In den letzten Jahrzehnten wurde die Lebensspanne der Menschen aufgrund der Verbesserung des Lebensstandards und der Fortschritte in der medizinischen Wissenschaft verlängert. Das Alter ist der größte Risikofaktor für viele lebensbedrohliche Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington. Hier zeigen wir Methoden unter Verwendung einiger vielseitiger neuer Methodenmodelle, einschließlich hyperaktiver Ionenkanal-induzierter Nekrose und Proteinaggregate, die Neurotoxizität induzieren, um den zellulären molekularen Mechanismus der neuronalen Degeneration zu überwachen und zu sezieren.
Peak gesunde Larven aus machen vier und machen drei Newton Nematoden auf Nematoden Wachstumsmedienplatte, Siebung mit E.Coli mit sezierenden Stereomikroskop. Platzieren Sie zehn und vier Nematoden, parasitäre Enzymplatte und wachsen Sie sie bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius. Fünf Tage später die Platte mit 1 ml und 9 Puffer waschen und die Tiere in 1,5 ml Rohr sammeln.
Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 30.000 g und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 0,5 ml Beschichtungslösung hinzu. Die Beschichtungslösung wird bei Raumtemperatur gelagert.
Wirbel und überwachen regelmäßig, bis sie sich alle aufgelöst haben. Vermeiden Sie die Beschichtung für Zeiträume von mehr als fünf Minuten. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 10.000 g und entfernen Sie den Überstand.
Zweimal die Palette mit 1 ml und neun Puffern waschen. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 10000 g und entfernen Sie den Überstand. Nach dem Waschen die Eier in 200 MikroliterM9-Puffer wieder aussetzen und 25 Minuten bei 34 Grad Celsius in einem Wasserbad bebrüten.
Pflegen Sie eine separate Gruppe von Eiern bei 20 Grad Celsius. Pipette 100 Mikroliter mit Kontroll- oder Hitzeschock behandelten Eiern und legen Sie sie auf ungesättigte 10 GN Platte. Jeder Teller enthält mindestens 100 bis 200 Eier.
Die Eier bei 20 Grad Celsius bis zum Schlüpfen bebrüten. Verwenden sie und M9 Puffer, um Platten zu waschen und L1 Leben und Nematoden in 1,5 ml Tube zu sammeln. Zentrifuge bei 10.000 g für 30 Sekunden.
Entfernen Sie den Überstand und behalten Sie die Palette bei. Fügen Sie 100 Mikroliter 20 Millimolar M9 LevangialPuffer hinzu, um die Nematoden zu anästhesieren. Pipette 10 Mikroliter M9-Levangialpuffer, die L1-Uhr enthalten und in 2%agar-ls Punkt setzen Sie sanft einen Deckelrutsch auf der Oberseite der Probe.
Beobachten Sie die Uhr mit der DIC-Mikroskopie. Scanning Degeneration der 630 Rezeptorneuronen durch Zählen von Zellen mit einem charakteristischen virtuellen unterstützten Aussehen dieses Nematoden. Synchronisieren Sie Nematoden, indem Sie 15 bis 20 L4-Larven von jeweils einem Stamm auf zuerst Bakterien C und dann GENETISCH veränderte Platten auswählen und übertragen.
Inkubieren und lassen Sie die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius wachsen. Führen Sie die tägliche Vorkonditionierung für 30 Minuten durch Übertragung der Platten in einem Inkubator auf 34 Grad Celsius. Dann kehren Sie die vorkonditionierten Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius zurück.
Fügen Sie 10 Mikroliter von 20 Millimolar M9 Levangial Puffer Tropfen in der Mitte der Agar-ls-Spot. Wählen Sie die jeweiligen transgenen Nematoden aus und übertragen Sie sie in M9-Lewangialtropfen. Platzieren Sie 20 bis 30 Nematoden pro Tropfen.
Legen Sie den Deckel vorsichtig auf die Oberseite der Probe. Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Nagellack, um die Feuchtigkeit während des gesamten Bildgebungsprozesses zu erhalten. Mit einem Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer Kamera können Sie Ihre Studienbilder des Kopfbereichs mit 20 x Vergrößerung erkennen und erfassen.
Überwachen Sie sieben Tage transgene Nematoden auf den tod von dopaminergen neuronalen Zellen. Messen Sie die neuronalen Policul-Aggregate im Kopfbereich von vier Tage alten transgenen Tieren, die 240 Fusionen mit lebenden Menschen ausdrücken. Nekrotische Zelltod induziert ehyperaktive Ionenkanäle ist die wichtigste in Nematoden, die ehemalige Hitzeschock Vorbedingung Eier hat.
Hitzeschock-Voraussetzung, die eine Vorhersage gegen Alpha-Synuclein-induzierten Zelltod bei sieben Tage alten erwachsenen Hermaphrodit fördert und Q40-Proteinaggregate im Kopfbereich von vier Tage alten Erwachsenen verringert. Das Altern ist eine Folge von Schäden, die durch die allmähliche Degeneration der Zell- und Gewebehomöostase verursacht werden. Daher ist das Verständnis der Manipulation des altersbedingten neuronalen Abbaus oberste Prioritäten.
Die vorgestellten Techniken in Kombination mit genetischen und pharmakologischen Untersuchungen könnten zu einer Meldung normaler Zelltodmodulatoren mit potenziellem therapeutischem Interesse führen.
