The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Herstellung des Instruments, Substrate, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Handhabung von Siliciumnitrid (Si 3 N 4) Fenster. <ol><li> Öffnen der Kapsel leicht durch Zusammendrücken eines Endes, die das Fenster in solcher Weise, dass das Fenster sich nicht einklemmen, während sich das andere Ende der Kapsel mit der anderen Hand. </li><li> Überprüfen Sie ein Paar umgekehrt zu spitzen Pinzette unter Stereomikroskop stellen Sie sicher, gibt es keine Haft, Lücken oder Kurven an der Spitze. Andernfalls können die Fenster durch die Pinzette oder gebrochen werden wegfliegen von ihnen während der nachfolgenden Schritte. </li><li> Entfernen Sie das Fenster aus der Kapsel durch vorsichtiges Greifen der Rahmen des Fensters mit einer Pinzette unter leichtem Zusammendrücken der Kapsel in der Nähe des offenen Endes Anlegen von Druck in einer Richtung, so daß die Kapsel breiter zu machen, wo die Ränder des Fensters müssen kommen. </li></ol></li><li> Fenster Vorwäsche (optional). <ol><li> Wenn gewünscht, Vorwäsche Fenster durch leichtes Eintauchenin destilliertes Wasser für 5 Sekunden, gefolgt von 2 min waschen in 70% Ethanol und 2 min waschen in 100% Ethanol. </li></ol></li><li> Das Anbringen und Sterilisieren Fenster auf der Kulturschale. <ol><li> Um die Fenster angebracht werden kann, stellen Sie das Fenster mit der flachen Seite nach oben auf den Boden der Kulturschale, legen Sie ein Stück Klebeband auf einer sauberen Glasobjektträger. Schneiden Sie etwa ein Viertel Zoll-Streifen aus den langen Seite des Bandes. Nehmen Sie ein Stück Klebeband an der kurzen Seite (auf ⅛ &quot;durch ¾&quot;) mit einer sauberen Rasierklinge. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Scheibe der Band an den Rand des Gitters oder Fenster gelten. Verwenden Sie genug, um sicher zu halten ist, ohne dabei die Fensteröffnung selbst. Manipulation der halten Band mit einer Pinzette, setzen Sie das Fenster nach unten auf den Boden der Kulturschale. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette auf Band auf den Boden der Kulturschale fest haften. </li><li> Übernehmen Sie ein anderes Band Streifen zu dem anderen Rand und halten diese auf den Boden fest mit der Spitze der Pinzette. </li><li> Nachdem alle FensterKlebeband, sterilisieren Fenster in Kulturschalen mit ultraviolettem (UV) Strahlung. Erreichen dies, indem Sie das Gericht unter der UV-Lampe in einer Steril etwa 1 Stunde. </li><li> (Optional) Wenn Fenster mit Poly-Lysin vorbeschichtet werden sollen, müssen so folgende Fenster Sterilisation. Bestreichen Sie die Fenster mit 10 ul sterilem 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung für 1 h in einem 37 ° C Inkubator und dann spülen Sie die verbleibende Lösung mit dem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Bereiten Puffer für letzten Waschen vor XFM. <ol><li> Bereiten entweder ein Tris-Glucose oder Piperazin- N, saccharose N &#39;-bis (ethansulfonsäure) (PIPES) Puffer frei von Spurenmetallen mit Osmolalität und pH äquivalent Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) ohne Calcium und Magnesium. Verwenden Sie eine dieser Puffer Zellen spülen, nachdem die Zellen chemisch fixiert. <ol><li> Um die Tris-Glucoselösung (10 mM Tris, 260 mM Glucose, 9 mM Essigsäure) machen hinzuzufügen 1,4 g Glucose, 36 mg Tris-Base und16 ul Essigsäure und 20 ml Reinstwasser. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Keine pH Einstellung erforderlich ist. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche. </li><li> Um die Rohre-Saccharose (20 mM PIPES, 200 mM Saccharose) hinzufügen 0,18 g PIPES und 2,0 g Saccharose in 20 ml Reinstwasser und der pH-Wert auf 7,4 mit kleinen Mengen von konzentrierter Essigsäure. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche. HINWEIS: Der Grund, zu vermeiden, mit PBS in der letzten Spülung ist, dass die Konzentration von Phosphat, Chlorid und Kalium in PBS so hoch, daß sie mit XFM stören, wenn sie nicht vollständig vor dem Trocknen an der Luft entfernt werden. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Puffer für Zell Beschichtung. <ol><li> Bereiten Sie oder nehmen Sie alle Medien, wie RPMI-Medium 1640, 1x Trypsin-EDTA-Lösung, D-PBS, und andere Reagenzien, wie für die jeweilige adhärenten Zelllinie benötigt, wie sie normalerweise für die Passage der adhärenten o Zellen durchgeführt werdenf Interesse, und wärmen Sie sie auf 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Überzug von Zellen <ol><li> Zu dem sterilisierten Kulturschale gegeben, die Fenster in der Haube mit laminarer Strömung, sanft hinzuzufügen Medien (10 ml für eine 100 mm-Kulturschale), entlang der Seite der Kulturschale in einem Winkel geneigt ist. Vermeiden Sie unnötige Oberflächenspannung oder Fallenmedien direkt auf Oberfläche des Siliziumnitrid-Fenster. Als Medium wird hinzugefügt, langsam entlasten den Neigungswinkel zu beschichten das Gitter und Fenster mit Medien. </li><li> Bereiten Sie die adhärenten Zelllinie von Interesse angemessen, Trypsinierung oder Abkratzen der Zellen aus der Platten wie gewohnt für Passagieren des Zelllinie. Führen Sie alle Zellzählung oder andere Vorbereitung notwendig, bevor die Zellen an der frischen Platte. </li><li> Hinzufügen von Zellen in die Kulturschale mit Fenstern mit einer Zelldichte, die benötigt wird, um normalerweise zu erreichen 50% -70% Konfluenz innerhalb 24-72 Stunden, und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. </li&gt; <li> Wachstum der Zellen zu beobachten gelegentlich unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops, bis die gewünschte Zelldichte (in der Regel 50% bis 70% Konfluenz) erreicht wird. </li></ol> 3. Fixierung von Zellen <ol><li> Ansetzen 4% Paraformaldehyd in D-PBS durch Verdünnen eines gekauft Lager (wie 25% Paraformaldehyd) und Einstellen des pH auf 7,4 mit Essigsäure (Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid zu der Probe zu vermeiden). </li><li> Wenn Zellen erzeugt worden sind, wie gewünscht, und alle Vitalfarbstoffe (wie Hoechst) zur Anwendung, und abgebildet wird, entfernen Sie die Medien durch leichtes Ansaugen, Kippen der Schale in einem Winkel von 45 ° mit einer Hand, und Absaugen von Hand Pipette mit der anderen . Hinweis: Alternativ zum Pipettieren verbrauchte Medien, ist eine Alternative zu dem Fenster abholen, tauchen Sie das Fenster in Mikrozentrifugenröhrchen mit D-PBS zweimal und dann legen Sie sie in ein neues Kulturgefäß mit Fixiermittel-Lösungen für 20 Minuten, gefolgt von 2-mal PBS waschen die Rest Fixiermittel zu entfernen. Wenn dies gewählt wird, gehen direkt zu Schritt 3.5. </li><li> Spülen Sie die Schale vorsichtig mit D-PBS und sofort zu ersetzen, die entfernte Flüssigkeit durch vorsichtiges Hinzufügen der frischen 4% PFA / PBS, während das Gericht in einem Winkel von 45 ° in Richtung der Seite der Schale halten, Pipettieren, und langsam entspannen den Neigungswinkel zu ermöglichen die Fixierungslösung, um die Fenster zu decken. Halten der Zellen mit dem Fixiermittel für 20 min bei RT überzogen. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch leichtes Ansaugen, wieder wie oben, Kippen der Schale leicht und Absaugen von Hand. </li><li> Bringen Sie die Flüssigkeit entfernt durch leichtes Hinzufügen von einigen der Leitungen / Saccharose-Lösung unter Verwendung der in Schritt 3.3 beschrieben Kipp- und Pipettierverfahren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5. </li><li> Vorbereitung der Materialien für das Trocknen. <ol><li> Sammeln fusselfreien Tücher wie Kimwipes, und ziehen Sie eine aus der Box, so ist es praktisch, sehr schnell und einfach. </li><li> Bereiten Sie eine saubere, nicht-Ebene stelle das Fenster, um zu trocknen. Set aus einer Kautschukgittermatte der Art, in der Elektronenmikroskopie eingesetzt, die Rippen hat, sokann das Fenster an einem Ende gestützt werden, während es trocknet. Das Fenster aus immer auf die Trockenoberfläche geklebt zu halten, während er trocknet und Drain verbleibende Puffer zu der Kante der Probe. </li></ol></li><li> Sorgfältig tweeze das Band, um das Fenster, um das Fenster aus der Flüssigkeit halten angebracht. Rufen Sie Fenster, die aus der Band kommen, indem eine kleine Menge von Leitungen / Saccharose zu erhalten, um zu schwimmen und dann abholen mit den Reverse-Pinzette. </li><li> Vorsichtig (ohne Berührung der Fenster selbst) und gründlich beschmieren überschüssige Leitungen / Saccharose aus dem Rand des Fensters mit einem Kimwipe. Auch beschmieren die Rückseite eingekerbten Bereich mit einem abgerundeten Falte eines Kimwipe. ANMERKUNG: Das Ziel ist es, so wenig Kristallisation von Salzen oder Puffern auf der Oberfläche des Fensters wie möglich haben. </li><li> Stellen Sie das Fenster auf die Gittermatte. Stellen Sie sicher, dass das Fenster nicht auf dem Gittermatte flach, aber aufgestützt auf einer Kante (über die Kämme der Gittermatte) und berühren so wenig des Rastersmat wie möglich. Lassen Sie das Fenster trocken. </li></ol> 4. Proben Montage und Imaging <ol><li> Sobald die Probe getrocknet, überprüfen Sie die Anwesenheit von Zellen an den Fenstern mit einem Lichtmikroskop. Führen Sie diese Prüfung, bevor die Vorbereitung der Proben für den Transport in einem Synchrotron. </li><li> Verpacken Sie die Fenster für den Transport zum Synchrotron-Beamline-Hosting-Experiments. Sanft Anbringung der Fenster mit Klebeband auf beiden Seiten auf einem Glasobjektträger, dann bringt die Glasträger mit Klebeband an der Unterseite eines Kunststoff-Petrischale. Kleben Sie die Petrischale geschlossen. HINWEIS: Vor diesem Zeitpunkt können diese Schritte in einer beliebigen typischen Labor durchgeführt werden. Die folgenden Schritte am besten an einem Synchrotron-Beamline erfolgen. </li><li> Entfernen Sie das Klebeband vom Fenster vorsichtig mit einer Pinzette. Verwenden Sie Nagellack, in einer dünnen gleichmäßige Beschichtung auf dem Rand des Fensters, um die Fenster zu einem Aluminiumhalter durch die Beamline Mitarbeiter an der Synchrotron vorgesehen sichern. </li><li> Legen Sie die Aluminiumhalter ineine kinematische montieren, und dann legen Sie sie in die richtige Position in der Röntgenmikroskop. Montieren Sie die Probe auf einer Konsole den Anschluss an Motortische, innerhalb der Probenkammer an der Beamline. </li><li> Nach dem Verlassen der Probe Röntgenmikroskop Instrument Bereich (einen Stall von Blei gefüllten Wänden), Einrichtung der Scan. Verwendung Strahlrohr spezifische Software, wählen die entsprechende Fläche der Probe zu scannen, während der Anzeige der Position des Röntgenstrahls auf der Probe unter Verwendung einer Kamera mit einer Videofadenkreuz und ausgestattet vororientierte mit nachgeschaltetem Szintillator Kamera. </li><li> Wählen Sie die geeignete Auflösung für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Größe des kleinsten interessierenden Merkmals. Zur Abbildung einzelner Säugetierzellen (~ 20-40 &amp; mgr; m in der Größe), verwenden Sie eine Auflösung von 0,25 bis 0,5 &amp; mgr; m. Zum Abbilden Bereiche von Geweben und Unterscheidung von Zellschichten voneinander Verwenden einer Auflösung von 2-20 um. </li><li> Wählen Sie die passende Verweilzeit für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Menge des metal von Interesse vorhanden. Für einen schnellen Überblick Scan, oder wenn große Mengen an Metallen vorhanden sind, verwenden fly Scans mit Verweilzeiten von 30 bis 300 ms pro Pixel. Wenn wenig Material vorhanden ist, oder Metalle der niedrigen relativen Häufigkeit zu messen, verwenden Schritt Scans mit Haltezeiten von 1-2 Sekunden pro Pixel. </li><li> Programmieren Sie die Scans in die Strahllinie spezifische Software. Erwerben Sie ein Raster-Scan-Bild. Arbeiten Sie zusammen mit den Beamline Mitarbeiter, um die Daten mit einer Software, die die charakteristischen Energiespitzen für jedes Element zu identifizieren analysieren. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Bereichen, einschließlich der Geowissenschaften, Materialwissenschaften und der chemischen Biologie 26-34 nützlich. Fortschritte in der Synchrotron-Röntgenstrahlen und ihre Fokussierung haben sehr hoher Intensität Strahlen erzeugt. Fokussierten Röntgenstrahlen ausreichend ist, um die endogenen Metallen in Zellen existieren nun erregt, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Silizium-Driftdetektortechnologie gemessen werden kann. Und das Studium der ch...

Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht sowohl für die Identität und Menge der in einer Probe vorhandenen Elemente räumlich aufgelöst werden. Einfallenden Röntgenstrahlen, einer größer gewählt als die Elektronenbindungsenergie der schwerste Element von Interesse zu sein, Energie, die Überwindung der Bindungsenergie von Elektronen der inneren Schale an den Kern 1. Dadurch entsteht ein &quot;Loch&quot; in der Elektronenhülle. Als höherenergetischen Elektronen fallen in diese Löcher werden die Röntgenfluoreszenzstrahlung emittiert, dessen Wellenlänge abhängig von der Energie Trennung dieser Orbitale. Da der Energieabstand der Orbitale ist charakteristisch für ein gegebenes Element weist die Röntgenfluoreszenzemission ebenfalls charakteristischen Wellenlängen, abhängig von dem Element. Es ist diese Emission bei einer charakteristischen Wellenlänge, welche die Identifikation der vorhandenen Elemente ermöglicht. Die Kalibrierung der Fluoreszenzintensität ermöglicht die Quantifizierung der vorhandenen Elemente. Röntgenfluoreszenz microscopy (XFM) zunehmend genutzt, zum Teil auf die Entwicklung von sehr brillanten Röntgensynchrotronquellen, wie sie bei Spring-8 in Japan, der Europäischen Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Frankreich und der Advanced Photon Source ( APS) in den USA 2. Diese Quellen liefern eine sehr hohe Intensität von Röntgenstrahlen. Zur gleichen Zeit, Verbesserung der Röntgenoptik, wie Zonenplatte Technologie, erlaubt die Fokussierung dieser Strahlen auf Sub-Mikrometer-Spots, wenn auch eher ineffizient 3. Mit sehr hoher Intensität Strahlen, auch eine relativ kleine Menge an Licht, das konzentriert sein kann, ist ausreichend, um die endogenen Metallen in Zellen anzuregen, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Detektortechnologie gemessen werden kann. So studieren die chemische Biologie der Metalle in der Zelle ist eine Anwendung insbesondere die Verwendung von vielen der jüngsten Entwicklungen in dieser Technik 4-10 macht. Es gibt viele wichtige Faktoren, die in Betracht gezogen werden, während AppLiegen XFM, um die Elementverteilung und Quantifizierung von kultivierten Säugerzellen oder anderen biologischen Proben zu untersuchen. Erstens muss die Probe intakt gehalten werden soll, sowohl strukturell als auch in bezug auf die elementare Zusammensetzung, damit die Messung aussagekräftig zu sein. Zweitens muss die Probe auch in irgendeiner Weise gespeichert, dass sie hart zur Strahlungsschäden, die durch einen fokussierten Röntgenstrahl verursacht werden kann, ist. Eine Möglichkeit, dass eine Probe nur eines dieser Kriterien auf einmal zu erfüllen ist es, sich schnell zu einem glasartigen, amorphen Eis 11,12 eingefroren werden. Schockgefrieren wird oft durch verschiedene Kryokonservierung Techniken wie Tauch Einfrieren oder Hochdruckgefrier 13-16 erreicht. Es ist allgemein anerkannt, dass die Kryokonservierung bewahrt Gesamtzellarchitektur und chemischen Zusammensetzungen in biologischen Proben so nahe nativen Zustand möglich. Chemische Fixierung, auf der anderen Seite, aufgrund der langsamen und selektive Durchdringung von Fixiermittel in Zellen und Geweben als well als nachträgliche Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit, können verschiedene zelluläre Ionen besonders die diffundierbare Ionen wie Cl, Ca und K, um ausgelaugt werden, verloren oder verlegt werden, so machen Untersuchung dieser Elemente suboptimal 17-19 ermöglichen. Trotz der klaren Vorteile der Kryo-Fixierung über chemische Fixierung im Allgemeinen, für adhärente Säugetierzellen hat insbesondere die Kryokonservierung verschiedenen Einschränkungen 20-23. Der offensichtlichste ist, dass nicht jede Forschungslabor hat leichten Zugang zu Kryokonservierung Instrumente. Für aktuelle Hochdruckgefriergeräte oder sogar stürzen Gefriergeräte sind teuer und gehören, nur eine Teilmenge der Kryo Einrichtungen, die weit von dem Zellen inkubiert werden kann. Der Vorteil der Kryokonservierung könnte zum Nachteil des Reise Stress auf die Zellen gegeben gehandelt werden. Während also die Kryokonservierung ist sicherlich die härteste Weg, um Proben für die Röntgenfluoreszenzanalyse zu erhalten, ist es sicherlich nicht die zugänglich für alle Forscher, unter allen Umständen;es ist auch nicht immer erforderlich - wenn die Metalle von Interesse sind eng fixierbar Makromoleküle gebunden sind, und die Auflösung, mit der die Probe abgebildet wird größer als die Beschädigung der ultraMikroStruktur, die während der Trocknung auftreten könnte, ist. Eingedenk der Vorbehalte 24 kann chemische Fixierung und Trocknung eine geeignete Wahl sein. Andere Faktoren, die zu einer erfolgreichen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung Test einbezogen korrekte Analyse. Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ist grundsätzlich Röntgenfluoreszenzemissionsspektroskopie kombiniert mit Rasterabtastformat die räumliche Auflösung zu liefern. Die gesammelten Röntgenfluoreszenzemissionsspektren enthalten eine Kombination von überlappenden Emissionsspitzen, den Hintergrund und die elastischen und inelastischen Streuungspeaks des einfallenden Strahls. Software, die die Entfaltungs dieser Beiträge und der Anpassung der Emissionsspitzen ermöglicht, hat zu diesem Bereich 25 schon eine kritische Entwicklung. Auch die Entwicklung und kommerzielle distribution Dünnschicht Standards bekannter Zusammensetzung verwendet, um die Fluoreszenzintensität relativ zur Materialmenge zu kalibrieren, wurde auch sehr wichtig. Dieses Protokoll stellt eine Beschreibung der Herstellung der haftenden Zellen durch chemische Fixierung und Lufttrocknung. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist das Wachstum der Zellen auf den Siliziumnitrid-Fenster, die oft nicht gut an, so dass sanfte Spülung in einer bestimmten Art und Weise der Schlüssel zum Erfolg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Die Fähigkeit der Röntgenfluoreszenzabbildung, um Informationen über biologische Proben bereitzustellen ist abhängig wobei diese Proben in einer Weise, dass sie robust gegenüber Strahlungsschäden auf der Zeitskala des Experiments sind, hergestellt, und doch ihre chemischen und strukturellen Merkmale gut erhalten. Bei der Betrachtung des Ergebnisses einer Probe, die hergestellt wurde wie oben beschrieben und abgebildet wird, ist es möglich zu sehen, dass es eine Variation in der vorhandenen Elemente - was anzeigt,...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K Aufrufe.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

Serie: Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Forschung

Chemie

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Auf dem Weg Routine Kristallstrukturbestimmung von Korrosionsprodukten auf Heritage Kunstobjekte

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

Quantifizierung der Fluoreszenz Röntgendaten mit MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

Wesentlichen Metall Aufnahme in Gram-negativen Bakterien: Röntgen-Fluoreszenz, Radioisotopen, und Zelle Fraktionierung

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

Elementar-Sensitive Detektion der Chemie in Batterien durch weiche Röntgenabsorptionsspektroskopie und resonanten unelastische Röntgenstreuung

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Liganden-vermittelten Keimbildung und das Wachstum von Palladium Metall-Nanopartikeln

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...