Um Tierversuche zu reduzieren und aufgrund der Variabilität des NH-Tests, regt die WHO an, In-vitro-Ansätze zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwutimpfstoffen zu entwickeln. Dieser ELISA-Test zeigt eine gute Übereinstimmung mit einem klassischen NH-Test bei der Erkennung der immunogenen Form des Glykoproteins, zeigt eine hohe Empfindlichkeit und kann innerhalb von nur einem Tag durchgeführt werden. Die Bewertung der Tollwut-Impfstoff-Potenz in vitro durch ELISA ist eine Alternative zum in vivo NH-Test.
Es wird von den Herstellern und nationalen Kontrolllaboratorien gefördert. Es ist wichtig, vorgefertigte Mengen in Doppeltage für jede Verdünnung zu verteilen und die Platte auf saugfähigem Papier nach dem Waschen gut zu trocknen, um zu vermeiden, dass Sie dieses Verfahren beginnen, geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Einwegmantel, Handschuhe, Maske und Brille anziehen. Behandeln Sie die kontaminierten Materialien, indem Sie sie für die Dekontamination 30 Minuten lang in eine Lösung von 2,6% Natriumhypochlorit eintauchen.
Als nächstes legen Sie eine 96-Well-Immunoassay-Platte fest und fügen Sie jedem Brunnen 200 Mikroliter des monoklonalen Antikörpers hinzu, der im Karbonatpuffer verdünnt ist. Bedecken Sie die Platte mit Klebefolie und bebrüten Sie die Mikroplatte bei 37 Grad Celsius für drei Stunden in einer befeuchteten Umgebung. Dann saugen Sie den Brunnengehalt sorgfältig an und übertragen Sie ihn in einen Empfänger, der eine Lösung von 2,6% Natriumhypochlorit enthält.
Invertieren Sie die Mikroplatte und lassen Sie sie fünf Minuten lang auf saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen. Fügen Sie zunächst 300 Mikroliter des Passivierungspuffers zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte mit Klebefolie bedecken und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius bebrüten.
Danach den Inhalt des Brunnens auf einen mit einer Lösung von 2,6% Natriumhypochlorit übertragen. Um die Platte zu waschen, fügen Sie 300 Mikroliter des Waschpuffers zu jedem Brunnen hinzu. Dann vorsichtig ansaugen und den Brunnengehalt in einen Empfänger übertragen, der eine Lösung von 2,6% Natriumhypochlorit enthält.
Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch fünfmal, um die sensibilisierte Platte ausgiebig zu waschen. Danach die Mikroplatte umkehren und eine Minute lang auf einem Stück saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen lassen. Rekonstituieren Sie den Referenzimpfstoff in einem Milliliter destilliertem Wasser so, dass die Endkonzentration des Tollwutvirus Glykoprotein 10 Mikrogramm pro Milliliter beträgt.
Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung des rekonstituierten Referenzimpfstoffs im Verdünnungsprodukt vor, um eine Glykoproteinkonzentration des Tollwutvirus von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Als nächstes führen Sie sechs serielle zweifache Verdünnungen dieses Referenzimpfstoffs im Verdünnungsprodukt durch, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Verteilen Sie 200 Mikroliter des Verdünnungsverdünnungsstoffs in doppelten Brunnen, um als Blindkontrolle zu dienen, und 200 Mikroliter pro Brunnen für jede Referenzimpfstoffverdünnung in doppelter Ausführung.
Bereiten Sie dann eine 10-fache Verdünnung des getesteten Impfstoffs im Verdünnungsprodukt vor und bereiten Sieben zweifache serielle Verdünnungen des getesteten Impfstoffs in Verdünnungsstoff vor, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben. Verteilen Sie 200 Mikroliter jeder getesteten Impfstoffverdünnung in doppelter Weise an jeden Brunnen der Mikroplatte. Die Mikroplatte mit Klebefolie bedecken und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius brüten.
Entfernen Sie danach den Film. Saugen Sie sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der eine 2,7%Natriumhypochloritlösung enthält. Um die Platte zu waschen, fügen Sie 300 Mikroliter Waschpuffer zu jedem Brunnen, aspirieren sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der eine 2,6%Natriumhypochlorit-Lösung enthält.
Wiederholen Sie den Waschvorgang noch fünfmal, um das ungebundene Antigen zu entfernen und die an den beschichteten Antikörper gebundenen G-Protein-Trimmer zu konservieren. Invertieren Sie die gewaschene Mikroplatte und lassen Sie sie eine Minute lang auf einem Stück saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen. Dann verteilen Sie 200 Mikroliter der empfohlenen Verdünnung der Peroxidase mit der Bezeichnung D1 monoklonaler Antikörper in Verdünnungsmittel an jeden Brunnen.
Die Mikroplatte mit Klebefolie bedecken und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius brüten. Als nächstes entfernen Sie den Film, aspirieren Sie sorgfältig, und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der eine 2,6%Natriumhypochlorit-Lösung enthält. Um die Mikroplatte zu waschen, fügen Sie 300 Mikroliter Waschpuffer zu jedem Brunnen hinzu.
Saugen Sie sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der 2,6% Natriumhypochloritlösung enthält. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch fünfmal, um den ungebundenen peroxidase markierten Antikörper zu entfernen. Invertieren Sie die gewaschene Mikroplatte und lassen Sie sie eine Minute lang auf einem Stück saugfähigem Papier bei Raumtemperatur trocknen.
Als nächstes verteilen Sie 200 Mikroliter Substrat-Chromogen-Lösung in jeden Brunnen. Versiegeln Sie die Mikroplatte mit Folie und inkubieren Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Stopplösung in jeden Brunnen, um die Reaktion zu stoppen.
Wischen Sie den Boden der Mikroplatte vorsichtig ab und legen Sie ihn in das Spektralphotometer. Bestimmen Sie die optische Dichte bei 492 Nanometern für alle verwendeten Brunnen. Sammeln Sie diese Daten zur Analyse in einer Tabellenkalkulationsdatei.
Erstellen Sie danach Diagramme sowohl für die Referenzimpfstoffkurve als auch für die optischen Dichtewerte, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird der In-vitro-ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen verwendet. Hier werden repräsentative optische Dichtewerte aus einem typischen Experiment dargestellt.
Diese Werte werden verwendet, um die Referenzimpfstoffkurve zu zeichnen, indem die mittlere optische Dichte für die verschiedenen Verdünnungen des Referenzimpfstoffs auf der vertikalen Achse und die Konzentration des Glykoproteins auf der horizontalen Achse dargestellt wird. Der Glykoproteingehalt des getesteten Impfstoffs wird dann anhand dieser Kurve geschätzt. Die Bewertung ist präzise für Verdünnungen, die einen mittleren optischen Dichtewert im Linerbereich der Referenzimpfstoffkurve aufweisen.
Unter Berücksichtigung der Verdünnung von eins bis 40 entspricht die vertikale Projektion von OD 1534 auf der x-Achse 500 Nanogramm pro Milliliter. Der getestete Impfstoff wird also auf 20 Mikrogramm pro Milliliter Glykoprotein geschätzt. Wenn die In-vitro-Potenz nachgewiesen ist, ist es notwendig, den getesteten Impfstoff mit dem Referenz-Sechs-WHO-Internationalen Standard zu vergleichen, der in internationalen Einheiten kalibriert ist.
Die gleiche Methode kann mit anderen Antikörpern verwendet werden, um den Nachweis von mehr Impfstoffstämmen zu erweitern, einschließlich derjenigen, die in Veterinärimpfstoffen verwendet werden, die klassisch variabler sind. Antikörper können auch im Wettbewerb um die Titration von Antirabi-Antikörpern in Pferden oder humanen Serum verwendet werden. Vorsichtsmaßnahmen müssen bei Impfstoffen getroffen werden, die nicht inaktiviert sind, oder bei Viren.
Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu verwenden, Handschuhe zu tragen und alles richtig zu dekontaminieren. Achten Sie auch auf Tabletten, da sie krebserregend sind, und mit der sauren Natriumhypochloritlösung.
