Wir möchten die aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Link-Labor, die für die Protokolle dazu beigetragen, hier beschriebenen, insbesondere Gin Fonte, der das ursprüngliche Verfahren entwickelt danken. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von den NIH (AG12423) und der Alzheimer Association (Zenith Award) zu CDL unterstützt

1) Vorbereiten Nematode Growth Medien Platten für Lähmungen Assay. Paralysis Assays basieren auf dem Standard Nematode Growth Media (NGM) Platten routinemäßig für C eingesetzt durchgeführt elegans Vermehrung und Genetik (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave der NGM Lösung mit NaCl, Agar und Pepton in einem Erlenmeyerkolben und fügen Sie die entsprechenden Mengen an sterile CaCl 2, Uracil, Cholesterin, 1M MgSO 4 und 1 M KPO 4. Aliquot von 10 ml Flüssigkeit NGM in jeweils 60 mm x 15 mm Petrischale. Lassen NGM über Nacht erstarren bei Raumtemperatur. </li><li> Wenn der Test für die Wirkungen von Verbindungen / Extrakte, Aliquot des Extraktes auf jede Platte und mit einem Spreader zur gleichmäßigen Verteilung der Auszug über die Oberfläche der Platte. Lassen Sie zu extrahieren, um über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Mehr als 1 ml benötigen mehr Zeit zum Trocknen. </li><li> Spot jede Platte mit 250 ul E. coli-Stamm OP5O in LB-Medium über Nacht bei einer optischen Dichte von 0,4-0,6 gewachsen. Lassen Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. </li></ol> Relevante Variablen Das Alter der Platten hat einen signifikanten Einfluss auf die Lähmung Assay, da ältere Platten zum Austrocknen neigen. Verwenden Platten gegossen innerhalb einer Woche nach Lähmung Assay. Für optimale Ergebnisse, Platten gießen 3-4 Tage vor Beginn der synchronen Wurm Bevölkerung [siehe (2) unten]. Für jedes Experiment, verwenden Sie nur Platten aus der gleichen Charge gegossen. Das Ändern der Größe der Rasenfläche (dh gesichtet vs Spread) und / oder die Art der Bakterien verändern auch das Verhalten der Würmer. Paralysis Assays können unter Verwendung alternativer E. werden coli-Stämme als Nahrungsquelle (z. B. das HT115 Belastung in der Fütterung RNAi-Experimente verwendet werden), aber das kann die Kinetik der Lähmung ändern und erfordern somit angemessene interne Kontrollen. 2) Herstellung von Age-Synchron-Worm Populationen Der Stamm CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aß Minigen + rol-6 (su1006) Markergen] X wird am häufigsten für die Bestimmung von Aß-induzierte Lähmungen Dieser Stamm und andere transgene Modelle stehen zur Verfügung. die akademische Forscher für eine geringe Gebühr von der Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Um das Alter Synchronität der Test Bevölkerung ist es besser, mit einem synchronisierten elterlichen Generation beginnen zu maximieren. Eine Woche vor der Einleitung des Lähmung Test des Tests Bevölkerung, mit einem Platin-Wurm-Picker auf 20-30 gravid Erwachsenen auf mehrere 10 cm NGM-Platten mit OP50 für eine 2-stündige Eiaufstrich Übertragung lag bei 16 ° C (der permissiven Temperatur für CL4176 ). Entfernen Sie die gravid Erwachsenen und damit die Nachkommenschaft zu 7 Tage lang wachsen, in welcher Zeit sie werden &quot;zweiten Tag&quot; gravid Erwachsene. </li><li> (Tag 1) Der zweite Tag gravid Erwachsene werden verwendet, um die alters-Synchron-Test der Bevölkerung vorzubereiten. Für jeden experimentellen Zustand des Objekts ist dreifacher Ausfertigung Platten mit 50-75 Jahren-Synchron-Würmern zu generieren. Mit einem Platin-Wurm-Picker, Transfer 10-12 der Tag 2 gravid Erwachsenen auf 60 mm (10 ml Volumen) NGM-Platten mit OP50 gesichtet. Lassen Sie die Würmer Eier bei 16 ° C lag 2 Stunden, dann wählen Sie die Erwachsenen und lassen Eier auszubrüten und wachsen bei 16 ° C. An dieser Stelle ist es am besten jemanden, der nicht sein wird Scoring die Platten, um sie Code haben, so der Torschütze wird blind sein, um experimentellen Bedingungen. </li></ol> Relevante Variablen Das Stadium der embryonalen Entwicklung, wenn Eier gelegt werden (~ der 26-Zell-Stadium für Wildtyp-Würmern unter optimalen Bedingungen) ist eine Funktion von erwachsenen Alter und Ernährung. Wenn die gravid Erwachsene zur Vorbereitung des Tests Bevölkerung genutzt ältere oder verhungert sind, wird später Eier gelegt werden, wodurch das Alter Synchronität der Bevölkerung und die Reproduzierbarkeit der Lähmung Kinetik. Es ist wichtig, als Mono-axenic (dh nur OP50 Bakterien) Kulturen verwendet werden (mikrobielle Verunreinigungen stark beeinträchtigt diesen Test) und die Reproduzierbarkeit ist am höchsten, wenn der dreifach Platten ähnliche Anzahl von Würmern haben. 3) Transgene Induktion und Paralysis Assay <ol><li> (Tag 3) Hochschalten Platten bis 25 ° C 48 Stunden nach dem Ende des Synchron-Ei legen, Würmer sollten bei der dritten Larvenstadium (L3) werden. Die Platten sollten ohne Stapeln in einem 25 ° C Inkubator, damit alle Platten bis 25 ° C zur gleichen Zeit zu erreichen arrangiert werden. </li><li> (Tag 4) Begin der Punktwertung der Lähmung der Würmer (Stamm CL4176) bei 18-20 Stunden nach Beginn der Hochschalten. Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Würmer in der Bevölkerung das vierte Larvenstadium (L4) Stadium erreicht haben. Weiter Scoring in zwei-Stunden-Schritten, bis alle Würmer auf jede der Platten gelähmt sind. Aus unbekannten Gründen ist Lähmung nicht einmal über den Körper Länge: Kopfbereich ist der letzte Teil des Wurms aufhören zu bewegen. So wORMs, die vor kurzem Lähmung eingeleitet haben nicht über die Platte zu übersetzen, sondern können ihre Köpfe zu bewegen, dabei werden Bakterien in ihrer vorderen und Verlassen eines &quot;Halo&quot; geräumte Bakterien. Diese Würmer werden immer völlig gelähmt, und deshalb Würmer mit Halos sind kategorisiert als gelähmt. Einige Würmer werden nicht Halos, aber auch nicht zeigen spontane Bewegung; diese werden durch Drängen mit dem Wurm Picker getestet. Wenn ein prodded Wurm nicht eingehen kann eine Ganzkörper-Wellenausbreitung auf Drängen ist es auch erzielt, wie gelähmt. Für eine effiziente Scoring, ist es am einfachsten, den gelähmten Würmer zu einer unbefleckt Sektor der Platte zu bewegen, so dass sie nicht ungewollt rescored das nächste Scoring Zeitraum. (Dies ermöglicht auch mis-kategorisiert Würmer Bewegung zeigen, so dass ein Scoring-Korrektur). </li><li> Zur Erzeugung einer Lähmung Kurve zu jedem Zeitpunkt den Anteil der Würmer auf jeder Platte, die nicht gelähmt ist, um einen Prozentsatz umgewandelt, und die durchschnittliche &quot;unparalyzed&quot; Prozentsatz der Zeit von Hochschalten Einleitung dargestellt. (Die Begründung für das Plotten auf diese Weise, dass die resultierende Kurve formal analog zu einem Überleben Kurve ist, und kann daher mittels Standard nicht-parametrische Statistiken Überleben werden.) </li></ol> Relevante Variablen Das Hochschalten von transgenen myo-3/Aβ Würmer auftreten müssen, bevor sie Mitte der L4 Bühne für Lähmungen erreichen eingeleitet, wie die myo-3 Promotor ist entwicklungsmäßig reguliert werden, und hat maßgeblich Ausdruck in späten L4 oder erwachsenen Würmer reduziert. Ebenso ist Ausdruck dieses Transgen blockiert, wenn Würmer ausgehungert werden, so ist es wichtig, dass die Würmer während des gesamten Experiments gut genährt sind. Wir haben noch nie einen gelähmten Wurm unter allen Bedingungen zu erholen beobachtet, und nach 12-16 h Hochschalten, alle CL4176 Würmer lähmt, auch wenn sie auf 16 ° C sind heruntergeschaltet In Belastung CL4176, um eine ausreichende Hochregulation der Transgenexpression Lähmung kann bei niedrigeren Temperaturen auftreten (dh 20-25 ° C), obwohl der Zeitpunkt der Lähmung wird verändert werden. Die Lähmung ist abhängig von der spezifischen transgenen Stamm (wir haben myo-3/Aβ Stämme mit schneller und langsamer auf als CL4176 gebaut), so mit alternativen Stämme der Scoring-Fenster muss unter Umständen angepasst werden. 4) Repräsentative Ergebnisse In Abbildung 1 ist ein Grundstück von einer Lähmung Kurve für CL4176, sowohl unbehandelt und ausgesetzt und 6,27 mM Koffein (Endkonzentration in NGM-Platte). Diese Behandlung führt zu einer statistisch hoch signifikante Verzögerung in Lähmung von ca. 4 Stunden, die wir interpretieren als Indikator für die Unterdrückung von Aß Toxizität in diesem Modell. In Abbildung 2 ist ein unabhängiges Experiment Untersuchen der Auswirkungen von Cafestol, eine andere Verbindung in Kaffee zu finden. Dieses Grundstück ist typisch für Behandlungen, die nicht Einfluss haben Aß Toxizität. Beachten Sie, dass in beiden Versuchen etwa die Hälfte der unbehandelten CL4176 Bevölkerung bei 24 Stunden sind wie gelähmt, und die Lähmung ist komplett um 28 Stunden. Dies sind typische Zeitrahmen für die Lähmung der Kontrolle CL4176 Populationen. Wesentliche Abweichungen von diesem Zeitpunkt sind bezeichnend für veränderte Umgebungsbedingungen oder spontane Deletion der Transgen-Kopien. (CL4176 enthält eine chromosomal integrierte transgene Array mit mehreren Kopien des Transgens myo-3/Aβ. Obwohl diese transgenen Array wird in der Regel recht stabil, der die Verbreitung des Stammes bei Temperaturen&gt; 16 ° C wird für seltene Würmer, die eine unterzogen haben wählen spontane Löschung von Transgenen, die sich in Varianten, die Aß Ausdruck und langsamer Lähmung Ergebnisse reduziert werden.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Paralysis Kurve für DMS CL4176 Würmer unbehandelt oder ausgesetzt und 6,27 mM Koffein (Sigma). Die angegebenen Zeiten sind von der Einleitung des Temperatur Hochschalten. Fehlerbalken = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Paralysis Kurve für CL4176 Würmern ausgesetzt auf 0,48 mM Cafestol (Sigma). Fehlerbalken = SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

Das Protokoll wir beschrieben haben, können effektiv zum Testen der Auswirkungen von Verbindungen auf Aß Toxizität verwendet werden. Veröffentlicht Beispiele sind die Effekte von Ginkgo biloba-Extrakt Bestandteile (Wu et al. 2006) und Reserpin (Arya et al. 2009). Verbindungen, die Schutz gegen Aß Toxizität in anderen Systemen haben, haben auch gezeigt, dass sein Schutz in diesem Modell (zB Memantin, unsere unveröffentlichte Ergebnisse). Ein wichtiger Grund für die Erstellung dieses Modells ist, dass die gut entwickelten genetischen und molekularen Werkzeugen in C verfügbar elegans kann verwendet werden, um Mechanismen der Aß Toxizität untersucht werden. So können die Auswirkungen spezifischer Mutationen auf Aß Toxizität untersucht (zB den Effekt der Reduzierung Insulin-like-Signalisierung durch die Einführung einer daf-2 loss-of-function-Mutation, Florez-McClure et al. 2007), und dieses Modell kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen der Überexpression Transgene (Fonte et al. 2008) zu untersuchen. Wir haben vor kurzem umfangreiche Verwendung dieses Modells gemacht, um die Auswirkungen auf die Toxizität der einzelnen Aminosäure-Substitutionen in Aß (unveröffentlichte Daten) zu untersuchen. Die transgenen Modell hier beschriebenen Tests die Wirkung einer akuten Aß Ausdruck auf Muskel-Zell-Funktion. Zur Zeit der Lähmung Muskelzellen und deren Sarkomer sind intakt; die Lähmung Phänotyp ist nicht das Ergebnis einer Muskelzelle Tod. Doch nach der Lähmung (~ 48 Stunden nach der ersten Hochschalten) gibt es einen Abbau der Muskeln, Integrität und schließlich zum Tod der Würmer. Wir haben nicht diesen nachgeschalteten Wirkung von Aß Ausdruck untersucht oder verwendet es als eine Toxizität Marker. Die induzierbare Aß Ausdruck hier beschriebene Modell ist nicht geeignet für die Untersuchung von Behandlungen, die β-Amyloid-Bildung per se modulieren. Obwohl transgene Würmer mit konstitutiver Aß Ausdruck Form leicht erkennbar Amyloid-Ablagerungen (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), transgene Würmer mit induzierbarer Aß Ausdruck selten Amyloid-Ablagerungen und die Lähmung Phänotyp scheint unabhängig von Amyloid-Ablagerung (Drake et al. 2003). Unsere Ergebnisse stimmen mit der Auffassung, dass die akute Toxizität von induzierten Aß Ausdruck ergibt sich aus der Ansammlung von löslichem oligomeren Aß, nicht Amyloid-Ablagerung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenzien </td><td> Quantity/2L </td><td> Unternehmen / Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL in ddH 2 O </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 2mg/mL in ddH 2 O </td></tr><tr><td> Cholesterin </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 5mg/ml in Ethanol (nicht Autoklav) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL in ddH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50 mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL in ddH 2 O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyerkolben </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

Akkumulation des β-Amyloid-Peptid (Aß) wird allgemein angenommen, eine zentrale Rolle bei der Induktion der Alzheimer-Krankheit, sondern den entsprechenden Mechanismus (s) der Toxizität sind noch unklar. Aß ist auch intramuskulär in Inclusion Body Myositis, eine schwere menschliche Myopathie hinterlegt. Die intensiv studiert Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann transgen entwickelt werden, um menschliche Aß Ausdruck zu bringen. Je nach Gewebe-oder Timing der Aß Ausdruck können transgene Würmer leicht messbaren Phänotypen, die als read-out von Aß Toxizität dienen. Zum Beispiel haben transgene Würmer mit pan-neuronalen Aß Ausdruck Mängel ist assoziativen Lernens (Dosanjh et al 2009.), Während transgene Würmer mit konstitutiver Muskel-spezifische Expression zeigen eine progressive, altersabhängige Lähmung Phänotyp (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Eine besonders nützliche C. elegans Modell beschäftigt temperatursensitive Mutation in der mRNA-Surveillance-System auf Temperatur-induzierbaren Muskel Ausdruck einer Aß Transgen-Ingenieur, was zu einer reproduzierbaren Lähmung Phänotyp der Temperatur Hochschalten (Link et al. 2003). Behandlungen, die gegen Aß Toxizität in diesem Modell [z. B. Ausdruck einer schützenden Transgen (Hassan et al. 2009) oder durch Einwirkung von Ginkgo biloba-Extrakten (Wu et al. 2006)] reproduzierbar verändern die Rate der Lähmung durch die Temperatur Hochschalten dieser transgenen induzierten Würmer. Hier beschreiben wir unsere Verfahren zur Messung der Geschwindigkeit der Lähmung in diesem transgenen C. elegans-Modell, mit besonderem Augenmerk auf experimentellen Variablen, dass diese Messung beeinflussen können.

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Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Die intensiv studiert Fadenwurm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Kann transgen entwickelt werden, um die menschlichen β-Amyloid-Peptid (Aß) auszudrücken. Induzierte Expression von Aß in<em&gt; C. elegans</em&gt; Muskels führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Lähmung Phänotyp, die verwendet werden, um Behandlungen, die Aß Toxizität modulieren überwacht werden können.

Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.3K Aufrufe.  University of Colorado. Die intensiv studiert Fadenwurm Caenorhabditis elegans Kann transgen entwickelt werden, um die menschlichen β-Amyloid-Peptid (Aß) auszudrücken. Induzierte Expression von Aß in C. elegans Muskels führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Lähmung Phänotyp, die verwendet werden, um Behandlungen, die Aß Toxizität modulieren überwacht werden können.

Serie: Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...