펩티드의 합성을 허용합니다. 또한 단계적 합성 (14,15)에 의해 제조 될 수있는 선형 펩티드는 규칙적 42 아미노산 펩타이드의 첨가에, 15 ~ 20 개의 아미노산 길이로 합성된다. 그러나, 아미노산의 수를 증가시키는 것은 펩티드의 품질에 영향을 전체 결합 수율의 감소를 이끈다. 이 때문에 스폿 당 펩티드의 낮은 양 때문에, 제품은 종종 정제하기 어려운 개별 펩티드의 품질을 용이하게 평가할 수 없다. 따라서 결과의 SPOT pept로부터 얻어진IDE 어레이 정제 펩티드 합성 또는 원하는 펩티드 서열을 함유하는 단백질을 합성 기준에 따라 분석 될 수있는보다 큰 규모의 표준 방법에 의해 합성 된 펩타이드 중 하나를 확인해야한다. 아직도, 우리는 매우 신뢰할 수 SPOT 합성을 발견하고 재현 할 수 일반적으로 발생합니다. SPOT 합성은 펩티드 전과 또한 최종 측쇄 보호 그룹의 절단하고, 이후에 변형 될 수 있도록, 아미노산, 또한 합성에 사용할 수있는 몇 가지 시판 변성 아미노산 proteinogenic에만 제한되지 않으며 또한 혼입 허용 인산화 메틸화 또는 아세틸 아미노산 (11). SPOT의 고정화 방법으로 합성 펩티드 라이브러리는 직접 많은 생물학적 및 생화학 적 분석에 사용될 수있다. 우리 PKMTs의 기질 특이성을 조사하기 위해 300-400 펩타이드를 포함하는 펩티드 배열을 채용. 효소 후 변형의 경우양이온, 펩티드 배열은 각 PKMT 함께 인큐베이션하고 적절한 완충액 [메틸 3 H] -AdoMet 표지. 각 기판의 메틸화는 오토 라디오 그래피를 통해 펩티드 기질에 AdoMet에서 방사성 표지 된 메틸기의 전사 효소 (도이. 3)에 따라 분석한다. 이 절차에 의해, 펩티드 배열은 동시에 두 펩티드 기질의 메틸화 연구를 허용한다. 이 방법의 한가지 중요한 이점은 모든 펩티드 메틸화 반응 속도의 선형 단계에서, 각각의 펩티드의 상대적인 메틸화가 해리 상수 (K 고양이 / K로 나눈 촉매 속도 상수에 비례 같은 것을, 대회에서 메틸화된다는 것이다 각 펩티드 기질에 대한 효소의 D). 따라서, 각각의 스폿에 혼입 된 방사능의 양을 직접 향해 특정 펩티드의 효소 활성과 관련된다. 사용펩타이드 어레이 메틸화 실험의 결과는, PKMT의 특이성 프로파일은 예견 할 수있는이 새로운 기판에 정의하고 기초 할 수있다. 펩타이드 어레이 펩타이드 수준에서 신규 기판의 메틸화 신속하고 비용 효율적 검증을 허용한다. 이를 위해, 어레이는 표적 부위에서의 라이신 대신 아라 펩타이드를 함유하는 개질뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군 펩티드와 함께 예측 된 신규 한 기판을 포함하는 것이 제조된다. 마지막으로, 신규 한 기판은 돌연변이 체와 함께 단백질되는 대상의 Ala가 라이신으로 변경되고, 메틸화 단백질 레벨에서 확인할 수있는 바와 같이 제조 될 수있다. 결과에 따라,이 후, 새롭게 기재된 단백질 기질의 메틸화의 잠재적 역할을 어드레싱 생물학적 연구에 의해 이어진다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

라이신 메틸화는 신흥 포스트 번역 수정하고이 세포 개발 및 많은 질병에서 중요한 역할을 담당 곳에는 여러 히스톤과 비 히스톤 단백질에 발견되었습니다. 약 5,000 라이신 메틸화 단백질 라이신 methyltransferases의 몇 수십 설정되어 다른 단백질에 확인되었다. 이제이 하나 또는 두 개의 기판이 효소의 여러 가지에 대해 확인 된 그러나까지, 각 PKMT 여러 단백질의 메틸하는 것이 좋습니다. 이 문제에 접근하기 위해, 우리가 도입 펩타이드 어레이 기반의 기질 특이성은 PKMTs 분석. 펩타이드 배열은 서로 다른 시퀀스가​​ 여러 기판의 메틸화가 하나의 어레이 테스트 할 수 있기 때문에 PKMTs의 특이성을 특성화 할 수있는 강력한 도구입니다. 우리는 Intavis SPOT 신디사이저를 사용하여 셀룰로오스 막에 펩타이드 배열을 합성 및 다양한 PKMTs의 특이성을 분석 하였다. 이들 효소의 여러 위해, 결과에 기초하여, 신규 Substrates를 식별 할 수 있습니다. 예를 들어, 펩타이드 어레이를 사용함으로써 NSD1 위해, 우리는 H4의 K44 대신보고를 H4K20의 메틸과 더불어 H1.5K168은 이미 공지 H3K36 위에 매우 바람직한 기판 인 것으로 나타났다. 따라서, 펩타이드 배열은 생화학 PKMTs의 특성을 할 수있는 강력한 도구입니다.

이 방법에 의해 펩티드 5,16-19 어레이 성공적 생화학 PKMTs의 특이성을 특성화하는 데 사용하고, PKMT 여러 신규 한 히스톤 및 비 히스톤 기질의 동정을 행 하였다. PKMT (또는 효소)의 올바른 기판 스펙트럼을 정의하는 분자 메커니즘과 세포 기능의 이해를 향한 중요한 단계입니다. 펩티드 SPOT 어레이 메틸화 방법의 적용 예로서, 우리는 (19)의 NSD1 PKMT 특이성 분석 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays at JoVE.com

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K 조회수.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

비디오: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 &quot;을 안전 잡아라&quot;사용

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

의 단백질 단지의 식별

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 "을 안전 잡아라"사용

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

의 단백질 단지의 식별

기능화 비스 - 펩타이드의 고상 합성은 방법론 "을 안전 잡아라"사용

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석