We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Überwachung transzelluläre Verbreitung des Prion-ähnlichen Proteine ​​durch In-vivo-Zeitraffer-Imaging HINWEIS: Wachsen C. elegans Wildtyp (WT) (N2) und transgenen Linien nach Standardmethoden und die Kultivierungstemperatur 47 sorgfältig zu kontrollieren. <ol><li> Gene transgenen Linien von C elegans Expression des Prion-ähnlichen Protein, mit monomeren rot fluoreszierendes Protein (mRFP) markiert. In diesem Video, das, wie man die Mikroinjektion 48 demonstriert. Weitere Details und die Methoden beschreiben, wie Sie diese extrachromosomale Linien zu integrieren, finden 49. </li><li> Bereiten synchronisiert Populationen Eiablage oder Bleichen nach Standardverfahren 50. <ol><li> Synchronisation durch Eiablage <ol><li> Über 10-20 gravid Erwachsenen auf einem Teller und lassen Sie sie Eier legen für 1-2 Std. Erwachsene entfernen von der Platte und lassen Sie die Nachkommen wachsen, bis die gewünschte Zeit. </li></ol></li> &lt;li&gt; Synchronisation von Bleich <ol><li> Sammeln Sie eine unsynchronisierte Bevölkerung von schwangeren Erwachsenen und bleichen sie mit alkalischen Natriumhypochlorit-Lösung (250 mM NaOH und 1: 4 (v / v) Verdünnung der kommerziellen Bleichmittel in H 2 O). Zweimal (218 · g für 1 min) Waschen Sie die Eier mit M9-Puffer 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7 H 2 O, 22 MMKH 2 PO 4, 86 mM NaCl, 1 mMMgSO 4 · 7 H 2 O, fügen dH 2 O bis zu 1 L). </li><li> Es ihnen ermöglichen, in M9-Puffer unter leichtem Schütteln O bei 20 ° C schlüpfen / N. Worm Entwicklung wird im L1 Stufe in Abwesenheit eines Nahrungsmittels zu verhaften, so dass eine synchronisierte Bevölkerung. Übertragen L1s auf frische Nematode Wachstumsmedien (NGM) Platten mit OP50 E. ausgesät coli-Bakterien und lassen Sie die Nachkommen entwickeln, bis die gewünschte 47 Jahren. </li></ol></li></ol></li><li> Planen 2% Agarose-Pads (in H 2 O) auf einen Objektträger, wie beschrieben 50. <ol><li> Bereiten Sie zwei mikop Folien mit Etikettenband über ihre ganze Länge angeordnet, um als Abstandshalter verwendet werden. Platzieren Sie eine dritte Objektträger zwischen ihnen. </li><li> Löse 2% Agarose in H 2 O und Pipette ein Tropfen auf die saubere Folie. </li><li> Platzieren eines vierten Schieber senkrecht zu den drei anderen Folien oben auf den Agar Abfall. Drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um das Kissen in die gleiche Dicke wie die Etikettierung Band zu glätten. </li><li> Lassen Sie es trocken für 1 Minute, bevor Sie die Abstandshalter und leichtes Ziehen die Folien auseinander. Die Agar-Pad, einen von ihnen zu bleiben. </li></ol></li><li> Pipette ~ 10 ul Anästhetikum (2 mM Levamisol in M9-Puffer) mit dem Pad und Übertragungs ~ 10 Tieren unter Verwendung einer Platindraht-Pick. Deckel mit einem Deckglas (~ 22 x 22 mm) und nehmen Sie Bilder in 1 Std. </li><li> Alternativ, um Filme über einen längeren Zeitraum hinweg zu erwerben oder die Möglichkeit einer Bewegung der Tiere weiter zu reduzieren, verwenden eine Kombination von Betäubung und Ruhigstellung Wulst 51. <ol><li> Bereiten Sie 10% agaRose-Pads (in M9-Puffer), wie beschrieben, 51 und fügen Würmer zu 3 ul Nanokugel Größenstandards Lösung (Polystyrol-Kügelchen, 100 nm) und 3 ul Betäubung (4 mM Levamisol in M9-Puffer). Bedecken Sie vorsichtig mit einem Deckglas. Um ein Austrocknen zu verhindern, versiegeln das Deckglas mit VALAP (Mischung aus gleichen Teilen Vaseline, Lanolin und Paraffinwachs). </li></ol></li><li> Bild immobilisiert Würmer mit einem konfokalen Mikroskop. HINWEIS: Die Ergebnisse werden mit einem Spinning Disc AF Konfokalmikroskop mit einem EM-CCD-Kamera und einem Mikroskopie Automatisierung und Bildanalyse-Software wie MetaMorph ausgestattet erhalten und stellen die Besonderheiten unter, aber vergleichbaren konfokalen Bildgebungssysteme können ebenfalls verwendet werden. <ol><li> Verwenden Sie das 63X oder 100X / 1.4NA Öl-Objektiv und setzen Sie den Objektträger, die Würmer in den Mikroskopobjektträgerhalter. </li><li> Öffnen Sie die Software. Passen Laserleistung und Filter für mRFP Bildgebung. Verwenden Sie die 561-nm-Laser mit 10% Leistung und Emissionsfilter&gt; 600 nm. </li><li&gt; Öffnen &quot;Mehrdimensionale Bildaufnahme&quot;. Unter der Registerkarte &quot;Allgemein&quot; die Kontrollkästchen für &quot;Timelapse&quot; und &quot;Run Journals&quot; (Hardware-Autofokus: aus). </li><li> Auf der Registerkarte &quot;Speichern&quot; auswählen oder das Verzeichnis Ordner, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Benennen Sie die Datei. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Wellenlänge&quot;, wählen Sie die entsprechende Beleuchtung und die Belichtungszeit und Verstärkung. Mit &quot;YokoQuad Red&quot; (oder eine äquivalente Beleuchtungseinstellung für mRFP imaging) mit einer Einwirkungszeit zwischen 100 und 300 ms und einer Kameraverstärkung zwischen 100 und 300, abhängig von der einzelnen Probe (beurteilt unter Verwendung der Livebild). </li><li> Unter dem Reiter &quot;Timelapse&quot; wählen Sie &quot;Anzahl der Zeitpunkte&quot; = 301, &quot;Dauer&quot; = 5 min und &quot;Zeit / Intervall&quot; = 1 Sek. </li><li> Im Rahmen des &quot;Journals&quot; Tab wählen Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; und &quot;AFC Zurück zur Z HOLD&quot;, Typ: &amp;# 8220; Special &quot;(zweimal), Ausgangspunkt:&quot; Start Zeitpunkt &quot;und&quot; End of Zeitpunkt &quot;. Das Autofokus-Option ist wichtig, um Bild die gleiche Abschnitt über einen längeren Zeitraum. </li><li> Wenn das Setup abgeschlossen ist, klicken Sie auf &quot;Erfassen&quot;. Die Zeitraffer-Video wird als separate TIFF-Files abgelegt. </li><li> Öffnen Sie alle TIFF-Dateien eines bestimmten Zeitreihen in ImageJ. Gehen Sie auf &quot;Bild&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Bilder zu Stacks&quot;. Optional können Helligkeit und Kontrast, fügen Größe Bar, etc. Exportieren Sie den Film unter &quot;Datei&quot; → &quot;Speichern als&quot; → &quot;AVI ...&quot; (zum Beispiel siehe Video 1 und 2 entsprechend Figur 1). </li></ol></li></ol> 2. Mit Klapp Sensoren und Spannungs Reporter Cell Autonome und Nichtzellen Autonome Wirkt auf Proteostase und Toxizität Untersuchen <ol><li> Gene transgenen Linien, die einen Klappsensor oder Stress reporte coexprimierenr zusammen mit der Prion-ähnlichen Proteins. Für Methoden, wie man Kreuze errichten oder zu generieren transgenen Linien finden 48,49,52. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von C elegans-Stämme, die verwendet werden können. </li><li> Bereiten synchronisierten Populationen transgener Tiere und wachsen, bis die gewünschte Alters wie oben (Abschnitt 1.2) 50 beschrieben. </li><li> Mit einem Stereomikroskop, überprüfen Sie die entsprechende Phänotyp des Faltungssensor oder Stress Reporter. <ol><li> Für die Faltung Sensor, bestimmen die Anzahl der Tiere beherbergen Aggregate an jedem Tag nach der Synchronisation (ein Beispiel finden Sie in Abbildung 2 E und F). </li><li> Für die Stress-Reporter, Test, wenn die Co-Expression der Prion-ähnlichen Protein führt zu einer erhöhten Fluoreszenz des Reporter (für ein Beispiel siehe Abbildung 3). </li></ol></li></ol> 3. Genomweite Bildschirm Unterdrückung von Prion-induzierte Toxizität in C. elegans<img alt="4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Schematische Darstellung des RNAi-Screening-Protokoll. Siehe Protokoll Abschnitt 3 für eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte. <ol><li> Synchronisation von C. elegans Würmer und Vervielfältigung von RNAi-Bibliothek <ol><li> Für die RNAi Bildschirm aus den Ahringer RNAi-Bibliothek (oder die Vidal RNAi-Bibliothek) 53,54. Rearray das RNAi-Bibliothek aus dem ursprünglichen 384-Well-Format in ein 96-Well-Platten, indem die Platten mit 100 &amp; mgr; l LB-Amp-Medium (50 ug / ml Ampicillin in LB) mit 10% Glycerin ergänzt und Beimpfen mit einem 96-Pin-Replikator. Wachsen bei 37 ° CO / N unter Rühren und bei -80 ° C. </li><li> Pflegen C. elegans WT und transgenen Linien bei 20 ° C auf NGM-Platten ausgesät mit OP50 E. coli Bakterien nach Standardverfahren 47. </li><li>Synchronisieren Prion Domain transgene und WT (Kontrolle) Nematoden durch Bleichen (siehe Abschnitt 1.2). </li><li> Am selben Tag, dass die Würmer gebleicht werden, bereiten LB-Medium mit 50 ug / ml Ampicillin. Verwenden Sie eine automatisierte Reagenzspender zu verzichten (oder Pipette manuell) 65 ul der LB-Amp-Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. </li><li> Entfernen Sie 96-Loch Ahringer RNAi Bibliothek Platten von -80 ° C und bringt sie zu einer sterilen Haube mit Küchenpapier ausgekleidet. Unverzüglich entfernen Sie die Dichtungsband, indem Sie die Platte auf den Kopf, während Platten noch gefroren sind, wobei darauf geachtet, um eine Kontamination von Eis auf der Außenseite der Platten zu vermeiden. Reinvert die Teller und lassen Sie sie für etwa 30 Minuten auftauen. </li><li> Tauchen Sie ein steriles 96 Pin-Replikator in einem RNAi-Bibliothek Platte und dann in eine frische LB-Amp-Platte. Verwenden Sie eine neue sterile Replikator für jede Platte. Dichten Sie alle Platten mit Klebefolienband und geben die Bibliotheksplatten bis -80 ° C. Die Replikatoren in Bleichmittel eingeweicht werden, gespült,und autoklaviert, um wieder verwendet werden. </li><li> Lassen duplizierten RNAi Platten zu O / N in einem Brutschrank auf 37 ° C und 300 Umdrehungen pro Minute eingestellt wachsen. Um HT115 E. verwenden coli Bakterien beherbergen, die einen leeren Vektor (L4440) als Kontrolle, wachsen sie einzeln in ein Kulturröhrchen pipettieren und 65 ul der Kultur mit einer Mehrkanalpipette in ein Viertel der zwei Platten mit 96 Vertiefungen. </li></ol></li><li> Die Induktion der Bakterien dsRNA Produktion und Zugabe von Würmern <ol><li> Verdünne Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer 5 mM Konzentration in ddH 2 O. Verwenden Sie eine automatisierte Workstation mit einem Mehrkanal-Kopf zu verzichten (oder Pipette manuell) 10 ul verdünnt IPTG in jede Vertiefung der RNAi Bakterien und der Steuerplatten. Verschließen Sie und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Lassen Sie sie schütteln für 3 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Während Bakterien zittern, bereiten die Würmer. Mischen Sie die M9 / Wurm Federung gut und Pipette eine kleine Probe (~ 5-10 ul) auf einen Glasobjektträger. Zählendie Zahl der Würmer unter einem Stereomikroskop und berechnen Sie die Anzahl der Würmer pro ul. </li><li> Unter Einhaltung steriler Techniken bereiten eine Lösung ergänzt M9 (M9 +) mit den folgenden Endkonzentrationen: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 ug / ml Cholesterin, 50 ug / ml Ampicillin, 9,6 ug / ml Tetracyclin, 0,0835 g / ml Fungizone und 15 Würmer pro 50 ul. <ol><li> Tätigen Sie Lösungen für Prionen Domain transgene und WT Würmer. Das Endvolumen M9 + benötigt wird von der Anzahl der RNAi Platten kopiert werden (siehe unten) abhängig Schneckenlösung plus ~ 30 ml Totvolumen, das in dem Reservoir verbleiben, wenn eine automatisierten Dispenser verwendet. </li></ol></li><li> Nach 3 Stunden Induktion der Bakterien dsRNA Produktion, nehmen die Platten aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (~ 30 min) zu kühlen, um Wärme zu belasten die Tiere. </li><li> Dispense 50 ul M9 + Prion Domain transgenen Wurm-Lösung in jede Vertiefung der RNAi-Platten und einer der leeren Vektor Kontrollplatten. Machensicher, dass die Schnecken Lösung vor jedem Schritt zu mischen, wie die Tiere dazu neigen, auf den Boden des Behälters absetzen. </li><li> Dispense WT Würmer in die zweite Steuerplatte. Lassen Sie die Platten nicht abgedichtet, um die Belüftung zu ermöglichen. Um die Flüssigkultur verdunstet halten, Stack 4-5 Platten zusammen und wickeln mit einem feuchten Papiertuch und Aluminiumfolie. Inkubation bei 200 rpm bei 20 ° C für 4 Tage. </li></ol></li><li> Wertung HINWEIS: Nach 4 Tagen im Brutschrank werden die Würmer am zweiten Tag Erwachsenenalter sein und bereit sind, zu untersuchen. Lassen Sie die Tiere nicht schütteln Bedingungen anpassen 30 min vor Screening ungestört Prügel zu gewährleisten. <ol><li> Mit einem Falcon 4M60 Kamera an einen Computer mit Monitor, Bildschirm visuell erhöht Prügel verbunden, verglichen mit Kontrolle behandelt Prion Domain transgenen Tieren. </li><li> Stellen Sie eine Liste der vorläufigen Ergebnisse zu bestätigen, mit wrMTrck (siehe nächster Abschnitt). </li></ol></li></ol> 4. Bestätigung der vorläufigenBildschirm Hits <ol><li> Motilität Assay auf festen Platten <ol><li> Bereiten Platten mit NGM mit 100 ug / ml Ampicillin, 12,5 ug / ml Tetracyclin und 1 mM IPTG ergänzt, nach Standardverfahren 47. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen platten Gießmaschinen, um sicherzustellen, alle Platten haben die gleiche Höhe von Medien, die für eine schlankere Videoakquisitionsprozess ermöglicht. </li><li> Wachsen die verschiedenen RNAi-Klone in ~ 1 ml LB + 50 ug / ml Ampicillin, O / N bei 37 ° C und 250 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Am nächsten Tag, induziert die Expression der dsRNA mit 1 mM IPTG für 3 Stunden. Samen, die Platten mit 150 ul jeder RNAi bakterielle Klon, zu einer dünnen Schicht ausgebreitet. Lassen Sie die Bakterien trocken 2 Tage bei RT im Dunkeln. Bereiten Sie 3 Platten pro RNAi-Klon. </li><li> Synchronisieren Sie die Wurmpopulation durch Bleichen nach Standardverfahren 50 (siehe Abschnitt 1.2), und lassen Sie die Eier ausbrüten O / N in M9-Medium. </li><li> Nehmen Sie eine Probe des Wurms Federung und bestimmen die Höhe der nematodes pro ul bei dem Stereomikroskop. Dann pipettieren das richtige Volumen der M9 und Würmer in jedem Versuchsplatte, so dass es 25 enthält - 30 L1 Würmer. Wachsen die Nematoden bei 20 ° C für 4 Tage, bis die Würmer erreichen Tag 2 des Erwachsenseins. </li></ol></li><li> Die quantitative Analyse der Wurm Motilität mit der wrMTrck Plugin für ImageJ HINWEIS: Die Videos wurden mit einem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit einem Hamamatsu Orca-R2 Digitalkamera C10600-10B und Hamamatsu einfache PCI-Imaging-Software erfasst. <ol><li> Schalten Sie die Kamera und das Simple PCI-Imaging-Software. Klicken Sie auf &quot;Live&quot;, um zur Einstellung der Bilderzeugungsbedingungen zu ermöglichen. </li><li> Richten Sie die Videobedingungen wie folgt: Gain = 0; Light Mode = High; Speedindex = 1; Binning = 2. Klicken Sie auf &quot;Auto Expose&quot; und passen Sie die Lichtverhältnisse, Bewegung der Mikroskopspiegel und die Helligkeits- und Kontrastwahl. HINWEIS: Das Video muss einen hohen Kontrast ohne ÜBERBEL habenosed, so dass die Tiere wie schwarze Gestalten auf einem hellen Hintergrund erscheinen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Zeit Scan&quot; und wählen Sie einen Ordner und einen Dateinamen ein. Set &quot;Feld Delay&quot; auf 20 ms und &quot;Stopp bei Time&quot; um 30 Sekunden. Drücken Sie auf &quot;Live Review&quot;, um den Bereich der Platte wählen zu erfassen (wo die meisten Würmer sind). Tippen Sie auf die Platte 3 oder 4 mal auf der Bühne, schnell bestätigen ihre Position im Sichtfeld ein und drücken Sie &quot;Start&quot;. </li><li> Nachdem der Film endet die Aufzeichnung der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie &quot;Export Montage Sequence&quot;, um den Film von einem Format in ein .cxd .avi exportieren. </li></ol></li><li> Die Analyse der Motilität Videos <ol><li> Öffnen Sie die ImageJ-Software, gehen Sie zur Registerkarte &quot;Plugins&quot;, dann &quot;wrmtrck&quot; und wählen Sie &quot;wrMTrck Batch&quot;. Wählen Sie das Verzeichnis alle Dateien, die analysiert werden soll. </li><li> In der Haupteingabefenster wrMTrck_Batch, laden Sie die Eingabewerte wie in Figur detaillierte 5C. Erläuterung der einzelnen Parameter finden Sie in den Anweisungen, die das Plugin begleiten zu finden. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, und lassen Sie die Bewegungsanalyselauf. </li><li> Um die Ergebnisse zu kuratieren und bestätigen Sie, dass alle erkannten Tracks sind von den tatsächlichen C. elegans und beseitigen Artefakte, öffnen Sie jede der TXT-Dateien für jeden Film geschaffen und kopieren Sie die Daten auf eine Datenanalyse-Software-Datei. Öffnen Sie die &quot;* _labels.zip&quot; erstellten Dateien und führen Sie die daraus resultierende &quot;* _labels.tif&quot; von Hand überprüfen und zu beseitigen falsche Wurmspuren. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Die hier beschriebenen Methoden helfen, um zu veranschaulichen die Verbreitung und der komplexen Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität von Prion-ähnlichen Proteinen. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass eine Aggregation neigende cytosolische Prion-Domäne wird in membrangebundene Vesikel in einer Autophagie bezogenen Prozess übernommen. Eine spezielle Untergruppe dieser Vesikel transportiert das Prion-Domäne innerhalb und zwischen den Zellen und Gewebe 40. Der Schlüssel, um ihre Bewegung im...

Viele neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (TSE) werden mit Aggregation neigende Proteine ​​verbunden und werden daher allgemein als Proteinfehlfaltungserkrankungen (PMDs bekannt ). TSE oder Prionenerkrankungen stellen eine einzigartige Klasse von PMDs indem sie Infektions in Mensch und Tier 1 sein kann. Auf molekularer Ebene, replizieren Prionen durch die Rekrutierung und Umwandlung von monomeren α-Helix reiche Wirts kodierten zellulären PrP (PrP C) in die pathologische β-Faltblatt-reiche PrP Sc Konformation 2,3. Selbstausbreiteproteinaggregate wurden auch in Pilzen, die wichtige Eigenschaften mit Säugetier Prionen 4,5 austauschen können. Zusätzlich sind Säuger Prionen bewegen kann, von Zelle zu Zelle und infizieren naiven Zellen 6,7. Während PMDs other als TSE nicht infektiös sind, teilen sie sich eine gemeinsame pathogene Prinzip mit Prionenerkrankungen 8,9. Obwohl die Proteine, die jeder der PMDs verknüpft sind nicht in der Struktur oder Funktion bezogen, sie bilden alle Aggregate über eine Kristallisationsartigen Prozess namens nukleierten oder impft Polymerisation; außerdem proteinhaltigen Samen wachsen durch die Einstellung ihrer löslichen Isoformen 2,10,11. Die Effizienz der Selbst Propagate variiert in vivo in Abhängigkeit von den intrinsischen Eigenschaften des Proteins, die zusammen mit zusätzlichen zellulären Faktoren wie molekulare Chaperone bestimmen letztlich Raten Aggregat Nukleation, Säen, Fragmentierung und Ausbreiten 12-15. Daher muss es eine feine Balance zwischen diesen Faktoren, die eine effiziente Vermehrung von Proteinaggregation ermöglicht existieren. Dies könnte auch erklären, warum nur einige amyloidogenen Aggregate Hafen der Eigenschaften eines Prion und damit nicht alle PMDs sind ansteckend. Prionen scheint &quot;Top-Performer&quot; o vertretenfa breites Spektrum von sich selbst replizierenden proteinartige Aggregate, die ihnen ein leistungsfähiges Werkzeug zur PMDs 8,13 zu studieren. Interessanterweise hat die Toxizität mit krankheitsbedingten Aggregaten assoziiert oft ein nicht zellautonomen Komponenten 16,17. Dies bedeutet, dass sie Nachbarzellen, die das entsprechende Gen nicht exprimieren, im Gegensatz zu einem rein Zelle autonome Wirkung, was bedeutet, daß nur die Zellen, die das Gen weisen die spezifischen Phänotyp beeinflussen. Dies wurde überzeugend von gewebespezifische Expression nachgewiesen oder knock down der entsprechenden Proteine ​​in zahlreichen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen 18-26. Verschiedene Mechanismen wurden als Grundlage für diese nicht-zellautonomen Toxizität PMDs einschließlich vermindert Nährstoffversorgung Ungleichgewicht in neuronalen Signalisierung Glutamatexzitotoxizität und neuroinflammation 16,27,28 vorgeschlagen. Zusätzlich ist ein Prion artige Bewegung der Krankheit gebundenen Aggregate zwischen Zellen might diesem Aspekt 29,30 tragen. Zunehmende Hinweise darauf, dass andere Proteineinschlüsse als Prionen von Zelle-zu-Zelle zu übertragen, was erklären kann, die charakteristische Verteilung der Pathologie in vielen PMDs 30-36 beobachtet. Es hat sich jedoch noch nicht bestimmt werden, ob es einen klaren ursächlichen Zusammenhang zwischen interzelluläre Bewegung Krankheit Proteine ​​und die toxische Wirkung auf Nachbarzellen. Daher ist ein besseres Verständnis der zellulären Wege, die Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität zugrunde notwendig und wesentlich für die Entwicklung neuartiger Therapeutika. Allerdings sind viele Aspekte der Prionartigen Ausbreitung und zellulären Faktoren, die Zell-zu-Zell-Übertragung von fehlgefalteten Proteinen Metazoen beeinflussen nicht gut verstanden, insbesondere auf der Ebene der Organismen. Der Nematode Caenorhabditis elegans hat mehrere Vorteile, die das Potential bieten entdecken Sie neue Facetten des Prion-ähnlichen spreading in Metazoen 17. Es ist transparent, so dass für in vivo-Tracking von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​im lebenden Organismus. Darüber hinaus werden viele zelluläre und physiologische Prozesse durch Krankheit betroffen von Würmern die menschliche konserviert und C. elegans eignet sich auch für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen und molekularen und biochemischen Analysen 37-39. Genau 959 Körperzellen bilden die erwachsenen Hermaphroditen mit einem einfachen Körper Plan, der noch mehrere verschiedene Gewebearten, einschließlich Muskeln, Neuronen und Darm hat. Um eine neue Prion-Modell in C zu etablieren elegans, entschieden wir uns für exogen drücken die gut charakterisiert Glutamin / Asparagin (Q / N) -reichen Prion Domain NM der cytosolischen Hefe-Prion-Protein Sup35, da gibt es keine bekannten endogenen Prion-Proteine ​​in Würmern 4,40. Hefe Prionen waren von unschätzbarem Wert bei der Aufklärung grundlegender Mechanismen von Prionenreplikation 41-44. Darüber hinaus ist die Tanne NMst cytosolische Prion-ähnliches Protein, die gezeigt wurde, um den gesamten Lebenszyklus eines Prion in Säugetierzellkulturen 45,46 rekapitulieren. Ebenso wird, wenn in C exprimiert elegans, die hervorragend an die unterschiedlichen Anforderungen für die Vermehrung in Metazoen-Zellen im Vergleich zu Hefezellen und wiesen Merkmale von Prion biology 40. NM Aggregation wurde mit einem tiefen toxischen Phänotyp verbunden sind, einschließlich der Störung der mitochondrialen Integrität und das Aussehen angenommen Sup35 Prion Domäne verschiedene Autophagie bezogenen Vesikel auf zellulärer Ebene sowie embryonale und larvale Stillstand, Entwicklungsverzögerung, und eine weit verbreitete Störung der Proteinfaltung Umgebung auf der organismischen Ebene. Auffallend ist, dass das Prion-Domain weist Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität, Auswirkungen auf benachbarte Gewebe, bei denen das Transgen nicht ausgedrückt. Ferner ist der vesikulären Transport des Prion Domäne innerhalb und zwischen den Zellen in Echtzeit überwacht &lt;em&gt; In-vivo-40. Hier beschreiben wir, wie man Prion-ähnlichen Verbreitung in C prüfen elegans. Wir werden erklären, wie die intra- und interzellulären Transport von Vesikeln, die das Prion-Domäne mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen. Wir werden die Verwendung von gewebespezifischen Klapp Sensoren unterstreichen und ubiquitär exprimiert Stress Reportern zu Zelle autonomen und nicht autonomen Zell Effekte auf zellulärer Fitness zu bewerten. Schließlich werden wir den Ablauf einer vor kurzem durchgeführt genomweiten RNA-Interferenz (RNAi) Bildschirm beschreiben, neue Modifikatoren von Prion-induzierte Toxizität zu identifizieren. In Kombination können diese Methoden helfen, necken neben genetischen Pfade in der interzellulären Bewegung von Proteinen und ihre nicht zellautonomen Toxizität beteiligt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Überwachung interzelluläre Ausbreitung von Prionen-ähnlichen Proteinen durch In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung Transgenen C. elegans Linien die Prion-Domäne exprimieren, sind besonders gut für die Analyse von bestimmten Aspekten der Prion-ähnlichen Proteine, zB Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität geeignet. Die Transparenz der Tiere ermöglicht Verfolgung von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​aus dem lebenden Organismus...

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Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K Aufrufe.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Serie: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Erstellen Definierte gasförmigen Umgebungen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf Studieren<em&gt; C elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine Mit dem Metazoan Modellorganismus