This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

1. 3D-Zellkultur und Vorbereitung für Imaging <ol><li> Kultur einer geeigneten Zelllinie, dh HCT116 Koloncarcinomzelllinie, in zweidimensionale, Monoschichtkultur. </li><li> Wachsen HCT 116-Zellen in einem T-25-Kolben mit McCoy 5A Medium + 10% fetales Rinderserum in einer 5% CO 2 kultiviert, bis 50-70% Konfluenz, was im allgemeinen einige Tage. </li><li> Release-Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und besitzt eine Teil der Zellen mit einer Zählkammer und Trypanblaufärbung für die Zelldichte und die Lebensfähigkeit zu überprüfen. </li><li> Nach dem Zählen verdünnten Zellen mit vollständigem Medium, um eine geeignete Aussaatdichte von 6.000 Zellen / Vertiefung zu erreichen, oder 30.000 Zellen / ml. </li></ol> 2. Bereiten Agarose Coated 96 Well Platten <ol><li> Hinzufügen 0,19 g Agarose auf 10 ml Standard Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen (1,5% Agarose-Lösung in Medien) 10. Achten Sie darauf, die Aufnahme von leichtem Mischen. Autoklavieren der Agarose in einem Wasserbadfür 20 min. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette absaugen 50 ul der Agarose + Medien-Gemisch in den 60 zentralen Vertiefungen der mit flachem Boden 96-Well-Platte Kulturplatte. Als die Löcher an peripheren Kanten der Platte haben etwas höhere Verdampfungsraten, fügen Sie 200 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), anstatt die Agarose zu diesen Kanten. </li><li> Nachdem die Agarose-Mischung auf den inneren Brunnen hinzugefügt wurde, stellte den Teller beiseite, um abzukühlen ~ 37 ° C vor der Zugabe der Zellen. </li></ol> 3. Samen und Neigen der dreidimensionalen Kultur HINWEIS: Mehr oder weniger Zellen in Abhängigkeit von den Anforderungen der Kultur verbunden ausgesät werden, aber es ist festgestellt worden, dass diese Bedingungen führen zu 3D-Zellkultur-Strukturen von etwa 1 mm Durchmesser nach 10-14-tägiger Kultur (Daten nicht gezeigt) . <ol><li> Fügen Sie 200 ul der entsprechenden Zelllösung (verdünnt auf ~ 6.000 Zellen enthalten), um die Agarose-beschichteten96-Well-Platte. Die Platte abdecken und in befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für das Zellwachstum eingestellt auf 37 ° C. </li><li> Ändern Zellmedien mindestens jede 48 Stunden, oder wenn die Medien scheint sich zu ändern Farbe. <ol><li> Ändern Medien durch vorsichtiges Absaugen des alten Medien aus der Umgebung der kleinen 3D-Zellkultur (mit bloßem Auge von Tag 2) an der Unterseite der Agarose. Fügen Sie 200 ul frisches Medium sanft über die 3D-Zellkultur. </li><li> (Optionaler Schritt) In diesen Medien ändert, fügen Chemotherapeutika oder anderen Drogen zum Testen. Verdünnen Sie das Mittel der Wahl, um die Endkonzentration mit kompletter Medien und fügen Sie die erforderlichen 200 ul in jede Vertiefung. </li><li> Überwachen 3D-Zellkulturwachstum mit einem optischen Mikroskop, bis die 3D-Zellkulturen sind etwa 1 mm im Durchmesser. </li></ol></li></ol> 4. Ernte die 3D-Zellkulturen <ol><li> Verwenden Sie ein 2 ml serologische Pipette vorsichtig die 3D-Zellkultur aus der Agarose Bett. </li> &lt;li&gt; durch vorsichtiges Pipettieren sie in etwa 1 ml PBS in einem wartenden Platte mit 24 Vertiefungen Waschen Sie die 3D-Zellkulturen mit PBS. </li><li> Über geerntet 3D Zellkulturen über serologische Pipette in Zentrifugenröhrchen für Protein- oder Metaboliten Extraktion oder betten sie in einem Schneidmedium zu schneiden für Imaging-Anwendungen zu unterstützen. </li></ol> 5. Integrieren Sie die 3D-Zellkulturen in Gelatine <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung von ~ 175 mg / ml Gelatine in hochreinem Wasser (18 MOhm bevorzugt). 22,23 Mischen Sie die Gelatine kräftig. Beachten Sie die Lösung viskos und schwierig zu handhaben. Setzen Sie den gelatinehaltigen konischen Röhrchen in ein Wasserbad bei ~ 60 ° C warm, bis die Lösung klar und einfach zu saugen. HINWEIS: Die warme Gelatinelösung härtet schnell, wenn sie abkühlt, so führen Sie alle folgenden Schritte schnell vor dem Einfrieren. </li><li> Nachdem es erhitzt wird, nehmen Sie die Gelatine sofort an die Zellkultur Kapuze. Halten Sie das Röhrchen mit Gelatine in einer beaker mit vorgewärmte Wasser bei etwa 60 ° C, um die Härtung der Gelatinelösung zu vermeiden. </li><li> Mit einem 2 ml serologische Pipette einzahlen 0,6 ml der warmen Gelatinelösung in die Vertiefung einer Flachbodenplatte 24. Das Volumen ist ausreichend, um den Boden in einer dünnen Schicht zu bedecken. Die 3D-Zellkulturen vorsichtig abzuscheiden unmittelbar auf der Gelatineschicht mit einem anderen 2-ml-Pipette zu vermeiden Zerreißen der 3D-Struktur. HINWEIS: Es muss zu diesem Zeitpunkt treffen nicht auf PBS in die Gelatine platzieren werden. Wenn dies geschieht, aber entfernen PBS von der Oberseite der Gelatine unter Verwendung einer 200 ul-Pipette. </li><li> Nachdem die 3D-Zellkulturen auf die Oberfläche der Gelatine-Schicht angeordnet ist, sorgfältig zu pipettieren Weitere 0,6 ml der warmen Gelatinemischung in den 3D-Zellkulturen, so dass die Position der Kulturen nicht zu stören. Nachdem die zweite Schicht angeordnet ist, ein Einfrieren der Gelatine eingebettete 3D-Zellkulturen bei 80 ° C. </li></ol> 6. Scheibe und Thaw Berg the Gelatine eingebettete 3D-Zellkulturen für die bildgebenden Massenspektrometrie <ol><li> Entfernen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die 3D-Zellkulturen aus dem Gefrierschrank enthält. Wärmen Sie die Unterseite der Platte mit der Wärme aus der Hand, bis eine Pinzette oder einem Skalpell wird sanft an der Seite des gut gleiten. </li><li> Sanft gleiten die Pinzette oder Skalpell, die Befreiung der Gelatine ohne Auftauen der Mitte. Einen Tropfen von Wasser zu dem Kryostaten unterstützt und verwendet dies, um die Gelatineplatte an dem Träger haften. <ol><li> 3D-Zellkulturen in Gelatine eingebettet sind nach ihrer Eignung für das Schneiden bei -30ºC. Reinigen des Kryostaten Klinge und Glas mit 70% igem Ethanol vor der Verwendung. Verwenden einen anderen Teil der Laufschaufel oder eine neue Klinge für jedes 3D-Zellkultur-Gelatinescheibe Abstumpfen der Klinge zu verhindern. </li></ol></li><li> Mit dem Kryostaten, sanft Gesicht das überschüssige Gelatine, bis die 3D-Zellkulturen sichtbar werden. </li><li> An dieser Stelle langsam in Scheiben schneiden 3D-Zellkulturen mit einer gleichmäßigen Bewegung in 12-16 um-Schnitte. HINWEIS: Kritische Faktoren slicing umfassen die Entfernung des Glases an der Klinge, der Klingenwinkel, die Temperatur des Kryostaten und der Winkel der Platte auf dem Träger, so dass alle von ihnen überprüft, um konsistente Ergebnisse sicherzustellen. </li><li> Vorsichtig auftauen die Scheiben und montieren sie auf Indium-Titan-Oxid (ITO) beschichteten Glasobjektträger entsprechend gekennzeichnet und speichern sie in einem Exsikkator. Nutzen Sie die Scheiben so schnell wie möglich für maximale Qualität. </li></ol> 7. Matrix Anwendung und Probenvorbereitung für MALDI-Imaging <ol><li> Vor der MALDI-Imaging, bereiten Scheiben mit der entsprechenden Matrix. <ol><li> Für kleine Molekülanalyse sind keine Waschschritte benötigt. Für intaktes Protein-Nachweis, wäscht die Scheiben in kaltem 100% Aceton, um Carnoy-Flüssigkeit oder 70% / 95% Isopropanol kleine Moleküle, wie Lipide, die das Signal überdecken könnten, zu entfernen. 24 - 26 </li><li> Wäsche leicht für nicht mehr als 30 s zu einem Zeitpunkt. Unterlassen Sieum alle Scheiben zu stören. </li></ol></li><li> Bereiten Matrix in eine Lösung aus organischem Lösungsmittel und Wasser mit 0,1% TFA. Für kleine Moleküle, wie α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) benutzen 60% ACN: 40% H 2 O: 0,1% TFA (10 mg / ml). Für Proteinnachweis wie Sinapinsäure (30 mg / ml), das gleiche Lösungsmittel-Lösung. Für eine optimale Löslichkeit der Sinapinsäure ersten aufzulösen in Acetonitril vor Zugabe des TFA: H 2 O-Lösung. Andere Matrices können gegebenenfalls verwendet werden. HINWEIS: Matrix kann mit verschiedenen Verfahren aufgebracht werden, aber es sollte angemerkt werden einige Matrices gefunden worden, zusammen kristallisieren mit der Gelatine, wie Ferulasäure, wodurch die Probe unbrauchbar werden. Kleinere Kristalle produzieren konsequenter Massenspektren und sorgt für mehr Molekülarten zu erfassen und auf biologische Unterschiede statt Matrixeffekte zurückzuführen. </li><li> Bewerben Matrix durch handspotting Verfahren. <ol><li> Verwenden Sie einen spitzen Spritze zu 0,5 ul der matr geltenix Lösung auf dem 3D-Zellkultur in Scheiben schneiden und damit die Matrix zu kristallisieren. </li></ol></li><li> Alternativ können Sie die Airbrush-Verfahren. Füllen Sie eine handelsübliche Airbrush mit dem Matrix-Lösung. <ol><li> Halten Sie die Spritze 8-12 cm entfernt von dem Objektträger, wollen einen feinen Sprühnebel auf der Scheibe. In zwischen den Durchgängen, damit die Matrix trocknen für 1 min für die beste Kristallbildung zu ermöglichen. Bis zu 10-20 Durchläufe der Airbrush ist erforderlich, um eine optimale Matrixschicht 22 zu erzeugen. </li></ol></li><li> Alternativ können Sie die Sublimationsverfahren an anderer Stelle beschrieben. 25,27 </li><li> Trocken gleitet in einem Exsikkator für mindestens 30 min vor der MALDI-MSI, unabhängig von der Methode der Matrix-Anwendung. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI Analyse mithilfe eines MALDI-TOF-System (dh Autoflex III) HINWEIS: Dieser Abschnitt enthält Anweisungen und Ratschläge zum Einstellen von Parametern für eine MALDI-TOF-Imaging-Experiments. In Abhängigkeit von den instrument Hersteller und Software verwendet wird, kann das Verfahren zu variieren. <ol><li> Setzen Sie die Dias in einem Adapter, um sicher zu halten, 75 mm x 25 mm Dias, um Bild die 3D-Zellkulturscheiben auf ITO-beschichtete Objektträger befestigt. Laden Sie den Schiebeadapter in das Gerät. </li><li> Bereiten Sie das Gerät für MALDI-MSI durch Auswahl eines geeigneten Kalibrierungsstandard für den Massenbereich in Frage. Zur Abfrage von kleinen Molekülen, die erfassten Signale, die auf die Matrix verwendet, α-CHCA entsprechen, sind eine gemeinsame Gruppe von Eichsubstanzen. Für die Analyse von Proteinen, sind bekannte Proteinstandards (dh Ubiquitin, Trypsinogen) im Massenbereich von Interesse ausgewählt und gesichtet benachbart zu den 3D-Zellkulturen als Eichsubstanzen. Kalibrieren Sie das Gerät, bevor Sie mit der Methodenentwicklung voran. </li><li> Vor der Bildgebung, entwickeln Methoden der Datenerfassung für die Massenbereich bei Verwendung der vom Gerätehersteller zur Verfügung gestellte Software. Siehe Figuren 1 und 2 fürkleinen Molekülen und Proteinen Bildgebung. Für kleine Molekül Bildgebung verwenden Reflektronmodus für die höchste Massenauflösung. <ol><li> Stellen Sie den Massenbereich für kleine Molekül Datenerfassung zwischen 100-1.000 m / z und für Proteine ​​zwischen 8.000 25.000 m / z. Stellen Sie den Massenbereich, die Region der Wahl umfassen, während die höchste Massenauflösung mit dem Gerät möglich. </li><li> Passen Sie die Laserleistung, Frequenz, Anzahl der Laserschüsse und Spotgröße mit Hilfe der Kalibrierungslösung und eine in der Nähe &quot;Opfer &#39;3D-Zellkultur-Slice. Beachten Sie diese Einstellungen in der Hauptgerätesteuerung Software. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen als empfohlene Anfangspunkt: 60% Energie, 400 Laserschüsse, ultra kleinen Spotgröße. Diese Einstellungen werden über Instrumente und Methoden variieren, so optimieren, Geräteparameter, die höchste Qualität Spektren für jede spezifische Instrument geben. Andere Parameter, die eingestellt werden können, umfassen die Detektorverstärkung, die Abtastrate, und elektronische Verstärkung. Save diese Methode für den Einsatz in der Bildbearbeitungssoftware (dh., AutoExecute Methode, dass FlexImaging wird zurückgreifen). HINWEIS: Unterdrücken-Ionen unter dem Massenbereich von Interesse (wieder in der Gerätesteuerung zu finden), um nicht den Nachweis stören. </li><li> Entwickeln Proteindatenerfassungsmethoden für die Massenbereich der Wahl. Folgen Sie den gleichen oben beschriebenen Schritte, aber für die mittleren bis hohen Massenbereichen, oberhalb von etwa 3 kDa, verwenden linearen Modus. HINWEIS: Die Einstellungen werden von den für kleinmolekularen Methoden abweichen. </li></ol></li><li> Setup-spezifische MS Geräteparameter mit Hilfe der Imaging-Software vom Hersteller des Instruments, wie FlexImaging für Bruker MALDI-TOF-Systeme zur Verfügung gestellt. <ol><li> Erstellen Sie eine neue Bilddatei und den Ordner mit den vor entwickelt und gespeicherten Methoden. Wählen Sie die Geräteparameter wie Rasterpunktgröße (Wechsel von der Standard etwa 200 um bis 50 um), die Gerätesteuerung Methode (Setup in Schritt 8.3.2 oder 8.3.3) eingestellt und position, wo man über die 3D-Zellkultur zu scannen. </li><li> Wählen Sie drei geeignete Teachpunkte auf der Probe, Bewegen des Lasers sich nacheinander. Besorgen Sie sich die optische Fotografie von der MALDI-TOF-Lasersteuerungssoftware mit &quot;Print Screen&quot;. HINWEIS: Viele Bildbearbeitungsprogramme erfordern eine optische Fotografie von der Probe zu &quot;lehren&quot; die Software, wo der Laser befindet, die mit einem Scanner oder oft das Instrument Kamera erhältlich ist. </li></ol></li><li> Dann starten Sie den Bildgebungsprozess von der Imaging-Software (nicht die Gerätesteuerung) und erwerben Massenspektren von jeder Scheibe. Beachten Sie die meisten Massen über die 3D-Zellkultur und andere auf bestimmte Bereiche lokalisiert. </li></ol> 9. Optional Datenanalysemethoden <ol><li> Für gezielte Analysen, führen Sie eine manuelle Analyse der Spektren, indem Sie auf eine Masse im mittleren Spektrum, oder lassen Sie die Imaging-Software, um automatisch Massen nehmen ab einer bestimmten Schwelle (z. B. Spitzen above die obere Schwelle von 20%). Für die Qualitätskontrolle, die Aufteilung von Matrix-Gipfel oder die mittlere Spektrum. </li><li> Führen Sie statistische Auswertungen mit extrahierten Datensätzen in der mathematischen Software wie R oder Matlab. <ol><li> Export Einzelspektren im ASCII-Format, eine lesbare Textdatei zum Laden in die Software der Wahl. </li><li> Konvertieren Sie die Einzelspektren in ASCII, mzXML, der mzML Format zum Lesen von verschiedenen Software-Programme, 28 -. 31 oder die Daten zu exportieren als Analysieren (.img) Format-Datei, ein gemeinsames Muster für andere bildgebende Anwendungen wie MRI verwendet 32 Zwei Open-Source-Optionen für die Analyse sind MSiReader und BioMap 32,33. </li><li> Sobald die Dateien werden in ein lesbares Format der Software ausgeführt werden, laden Sie die Datenmenge über den Anweisungen in der jeweiligen Software. Nach dem Laden, führen nach dem Erwerb Verarbeitung, wie Basisentfernung und Normalisierung. </li><li> Mit diesem Datensatz, führen statistical Behandlungen wie Hauptkomponentenanalyse der hierarchischen Cluster entweder benutzerdefinierte Skripts oder Algorithmen in Software integriert wie Matlab 18. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections.">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li><li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules.">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li><li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML:+a+single,+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output).">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li><li>Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren kann 3D-Zellkulturen gezüchtet und mit MALDI-MSI analysiert werden. Viele immortalisierte Zelllinien werden 3D-Strukturen zu bilden, wenn kultiviert angemessen. 9,10 ist darauf zu Zellen, die nicht zu oft übergeben wurden, das heißt, eine geringe Durchgangsnummern pflegen werden. Im Allgemeinen werden Zellen mit Durchgangszahlen von zehn und unteren optimal für wachsenden 3D-Zellkulturen. Wachsende die 3D-Zellkulturen in einem traditionellen Agarose-Unterstützung stellt eine kostengünstige Möglichkeit für Forschungsgruppen, die sich in der 3D-Zellkultur, dieses System zu versuchen. Dieses Verfahren verwendet wenige Komponenten nicht schon in den meisten Säugerzellkulturlaboratorien. Besondere Aufmerksamkeit muss der Vorbereitung der Agaroseplatten Wachstums geachtet werden, dass die 3D-Zellkulturen mit einheitlicher Größe und Form; Einige Aspekte, die besondere Aufmerksamkeit erfordern, schließen die Überprüfung, dass keine Luftblasen in der Mischung, und daß eine richtige Meniskus an dem Boden jedes w gebildeten eingeschlossenenell. Wenn der Meniskus nicht richtig zu bilden, können die Zellen in nicht-kugelförmigen Formen oder in kleine Klumpen wachsen. Auch muss darauf geachtet werden, dass PBS in die Gelatine mit der Sphäroide zu erteilen. Ist dies der Fall, entfernen Sie das PBS von der Spitze der Gelatine mit einer 200 ul Pipette. Wenn die Kosten keine Rolle spielen, sind ultra-geringe Bindungsrundbodenplatten im Handel erhältlich und bieten eine Vereinfachung dieser Schritte. Während andere Gewebeeinbettung Methoden können auch teuer und nicht-Massenspektrometrie kompatibel zu sein, ist Gelatine-Einbettung sich gezeigt, sowohl kostengünstig und vielseitig. Vorbereitung Strategien oben umrissen wurden optimiert für 3D-Zellkulturen, um die hochwertigsten Daten zu erhalten. Während Gelatine-Einbettung ist gezeigt worden, mit Massenspektrometrie-Analyse kompatibel ist, macht diesen Prozess einzugrenzen die verfügbaren Matrizen durch Co-Kristallisation. Wenn sie gefroren ist, werden die 3D-Zellkulturen, solange sie nicht gefriertaut für Monate stabil. Die Gelatine wird undurchsichtig, wenn eingefroren, und der 3D-ZellKulturen sind von einer ähnlichen Farbe, so ist es ratsam, vor dem Einfrieren, die 3D-Zellkultur-Platzierung in Slicing helfen zu dokumentieren ist. Bei der Herstellung von Folien, kann Matrix mit verschiedenen Verfahren aufgebracht werden, aber es sollte angemerkt werden, dass einige Matrices gefunden worden, zusammen kristallisieren mit der Gelatine, wie Ferulasäure, wodurch die Probe unbrauchbar werden. Kleinere Matrixkristalle erzeugen konsequenter Massenspektren. Während handspotting ist die einfachste Methode der Matrix-Anwendung kann der größeren Lösungsmittelvolumen in größeren Kristallgrößen und bedeutsamen Analyten Migration führen. Bei dem Massenspektrometer, schreitet in MALDI-MSI Technologien haben die für den Beginn Analysen erforderlichen Fachwissen verringert. Datenerfassung und Analyse ist einfach auf den meisten Systemen, so dass auch ein Anfänger, qualitativ hochwertige Informationen aus ITO-beschichtete Folien zu erhalten. Die sorgfältige Auswahl der Geräteparameter, auf dem nahe gelegenen Nichtbild würdig 3D-Zell cultur optimiertes ist kritisch, um qualitativ hochwertige Daten. So kann beispielsweise zunehmender Laserleistung Spitzenintensität zu erhöhen, aber abnehmende Laserleistung kann die Auflösung zu verbessern und geben mehr symmetrische Peakformen. 3D-Zellkulturen sollten nach dem Schneiden, um eine optimale Qualität zu gewährleisten Probe schnell eingesetzt werden. Der Abbau von Protein-Signal kann in weniger als einer Woche, ohne fachgerechte Lagerung (Exsikkator / -80 ° C Tiefkühlschrank) gesehen werden, vor allem in der hohen Massenbereich (über 20 kDa). Aufgrund der wachsenden Nachfrage haben viele verschiedene Visualisierungs-Software-Programme entwickelt und sind frei, die Forschung der Öffentlichkeit. Die meisten bildgebenden Massenspektrometer haben die erforderlich sind, um einzelne Massen mit den proprietären Formaten auf jedem Instrument visualisieren Software installiert. Diese Software-Programme verwendet werden, um Einzelmassen Bilder die Daten zu erhalten und zu exportieren. Die meisten Software ermöglicht auch die Überlagerung von zwei oder mehr Massen von Interesse. Darüber hinaus haben viele verschiedene Betrachter für MSI Daten können kostenlos heruntergeladen werden, wie zum Beispiel ein MSiReaderd BioMap. 32,33 Die Massenspektrometrie gewonnenen Daten können auch verarbeitet werden nach der Übernahme mit Leichtigkeit, bringen weitere nützliche Informationen in den Vordergrund. Von Pharmazeutika an Lipide, Proteine, wobei das System oben beschrieben ermöglicht eine schnelle Erfassung von Daten, um die Verteilung von Molekülen von Interesse in einem 3D-Zellkultur Struktur auszuwerten. Serienschnitte, um die Bild die gesamte 3D-Struktur durch den Bau von jeder 2D-Bild der ein Stück von der 3D-Zellkultur genommen werden. Die Techniken und die Noten im Protokoll von Nutzen Forscher, die dreidimensionale Zellkultur als eine Brücke zwischen einer Monoschichtkultur und Tiermodellen zu beginnen. Einmal gemeistert, können diese Techniken auf mehrere Arten von 3D-Zellkulturen, Geweben und Zellkulturen verwendet werden, so dass die Forscher Bild je nachdem Proben sie wählen.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

MSI-Bildgebung hat das Potential, offenbaren verschiedene molekulare Verteilung in 3D-Zellkulturen. Verwendung der oben beschriebenen Methode kann Arten von kleinen Molekülen (Abbildung 1), um große Proteine ​​(Abbildung 2) in der Kultur verfolgt werden. Diese Ergebnisse zeigen, Visualisierung eines einzelnen Ions mit dem kostenlosen Tool MSiReader. 32 Die Ergebnisse können für die einzelnen Ionen von Interesse in der 3D-Zellkultur mit Visualisierungs-Software entweder in einer Region von Interesse oder das gesamte gescannte Region analysiert werden. Darüber hinaus die meisten Software-Ionen über eine bestimmte Schwelle durch den Benutzer, die Forschungsbemühungen zu unterstützen kann automatisch eingestellt visualisieren. Sobald Einzelionen Karten erhalten werden, sind die meisten Software die Fähigkeit, um die Bilder zu überlagern, um die Co-Lokalisierung von Ionen zu sehen. Entweder in Discovery-basierte Ansätze oder gezielt, ist die Massenspektrometrie Bildgebung ein leistungsfähiges Werkzeug zur 3D-Zellkulturen zu untersuchen. Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse der 3D-Zellkulturwachstum und Schnitte. Links) Optisches Bild einer intakten kolorektalen HCT-116-3D-Zellkultur-Struktur am 14. Tag vor der Ernte angesehen. Rechts) Optische Bild eines etwa äquatorialen Scheibe eines kolorektalen 3D Zellkultur Tauwetter auf ein ITO-beschichteten Objektträger für die Bildgebung montiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse von Kleinmolekül-MALDI-MSI von einer äquatorialen Abschnitt einer 3D-Zellkultur. Top) Durchschnittliche Massenspektren mit α-CHCA im geringen Masse (kleines Molekül) Bereich erreicht. Bottom) Vertreter Bildereine einzige Masse: 327,8 m / z Wesentlichen auf das Innere des 3D-Zellkultur und lokalisiert 429,7 m / z Wesentlichen auf der Kante des 3D-Zellkultur lokalisiert. Eine gestrichelte Linie zeigt den ungefähren Rand der Sphäroid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse von Protein-Bildgebung mittels MALDI-MSI von einer äquatorialen Abschnitt einer 3D-Zellkultur. Top) Durchschnittliche Massenspektren mit Sinapinsäure in der höheren (Protein) Massenbereich erreicht. Unten) Repräsentative Bilder eines einzelnen Masse: 10.871 m / z Wesentlichen auf der Kante des Sphäroids lokalisiert und 12.184 m / z mehr in Richtung des Inneren des Sphäroids lokalisiert. Eine gestrichelte Linie zeigt den ungefähren Kante des Sphäroids. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Verewigt Krebszelllinien können als 3D-Zellkulturen, ein wertvolles Modell für die biologische Forschung angebaut werden. Dieses Protokoll beschreibt Massenspektrometrie Bildgebung von 3D-Zellkulturen, einschließlich Verbesserungen in der Probenzubereitung Plattform. Das Ziel des Protokolls ist es, die Benutzer anweisen, 3D-Zellkulturen für die Massenspektrometrie Bildanalyse vorzubereiten.

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.0K Aufrufe.  University of Notre Dame.  Verewigt Krebszelllinien können als 3D-Zellkulturen, ein wertvolles Modell für die biologische Forschung angebaut werden. Dieses Protokoll beschreibt Massenspektrometrie Bildgebung von 3D-Zellkulturen, einschließlich Verbesserungen in der Probenzubereitung Plattform. Das Ziel des Protokolls ist es, die Benutzer anweisen, 3D-Zellkulturen für die Massenspektrometrie Bildanalyse vorzubereiten. 

Serie: Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Forschung

Biotechnik

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

Etablierung der 3D-Stromal-Endothelzell-Kokultur

Skalierbare Erzeugung von einheitlichen Zell-Sphäroiden mit Hilfe eines 3D-Akustik-Montagegeräts

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung einer gerüstfreien akustischen Assemblierungsmethode für hochwertige 3D-Zell-Sphäroid-Kulturen 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...