Name: preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Herstellung des Instruments, Substrate, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Handhabung von Siliciumnitrid (Si 3 N 4) Fenster. <ol><li> Öffnen der Kapsel leicht durch Zusammendrücken eines Endes, die das Fenster in solcher Weise, dass das Fenster sich nicht einklemmen, während sich das andere Ende der Kapsel mit der anderen Hand. </li><li> Überprüfen Sie ein Paar umgekehrt zu spitzen Pinzette unter Stereomikroskop stellen Sie sicher, gibt es keine Haft, Lücken oder Kurven an der Spitze. Andernfalls können die Fenster durch die Pinzette oder gebrochen werden wegfliegen von ihnen während der nachfolgenden Schritte. </li><li> Entfernen Sie das Fenster aus der Kapsel durch vorsichtiges Greifen der Rahmen des Fensters mit einer Pinzette unter leichtem Zusammendrücken der Kapsel in der Nähe des offenen Endes Anlegen von Druck in einer Richtung, so daß die Kapsel breiter zu machen, wo die Ränder des Fensters müssen kommen. </li></ol></li><li> Fenster Vorwäsche (optional). <ol><li> Wenn gewünscht, Vorwäsche Fenster durch leichtes Eintauchenin destilliertes Wasser für 5 Sekunden, gefolgt von 2 min waschen in 70% Ethanol und 2 min waschen in 100% Ethanol. </li></ol></li><li> Das Anbringen und Sterilisieren Fenster auf der Kulturschale. <ol><li> Um die Fenster angebracht werden kann, stellen Sie das Fenster mit der flachen Seite nach oben auf den Boden der Kulturschale, legen Sie ein Stück Klebeband auf einer sauberen Glasobjektträger. Schneiden Sie etwa ein Viertel Zoll-Streifen aus den langen Seite des Bandes. Nehmen Sie ein Stück Klebeband an der kurzen Seite (auf ⅛ &quot;durch ¾&quot;) mit einer sauberen Rasierklinge. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Scheibe der Band an den Rand des Gitters oder Fenster gelten. Verwenden Sie genug, um sicher zu halten ist, ohne dabei die Fensteröffnung selbst. Manipulation der halten Band mit einer Pinzette, setzen Sie das Fenster nach unten auf den Boden der Kulturschale. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette auf Band auf den Boden der Kulturschale fest haften. </li><li> Übernehmen Sie ein anderes Band Streifen zu dem anderen Rand und halten diese auf den Boden fest mit der Spitze der Pinzette. </li><li> Nachdem alle FensterKlebeband, sterilisieren Fenster in Kulturschalen mit ultraviolettem (UV) Strahlung. Erreichen dies, indem Sie das Gericht unter der UV-Lampe in einer Steril etwa 1 Stunde. </li><li> (Optional) Wenn Fenster mit Poly-Lysin vorbeschichtet werden sollen, müssen so folgende Fenster Sterilisation. Bestreichen Sie die Fenster mit 10 ul sterilem 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung für 1 h in einem 37 ° C Inkubator und dann spülen Sie die verbleibende Lösung mit dem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Bereiten Puffer für letzten Waschen vor XFM. <ol><li> Bereiten entweder ein Tris-Glucose oder Piperazin- N, saccharose N &#39;-bis (ethansulfonsäure) (PIPES) Puffer frei von Spurenmetallen mit Osmolalität und pH äquivalent Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) ohne Calcium und Magnesium. Verwenden Sie eine dieser Puffer Zellen spülen, nachdem die Zellen chemisch fixiert. <ol><li> Um die Tris-Glucoselösung (10 mM Tris, 260 mM Glucose, 9 mM Essigsäure) machen hinzuzufügen 1,4 g Glucose, 36 mg Tris-Base und16 ul Essigsäure und 20 ml Reinstwasser. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Keine pH Einstellung erforderlich ist. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche. </li><li> Um die Rohre-Saccharose (20 mM PIPES, 200 mM Saccharose) hinzufügen 0,18 g PIPES und 2,0 g Saccharose in 20 ml Reinstwasser und der pH-Wert auf 7,4 mit kleinen Mengen von konzentrierter Essigsäure. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche. HINWEIS: Der Grund, zu vermeiden, mit PBS in der letzten Spülung ist, dass die Konzentration von Phosphat, Chlorid und Kalium in PBS so hoch, daß sie mit XFM stören, wenn sie nicht vollständig vor dem Trocknen an der Luft entfernt werden. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Puffer für Zell Beschichtung. <ol><li> Bereiten Sie oder nehmen Sie alle Medien, wie RPMI-Medium 1640, 1x Trypsin-EDTA-Lösung, D-PBS, und andere Reagenzien, wie für die jeweilige adhärenten Zelllinie benötigt, wie sie normalerweise für die Passage der adhärenten o Zellen durchgeführt werdenf Interesse, und wärmen Sie sie auf 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Überzug von Zellen <ol><li> Zu dem sterilisierten Kulturschale gegeben, die Fenster in der Haube mit laminarer Strömung, sanft hinzuzufügen Medien (10 ml für eine 100 mm-Kulturschale), entlang der Seite der Kulturschale in einem Winkel geneigt ist. Vermeiden Sie unnötige Oberflächenspannung oder Fallenmedien direkt auf Oberfläche des Siliziumnitrid-Fenster. Als Medium wird hinzugefügt, langsam entlasten den Neigungswinkel zu beschichten das Gitter und Fenster mit Medien. </li><li> Bereiten Sie die adhärenten Zelllinie von Interesse angemessen, Trypsinierung oder Abkratzen der Zellen aus der Platten wie gewohnt für Passagieren des Zelllinie. Führen Sie alle Zellzählung oder andere Vorbereitung notwendig, bevor die Zellen an der frischen Platte. </li><li> Hinzufügen von Zellen in die Kulturschale mit Fenstern mit einer Zelldichte, die benötigt wird, um normalerweise zu erreichen 50% -70% Konfluenz innerhalb 24-72 Stunden, und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. </li&gt; <li> Wachstum der Zellen zu beobachten gelegentlich unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops, bis die gewünschte Zelldichte (in der Regel 50% bis 70% Konfluenz) erreicht wird. </li></ol> 3. Fixierung von Zellen <ol><li> Ansetzen 4% Paraformaldehyd in D-PBS durch Verdünnen eines gekauft Lager (wie 25% Paraformaldehyd) und Einstellen des pH auf 7,4 mit Essigsäure (Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid zu der Probe zu vermeiden). </li><li> Wenn Zellen erzeugt worden sind, wie gewünscht, und alle Vitalfarbstoffe (wie Hoechst) zur Anwendung, und abgebildet wird, entfernen Sie die Medien durch leichtes Ansaugen, Kippen der Schale in einem Winkel von 45 ° mit einer Hand, und Absaugen von Hand Pipette mit der anderen . Hinweis: Alternativ zum Pipettieren verbrauchte Medien, ist eine Alternative zu dem Fenster abholen, tauchen Sie das Fenster in Mikrozentrifugenröhrchen mit D-PBS zweimal und dann legen Sie sie in ein neues Kulturgefäß mit Fixiermittel-Lösungen für 20 Minuten, gefolgt von 2-mal PBS waschen die Rest Fixiermittel zu entfernen. Wenn dies gewählt wird, gehen direkt zu Schritt 3.5. </li><li> Spülen Sie die Schale vorsichtig mit D-PBS und sofort zu ersetzen, die entfernte Flüssigkeit durch vorsichtiges Hinzufügen der frischen 4% PFA / PBS, während das Gericht in einem Winkel von 45 ° in Richtung der Seite der Schale halten, Pipettieren, und langsam entspannen den Neigungswinkel zu ermöglichen die Fixierungslösung, um die Fenster zu decken. Halten der Zellen mit dem Fixiermittel für 20 min bei RT überzogen. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch leichtes Ansaugen, wieder wie oben, Kippen der Schale leicht und Absaugen von Hand. </li><li> Bringen Sie die Flüssigkeit entfernt durch leichtes Hinzufügen von einigen der Leitungen / Saccharose-Lösung unter Verwendung der in Schritt 3.3 beschrieben Kipp- und Pipettierverfahren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5. </li><li> Vorbereitung der Materialien für das Trocknen. <ol><li> Sammeln fusselfreien Tücher wie Kimwipes, und ziehen Sie eine aus der Box, so ist es praktisch, sehr schnell und einfach. </li><li> Bereiten Sie eine saubere, nicht-Ebene stelle das Fenster, um zu trocknen. Set aus einer Kautschukgittermatte der Art, in der Elektronenmikroskopie eingesetzt, die Rippen hat, sokann das Fenster an einem Ende gestützt werden, während es trocknet. Das Fenster aus immer auf die Trockenoberfläche geklebt zu halten, während er trocknet und Drain verbleibende Puffer zu der Kante der Probe. </li></ol></li><li> Sorgfältig tweeze das Band, um das Fenster, um das Fenster aus der Flüssigkeit halten angebracht. Rufen Sie Fenster, die aus der Band kommen, indem eine kleine Menge von Leitungen / Saccharose zu erhalten, um zu schwimmen und dann abholen mit den Reverse-Pinzette. </li><li> Vorsichtig (ohne Berührung der Fenster selbst) und gründlich beschmieren überschüssige Leitungen / Saccharose aus dem Rand des Fensters mit einem Kimwipe. Auch beschmieren die Rückseite eingekerbten Bereich mit einem abgerundeten Falte eines Kimwipe. ANMERKUNG: Das Ziel ist es, so wenig Kristallisation von Salzen oder Puffern auf der Oberfläche des Fensters wie möglich haben. </li><li> Stellen Sie das Fenster auf die Gittermatte. Stellen Sie sicher, dass das Fenster nicht auf dem Gittermatte flach, aber aufgestützt auf einer Kante (über die Kämme der Gittermatte) und berühren so wenig des Rastersmat wie möglich. Lassen Sie das Fenster trocken. </li></ol> 4. Proben Montage und Imaging <ol><li> Sobald die Probe getrocknet, überprüfen Sie die Anwesenheit von Zellen an den Fenstern mit einem Lichtmikroskop. Führen Sie diese Prüfung, bevor die Vorbereitung der Proben für den Transport in einem Synchrotron. </li><li> Verpacken Sie die Fenster für den Transport zum Synchrotron-Beamline-Hosting-Experiments. Sanft Anbringung der Fenster mit Klebeband auf beiden Seiten auf einem Glasobjektträger, dann bringt die Glasträger mit Klebeband an der Unterseite eines Kunststoff-Petrischale. Kleben Sie die Petrischale geschlossen. HINWEIS: Vor diesem Zeitpunkt können diese Schritte in einer beliebigen typischen Labor durchgeführt werden. Die folgenden Schritte am besten an einem Synchrotron-Beamline erfolgen. </li><li> Entfernen Sie das Klebeband vom Fenster vorsichtig mit einer Pinzette. Verwenden Sie Nagellack, in einer dünnen gleichmäßige Beschichtung auf dem Rand des Fensters, um die Fenster zu einem Aluminiumhalter durch die Beamline Mitarbeiter an der Synchrotron vorgesehen sichern. </li><li> Legen Sie die Aluminiumhalter ineine kinematische montieren, und dann legen Sie sie in die richtige Position in der Röntgenmikroskop. Montieren Sie die Probe auf einer Konsole den Anschluss an Motortische, innerhalb der Probenkammer an der Beamline. </li><li> Nach dem Verlassen der Probe Röntgenmikroskop Instrument Bereich (einen Stall von Blei gefüllten Wänden), Einrichtung der Scan. Verwendung Strahlrohr spezifische Software, wählen die entsprechende Fläche der Probe zu scannen, während der Anzeige der Position des Röntgenstrahls auf der Probe unter Verwendung einer Kamera mit einer Videofadenkreuz und ausgestattet vororientierte mit nachgeschaltetem Szintillator Kamera. </li><li> Wählen Sie die geeignete Auflösung für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Größe des kleinsten interessierenden Merkmals. Zur Abbildung einzelner Säugetierzellen (~ 20-40 &amp; mgr; m in der Größe), verwenden Sie eine Auflösung von 0,25 bis 0,5 &amp; mgr; m. Zum Abbilden Bereiche von Geweben und Unterscheidung von Zellschichten voneinander Verwenden einer Auflösung von 2-20 um. </li><li> Wählen Sie die passende Verweilzeit für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Menge des metal von Interesse vorhanden. Für einen schnellen Überblick Scan, oder wenn große Mengen an Metallen vorhanden sind, verwenden fly Scans mit Verweilzeiten von 30 bis 300 ms pro Pixel. Wenn wenig Material vorhanden ist, oder Metalle der niedrigen relativen Häufigkeit zu messen, verwenden Schritt Scans mit Haltezeiten von 1-2 Sekunden pro Pixel. </li><li> Programmieren Sie die Scans in die Strahllinie spezifische Software. Erwerben Sie ein Raster-Scan-Bild. Arbeiten Sie zusammen mit den Beamline Mitarbeiter, um die Daten mit einer Software, die die charakteristischen Energiespitzen für jedes Element zu identifizieren analysieren. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Bereichen, einschließlich der Geowissenschaften, Materialwissenschaften und der chemischen Biologie 26-34 nützlich. Fortschritte in der Synchrotron-Röntgenstrahlen und ihre Fokussierung haben sehr hoher Intensität Strahlen erzeugt. Fokussierten Röntgenstrahlen ausreichend ist, um die endogenen Metallen in Zellen existieren nun erregt, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Silizium-Driftdetektortechnologie gemessen werden kann. Und das Studium der ch...

Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht sowohl für die Identität und Menge der in einer Probe vorhandenen Elemente räumlich aufgelöst werden. Einfallenden Röntgenstrahlen, einer größer gewählt als die Elektronenbindungsenergie der schwerste Element von Interesse zu sein, Energie, die Überwindung der Bindungsenergie von Elektronen der inneren Schale an den Kern 1. Dadurch entsteht ein &quot;Loch&quot; in der Elektronenhülle. Als höherenergetischen Elektronen fallen in diese Löcher werden die Röntgenfluoreszenzstrahlung emittiert, dessen Wellenlänge abhängig von der Energie Trennung dieser Orbitale. Da der Energieabstand der Orbitale ist charakteristisch für ein gegebenes Element weist die Röntgenfluoreszenzemission ebenfalls charakteristischen Wellenlängen, abhängig von dem Element. Es ist diese Emission bei einer charakteristischen Wellenlänge, welche die Identifikation der vorhandenen Elemente ermöglicht. Die Kalibrierung der Fluoreszenzintensität ermöglicht die Quantifizierung der vorhandenen Elemente. Röntgenfluoreszenz microscopy (XFM) zunehmend genutzt, zum Teil auf die Entwicklung von sehr brillanten Röntgensynchrotronquellen, wie sie bei Spring-8 in Japan, der Europäischen Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Frankreich und der Advanced Photon Source ( APS) in den USA 2. Diese Quellen liefern eine sehr hohe Intensität von Röntgenstrahlen. Zur gleichen Zeit, Verbesserung der Röntgenoptik, wie Zonenplatte Technologie, erlaubt die Fokussierung dieser Strahlen auf Sub-Mikrometer-Spots, wenn auch eher ineffizient 3. Mit sehr hoher Intensität Strahlen, auch eine relativ kleine Menge an Licht, das konzentriert sein kann, ist ausreichend, um die endogenen Metallen in Zellen anzuregen, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Detektortechnologie gemessen werden kann. So studieren die chemische Biologie der Metalle in der Zelle ist eine Anwendung insbesondere die Verwendung von vielen der jüngsten Entwicklungen in dieser Technik 4-10 macht. Es gibt viele wichtige Faktoren, die in Betracht gezogen werden, während AppLiegen XFM, um die Elementverteilung und Quantifizierung von kultivierten Säugerzellen oder anderen biologischen Proben zu untersuchen. Erstens muss die Probe intakt gehalten werden soll, sowohl strukturell als auch in bezug auf die elementare Zusammensetzung, damit die Messung aussagekräftig zu sein. Zweitens muss die Probe auch in irgendeiner Weise gespeichert, dass sie hart zur Strahlungsschäden, die durch einen fokussierten Röntgenstrahl verursacht werden kann, ist. Eine Möglichkeit, dass eine Probe nur eines dieser Kriterien auf einmal zu erfüllen ist es, sich schnell zu einem glasartigen, amorphen Eis 11,12 eingefroren werden. Schockgefrieren wird oft durch verschiedene Kryokonservierung Techniken wie Tauch Einfrieren oder Hochdruckgefrier 13-16 erreicht. Es ist allgemein anerkannt, dass die Kryokonservierung bewahrt Gesamtzellarchitektur und chemischen Zusammensetzungen in biologischen Proben so nahe nativen Zustand möglich. Chemische Fixierung, auf der anderen Seite, aufgrund der langsamen und selektive Durchdringung von Fixiermittel in Zellen und Geweben als well als nachträgliche Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit, können verschiedene zelluläre Ionen besonders die diffundierbare Ionen wie Cl, Ca und K, um ausgelaugt werden, verloren oder verlegt werden, so machen Untersuchung dieser Elemente suboptimal 17-19 ermöglichen. Trotz der klaren Vorteile der Kryo-Fixierung über chemische Fixierung im Allgemeinen, für adhärente Säugetierzellen hat insbesondere die Kryokonservierung verschiedenen Einschränkungen 20-23. Der offensichtlichste ist, dass nicht jede Forschungslabor hat leichten Zugang zu Kryokonservierung Instrumente. Für aktuelle Hochdruckgefriergeräte oder sogar stürzen Gefriergeräte sind teuer und gehören, nur eine Teilmenge der Kryo Einrichtungen, die weit von dem Zellen inkubiert werden kann. Der Vorteil der Kryokonservierung könnte zum Nachteil des Reise Stress auf die Zellen gegeben gehandelt werden. Während also die Kryokonservierung ist sicherlich die härteste Weg, um Proben für die Röntgenfluoreszenzanalyse zu erhalten, ist es sicherlich nicht die zugänglich für alle Forscher, unter allen Umständen;es ist auch nicht immer erforderlich - wenn die Metalle von Interesse sind eng fixierbar Makromoleküle gebunden sind, und die Auflösung, mit der die Probe abgebildet wird größer als die Beschädigung der ultraMikroStruktur, die während der Trocknung auftreten könnte, ist. Eingedenk der Vorbehalte 24 kann chemische Fixierung und Trocknung eine geeignete Wahl sein. Andere Faktoren, die zu einer erfolgreichen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung Test einbezogen korrekte Analyse. Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ist grundsätzlich Röntgenfluoreszenzemissionsspektroskopie kombiniert mit Rasterabtastformat die räumliche Auflösung zu liefern. Die gesammelten Röntgenfluoreszenzemissionsspektren enthalten eine Kombination von überlappenden Emissionsspitzen, den Hintergrund und die elastischen und inelastischen Streuungspeaks des einfallenden Strahls. Software, die die Entfaltungs dieser Beiträge und der Anpassung der Emissionsspitzen ermöglicht, hat zu diesem Bereich 25 schon eine kritische Entwicklung. Auch die Entwicklung und kommerzielle distribution Dünnschicht Standards bekannter Zusammensetzung verwendet, um die Fluoreszenzintensität relativ zur Materialmenge zu kalibrieren, wurde auch sehr wichtig. Dieses Protokoll stellt eine Beschreibung der Herstellung der haftenden Zellen durch chemische Fixierung und Lufttrocknung. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist das Wachstum der Zellen auf den Siliziumnitrid-Fenster, die oft nicht gut an, so dass sanfte Spülung in einer bestimmten Art und Weise der Schlüssel zum Erfolg.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride windows</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200&amp;nbsp;nm. Frame size: 5&amp;nbsp;mm x 5 mm. Frame thickness: 200 &amp;micro;m.</td><td>Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Reverse tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &amp;ndash; Ultra Fine Tweezers</td></tr><tr><td>Rubber grid mat</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Round Grid Mat</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>trace metals grade concentrated acetic acid</td></tr><tr><td>PIPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>solid PIPES buffer</td></tr><tr><td>Formaldehyde stock solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td></tr></tbody></table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Die Fähigkeit der Röntgenfluoreszenzabbildung, um Informationen über biologische Proben bereitzustellen ist abhängig wobei diese Proben in einer Weise, dass sie robust gegenüber Strahlungsschäden auf der Zeitskala des Experiments sind, hergestellt, und doch ihre chemischen und strukturellen Merkmale gut erhalten. Bei der Betrachtung des Ergebnisses einer Probe, die hergestellt wurde wie oben beschrieben und abgebildet wird, ist es möglich zu sehen, dass es eine Variation in der vorhandenen Elemente - was anzeigt,...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K Aufrufe.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

Serie: Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. They offer new possibilities for the characterization of living systems and are particularly appropriate for detecting, localizing and quantifying the presence of metal oxide nanoparticles both in biological specimens and the environment. Indeed, these techniques all meet relevant requirements in terms of (i) sensitivity (from 1 up to 10 &#181;g.g-1 of dry mass), (ii) micrometer range spatial resolution, and (iii) multi-element detection. Given these characteristics, microbeam chemical element imaging can powerfully complement routine imaging techniques such as optical and fluorescence microscopy. This protocol describes how to perform a nuclear microprobe analysis on cultured cells (U2OS) exposed to titanium dioxide nanoparticles. Cells must grow on and be exposed directly in a specially designed sample holder used on the optical microscope and in the nuclear microprobe analysis stages. Plunge-freeze cryogenic fixation of the samples preserves both the cellular organization and the chemical element distribution. Simultaneous nuclear microprobe analysis (scanning transmission ion microscopy, Rutherford backscattering spectrometry and particle induced X-ray emission) performed on the sample provides information about the cellular density, the local distribution of the chemical elements, as well as the cellular content of nanoparticles. There is a growing need for such analytical tools within biology, especially in the emerging context of Nanotoxicology and Nanomedicine for which our comprehension of the interactions between nanoparticles and biological samples must be deepened. In particular, as nuclear microprobe analysis does not require nanoparticles to be labelled, nanoparticle abundances are quantifiable down to the individual cell level in a cell population, independently of their surface state.

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

We describe a procedure for the detection of chemical elements present in situ in human cells as well as their in vitro quantification. The method is well-suited to any cell type and is particularly useful for quantitative chemical analyses in single cells following in vitro metal oxide nanoparticles exposure.

In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Forschung

Chemie

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Umwelt

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Biochemie

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

Biotechnik

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologie

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...