Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.

NOTA: Este protocolo fue revisado y aprobado por la Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. 1. Preparación de la solución de Krebs modificada y Prueba de la Droga alícuotas <ol><li> Hacer 6 L de solución de Krebs modificada que contiene (en mM): NaCl 117,9, KCl 4,7, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 2.5 CaCl 2, 11,1 D-glucosa, butirato de 2 de sodio, acetato de sodio 20 , 0.004 nifedipina (para bloquear las contracciones musculares espontáneas), y 0,003 de indometacina (para bloquear la síntesis de prostaglandinas endógenas). Utilice soluciones de Krebs hielo frío y caliente para la disección de tejidos y la grabación de una sola fibra, respectivamente. </li><li> Preparar las soluciones químicas (por ejemplo, IS, la capsaicina, ATP) en alícuotas a concentraciones deseadas. </li></ol> 2. La disección del nervio del tejido colorrectal- <ol><li> Anestesiar y eutanasia ratones machos (6-8 semanas de edad, 20 - 30 g) enuna cámara de CO 2 a un caudal que desplaza 10 a 30% de volumen de la cámara por minuto hasta que los ratones deje de respirar por completo como se indica por la ausencia de movimiento del pecho. </li><li> Inmediatamente después de la eutanasia, Exsanguinate cortando abierta la cámara torácica, perforando la aurícula derecha, y sumergir el cadáver del ratón en un amplio volumen (~ 500 ml) de helado de Krebs (4 ° C) solución burbujea con carbógeno (95% de O2 , 5% de CO 2). </li><li> Retire con cuidado todas las vísceras, pero los órganos de colon y de la pelvis. Transecto el ratón en un medio a través del segmento vertebral T12 ligeramente por encima del diafragma torácico y transferir la mitad caudal a una cámara de disección que contiene hielo frío, burbujear solución de Krebs. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, retire la vejiga y los órganos reproductivos por transección en sus uniones a la uretra, y retire la descendente / aorta abdominal hasta que se bifurca en las arterias ilíacas comunes. Libertad para los PN o el LSN de su surrounding tejidos mediante disección roma y seguir el nervio desde fuera de la cresta ilíaca hasta su punto de entrada ventral en la L6 y S1 columna vertebral (por PN) o T13 y L1 columna vertebral (por LSN). </li><li> Cortar la sínfisis púbica y la derecha y articulaciones acetábulo izquierdo, y quitar el hueso ilíaco. Con cuidado, libre ya sea el PN o LSN de los músculos adheridos y tejido conectivo de cerca del colon y recto hasta donde el nervio entra en la columna vertebral. </li><li> Resecar con cuidado el hueso ilíaco para exponer el colon y recto distal. Diseccionar el colon y recto distal con el PN adjunto o LSN en continuo. </li><li> Transferir el colon y recto con el nervio unido al compartimento de baño de la cámara de tejido. Quitar el tejido conectivo excesivo por más de disección, y abrir el colon y recto longitudinalmente a lo largo de la frontera anti-mesentérica. </li><li> Con el lado de la mucosa hacia arriba, el pin del borde mesentérico del colon y recto junto al compartimento de registro en la base de silicona de la chamber y adjuntar la longitud del colon y recto antimesenteric a un rastrillo de ganchos conectados a un accionador de fuerza (ilustrado en la Figura 1 y se fotografió en la Figura 2A). </li><li> Extender el PN o LSN en el compartimento de la grabación, que está conectada al compartimiento de baño por un agujero del ratón y la puerta. Coloque suavemente el tronco nervioso a un pequeño espejo de cristal en el compartimiento de la grabación, lo que proporciona una superficie hidrófila para el nervio que adherirse. Superfuse el compartimiento de baño con agua caliente (30-32 ° C), solución de Krebs oxigenada y llenar el compartimento de grabación con aceite mineral. </li></ol> 3. sola fibra de grabación y localización del campo receptivo <ol><li> Retire con cuidado la espalda epineurio (vaina nerviosa) de la PN o LSN bajo el microscopio estereoscópico a gran aumento (50 - 60X). Con unas pinzas finas, se burlan del tronco nervioso en 5-8 haces nerviosos de ~ 100 micras de espesor. </li><li> Coloque la referencia de platino-iridioelectrodo en contacto con la solución de Krebs en la cámara de tejido. Colocar secuencialmente los haces de nervios individuales en el electrodo de registro hecha del mismo material. </li><li> Utilice un pincel suave para evocar APs de los aferentes colorrectales por acariciar suavemente hacia arriba y abajo de la superficie colorrectal. Busque el paquete (s) de nervios que inervan el colon a través de AP detectable (potencial de acción) grabaciones. NOTA: La PN y LSN también inervan la vejiga urinaria y otros órganos pélvicos. </li><li> Use un par de 30 puntas de las agujas G para dividir aún más el conjunto de nervios en filamentos finos fascículos de ~ 10 micras de espesor y colocar un filamento individual sobre el electrodo de registro. </li><li> Coloque el electrodo concéntrico de punta redonda perpendicular a la superficie de la mucosa para excitar eléctricamente terminaciones aferentes en la intensidad del estímulo por encima del umbral (10 mA magnitud, 0,5 mseg de duración @ 0,3 Hz), que produce un radio ~ 2 mm de propagación actual. Mueva el electrodo de forma sistemática (~ 1,5 mm pasos) A lo largo de la longitud y la anchura del colon y recto aplanado para localizar terminaciones receptivas. </li><li> Cuando se excita un final aferente, ajuste la posición del electrodo para localizar el sitio de activación (campo receptivo, RF) que requiere la intensidad del estímulo mínimo (umbral de estímulo). Deseche terminaciones con un umbral de estímulo&gt; 3 mA 19. </li><li> Calcular la velocidad de conducción (CV) a partir de 1) la distancia entre el electrodo de estimulación en el campo receptivo (RF) y el sitio de grabación y 2) el retraso de la conducción (por ejemplo, la Figura 2B) entre el artefacto del estímulo y el inicio del potencial de acción . CV (m / seg) = distancia (mm) / retraso de la conducción (ms). </li></ol> 4. Clasificación Funcional de mechanosensitive colorrectales Aferentes <ol><li> Después de localizar una RF mediante la estimulación eléctrica, aplique los tres estímulos mecánicos siguientes a la RF: <ol><li> Llevar a cabo el estímulo sondeo presionando la punta de una calibraciónmonofilamento ted von Frey-como el nylon (0,4 y 1 g fuerza) perpendicularmente hacia la RF en el colon y recto aplanada. </li><li> Llevar a cabo el estímulo acariciando por acariciar suavemente la mucosa colorrectal con un filamento de nylon fino (10 mg fuerza) para generar una pequeña tensión de corte superficial en la RF. </li><li> Realizar el tramo circunferencial utilizando una fuerza de accionamiento controlado por ordenador, que proporciona una fuerza de estiramiento en rampa (0-170 MN en 5 mN / seg) en dirección circunferencial a lo largo del borde anti-mesentérico del colon y recto a través de la comisión de ganchos que se describen en el paso 2.8 . </li></ol></li><li> Clasificar los aferentes como serosa (responder sólo a despuntar sondeo), la mucosa (responder a la mucosa acariciando y embotar sondeo), muscular (responder a tramo circunferencial y embotar sondeo) musculoso / mucosa (responder a tramo circunferencial, acariciando la mucosa y embotar sondeo), o MIA (no sensible a cualquiera de los tres estímulos mecánicos). </li><li> Para aferentes mesentéricas (sólo enla inervación LSN) que son difíciles de activar selectivamente mediante estimulación eléctrica, localizar sus terminaciones receptivas por caricias mecánica / sondeo del mesenterio. </li><li> Para aferentes sensibles al estiramiento (muscular y músculo-mucosas), determinar el umbral de respuesta, que se define como la fuerza que evoca la primera AP durante tramo en rampa. </li><li> Para los aferentes serosas, grabar sus respuestas a ascendiendo niveles de puntiforme de sondeo del campo receptivo impulsado por la fuerza del actuador controlado por ordenador. </li></ol> 5. Aplicación Química / Modulación de Endings Receptivo <ol><li> Grabar una respuesta de línea de base a un estímulo mecánico (es decir, la respuesta al tramo en rampa, punteada de sondeo, o acariciando la mucosa). </li><li> Escudo del borde inferior de un trozo de tubo (latón o acero inoxidable, 10 mm de alto y 4 x 4 mm 2 plaza o 4-5 mm de diámetro) con vaselina y colóquelo sobre el campo receptivo en el colon y recto. </li><li> Quitarla solución de Krebs dentro de la tubería, y exponer el final receptivo durante 3 - 5 min a 170 l de la solución que contiene la sustancia química (s) a ensayar. </li><li> Monitorear la respuesta de la aferente durante la aplicación química (algunas aferentes son quimiosensible). </li><li> Retire la solución química y la tubería para finalizar la operación de la sustancia química. Dentro de 4 - 6 min, probar la respuesta aferente al mismo estímulo mecánico como en la respuesta de línea base. </li><li> Volver a aplicar el estímulo mecánico de nuevo después de un período suficiente de wash-out (&gt; 15 min). </li></ol> 6. picos de grabación y Discriminar AP <ol><li> Digitalizar las señales eléctricas registradas de axones a 20 kHz y guardar los datos en una computadora. Monitorizar la señal en línea por un monitor de audio. </li><li> Analizar los picos de AP fuera de línea y discriminar unidades individuales basados ​​en el análisis de componentes principales de las formas de onda de pico individuales 25. NOTA: Un registro no debe contener más ésimoun dos unidades activas fácilmente discernibles. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El vitro preparación colon y recto-nervio en descrito aquí ha demostrado ser un poderoso enfoque para estudiar las funciones de codificación neural de aferentes colorrectales individuales, que complementa muy bien con otros métodos no funcionales (por ejemplo, estudios celulares, moleculares e histológicos) sobre las neuronas sensoriales viscerales ( ver el comentario 27 para más detalles). Mecanismos neuronales que contribuyen a la nocicepción y la hipersensibilidad colorrec...

El dolor y la hipersensibilidad son las quejas predominantes de pacientes que sufren de trastornos gastrointestinales funcionales, incluyendo el síndrome del intestino irritable (IBS), que existen en la ausencia de causa patobiológico aparente o daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con SII presentan hipersensibilidad, incluyendo las respuestas aumentadas a la distensión rectal globo y aumento de la sensibilidad durante la función normal del intestino, así como hipersensibilidad de referencia somáticas (es decir, sensibilidad a la palpación de la zona abdominal) 1. Debido a la orientación aferentes colorrectal ha demostrado ser eficaz en el alivio de dolor e hipersensibilidad en los pacientes con SII (por ejemplo, la instilación intra-rectal de los anestésicos locales 2,3; ingestión oral de la guanilato ciclasa C agonista linaclotide 4-6), la mejora de la comprensión de la inervación aferente del colon y recto es importante. Aferentes viscerales aferentes, incluyendo colorrectal, Son capaces de responder a las modalidades químicas / en nutrientes y térmicos (por ejemplo, 7-9). Sin embargo, los aferentes viscerales que responden a estímulos mecánicos (es decir, aferentes mechanosensitive) han sido el más estudiado, porque los estímulos mecánicos (por ejemplo, distensión luminal, estrías) son los que generalmente dan lugar a sensaciones conscientes, incluyendo malestar y dolor 10-16. Además, las vísceras también están inervadas por fibras aferentes mecánicamente insensibles (MIAs), comúnmente denominadas nociceptores silenciosos o para dormir 17. En condiciones fisiológicas normales, MIAs no responden a la estimulación mecánica o tienen muy alta respuesta umbrales de 18, pero pueden llegar a ser activa y adquirir mechanosensitivity en condiciones fisiopatológicas y contribuir a la hipersensibilidad. Uso de la preparación in vitro y el protocolo descrito aquí, hemos desarrollado y empleamos una estrategia de estímulo eléctrico al mar<html> RCH para terminaciones receptivo, que permitan identificar imparcial de ambas terminaciones mechanosensitive y MIA en el colon y recto 19. La inervación colorrectal se deriva de esplácnico lumbar (LSN) y el nervio pélvico (PN) itinerarios, e incluye los aferentes colorrectal que se pueden clasificar en cinco clases mechanosensitive (serosa, mucosa, muscular, músculo-mucoso, mesentéricos) y una clase MIA 20. Usando esta preparación in vitro, se encontró que MIAs colorrectales mechanosensitivity adquirida (sensibilizar) siguiente breve exposición de sus campos receptivos a una sopa inflamatoria (IS), que sensibiliza 71% de MIAs en la vía de PN y 23% de MIAs en la vía LSN 19. También documentamos sensibilización a largo plazo (hasta 28 días) de los desaparecidos en acción en el contexto de larga duración hipersensibilidad visceral comportamiento (es decir, en los ratones que recibieron tratamientos intracolónicas con zymosan 21 o ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; Entre los aferentes mechanosensitive, aferentes musculares y músculo-mucosas son las únicas clases que tónicamente codifican tramo circunferencial del colon y recto (es decir, son sensibles al estiramiento) y estar al servicio de la codificación de la distensión colorrectal nociva 23,24. El uso de un controlado por ordenador la fuerza del actuador, se aplicó un estándar, homogéneo, y el estiramiento en rampa reproducible en la dirección circunferencial del tejido colorrectal aplanada y clasifican además aferentes sensibles al estiramiento como de bajo umbral y de alto umbral 23. Además, el curso temporal de la sensibilización de estiramiento aferentes -sensibles después zimosan intracolónica 21 o 22 TNBS tratamiento corresponde a la aparición, persistencia y / o recuperación de la hipersensibilidad visceral de comportamiento, lo que sugiere un papel de los aferentes colorrectales sensibles al estiramiento en el dolor visceral e hipersensibilidad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1173">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:291px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:372px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica MZ16 stereo microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica IC D camera</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td>World Precision instruments, Inc.</td>
			<td>SYS-DAM80&#160;</td>
			<td>Low-noise differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Two-compartment tissue chamber</td>
			<td style="width:291px;">Custom made</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Power1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited</td>
			<td style="width:137px;">Power1401</td>
			<td>Data acquisition, analog signal input/out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spike2 v5.02</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Software package that works with the Power1401</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Audio monitor</td>
			<td>Natus</td>
			<td style="width:137px;">Am 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Square pulse stimulator</td>
			<td>Natus</td>
			<td style="width:137px;">S48</td>
			<td>To deliver electrical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Photoelectric isolation unit</td>
			<td>Natus</td>
			<td style="width:137px;">PSIU6</td>
			<td>Stimulus isolation to reduce noise</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concentric bipolar microelectrode</td>
			<td style="width:291px;">FHC Inc.</td>
			<td style="width:137px;">CBFFG75</td>
			<td>To deliver electrical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-mode lever system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc.</td>
			<td style="width:137px;">Series 300C&#160;</td>
			<td>To deliver mechanical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>forceps with fine tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings

Este video muestra en detalle una fibra única protocolo de registro electrofisiológico in vitro usando una preparación ratón colon y recto-nervio. El enfoque imparcial permite la identificación y caracterización funcional de los aferentes colorrectales individuales. Grabaciones extracelulares de los potenciales de acción se propagan (AP) que se originan en uno o unos pocos aferente (es decir, de una sola fibra) campos receptivos (FR) en el colon y recto están hechos de fascículos de fibras nerviosas burlado. El colon y recto se retira, ya sea con la pelvis (PN) o esplácnico lumbar (LSN) nervio conectado y abierto longitudinalmente. El tejido se coloca en una cámara de registro, clavado plana y perfundidos con solución de Krebs oxigenada. Estimulación eléctrica focal se utiliza para localizar las terminaciones aferentes colorrectales, que son probados además por tres estímulos mecánicos distintos (embotar sondeo, acariciando la mucosa y estiramiento circunferencial) para clasificar funcionalmente los aferentes en cinco mechanosensiclases tivas. Endings responden a ninguno de estos estímulos mecánicos se clasifican como aferentes mecánicamente insensibles (MIAs). Tanto mechanosensitive y MIAs pueden ser evaluados para la sensibilización (es decir, la respuesta mejorada, umbral reducido, y / o adquisición de mechanosensitivity) por la exposición localizada de RFs a los productos químicos (por ejemplo, sopa inflamatoria (IS), la capsaicina, el trifosfato de adenosina (ATP)). Describimos el equipo y preparación de grabación de colon y recto-nervio, la cosecha de colon y recto con PN adjunto o LSN, la identificación de los FR en el colon y recto, la grabación de una sola fibra de los fascículos nerviosos, y la aplicación localizada de productos químicos para la RF. Además, también se discuten los retos de la preparación y la aplicación de la estimulación mecánica estandarizada.

La configuración se ilustra en la Figura 1. Incluye una cámara de tejido a medida que alberga el colon y recto en un baño de silicona compartimento forrado y el nervio adjunto en un compartimento lleno de aceite mineral contigua. La cámara de dos compartimentos fue a máquina de un bloque sólido de plástico acrílico por una máquina de CNC; la parte inferior de ambos compartimentos fue posteriormente revestido con silicona firme para permitir una fácil pin abajo del tejido colorrectal. AP extrac...

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In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

9.5K vistas.  University of Pittsburgh. This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation. 