Autoren möchten sich bei Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi und Blair Mell für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von der NIH (DK080640) und der University of Toledo &amp; ProMedica Translational Research Award an Dr. Stimulation Surya Nauli unterstützt.

1. Zell-Vorbehandlung und Metaphase Vorbereitung <ol><li> Die Zellen werden in Dulbeccos Modifizierung von Eagle-Medium (DMEM), das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2-Inkubator gewachsen, bis sie 70-80% Konfluenz erreichen. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit Colcemid Lösung bei 0,05 pg / ml für 30-60 min. </li><li> Sammeln Sie das Medium, das keine schwimmenden Zellen in 50-ml sterile Falcon Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Zellen auf der Platte mit sterile1X-PBS. Nach Inkubation mit sterilem Trypsin für 1-2 min, Ernte und sammeln die restlichen Zellen in das gleiche Rohr. </li><li> Drehen Sie die Rohre bei 1000 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren Verlassen 0,5 ml und lockern Pellet durch schnippte mit dem Finger nur. </li><li> Abhängig von der Pellet-Größe, fügen 5-10 ml hypotonische Lösung von 0,56% KCl in dH 2 O und inkubieren Sie die Suspension bei 37 ° C für 30-45 min. </li><li> Einen Tropfen Methanol / Essigsäure(3:1 vol / vol) pro ml hypotonische Zellsuspension und das Röhrchen vorsichtig zum Mischen. </li><li> Zentrifugieren bei 1200 rpm für 5 min und sammeln Pellet als Schritt 1,4, dann mit 5 ml frischem Methanol / Essigsäure (3:1 vol / vol) Fixierlösung tropfenweise während flicking des Pellets kontinuierlich. Dieses Verfahren ist kritisch, so dass die Metaphasen Spreads nicht wird auch in den Zellen &#39;Klumpen, die das Experiment gefährden würde abgefangen werden. </li><li> Zentrifugieren wieder bei 1200 UpM für 5 min an und füge 5-10 ml eiskaltem Methanol / Essigsäure Fixiermittelzusammensetzung entlang der Wand des Rohres. In diesem Stadium, falls erforderlich, können die Zellen in Fixierungsmittel Lösung in einem fest angezogen und dicht Rohr bei -20 ° C für kurze Zeiten oder -80 ° C gelagert werden für lange Laufzeit (Jahre) für die zukünftige Verwendung. </li><li> Sauberkeit Folien in absolutem Ethanol, tauchen Sie dann die Folie in dH 2 O für approximately10X, um eine Hülle aus Wasser auf der Oberfläche des Schiebers zu bilden. Legen Sie den Objektträger auf einer Glasplatte und Tropfen 15-20 &amp;mgr; l der Zellsuspension (aus Schritt 1,8) Von 10 &quot;über der Folie. Legen Sie den Objektträger in einem Wasserbad bei 65-70 ° C eingestellt und für 1-2 Minuten trocknen lassen. </li><li> Überprüfen Sie die Folie unter einem Lichtmikroskop mit 10x und 40x trocken Ziele machen Sie sicher, dass Metaphasechromosomen und die Spreads gleichmäßig verteilt sind. Prüfen Sie, ob Zytoplasma Präsenz rund um die Chromosomen. Wenn Zytoplasma vorhanden ist, mit Rutsche Vorbehandlung (Pepsinverdauung) vorgehen, wenn kein Zytoplasma vorhanden ist und die Chromosomen haben gute Morphologie, dann gibt es keine Notwendigkeit für Dia-Vorbehandlung. </li></ol> 2. Slide Vorbehandlung (Pepsin-Behandlung) <ol><li> Tragen Sie 120 ul 1:200 RNase-Lösung (20 mg / ml) in 2X SSC-auf eine 24 mm x 60 mm Deckglas Mikroskop aufgelöst und invertieren die Metaphase Rutsche nach unten auf das Deckglas dann vorsichtig umdrehen der Metaphase Gleitfläche auf und inkubieren Sie bei 37 ° C für 45 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas ohne zu kratzen und waschen Sie die Folie in 2X SSC-Puffer in einem entsprechenden Gefäß alle 5 min, 15 minunter Schütteln. </li><li> In 5-15 ul von Pepsin-Stammlösung (100 mg / ml in dH 2 O) in ein sauberes Becherglas und fügen Sie dann 100 ml vorgewärmtem (37 ° C) 0,01 M HCl. Es ist wichtig, dass das Pepsin in ein sauberes hinzugefügt wird Becher erste und nicht direkt in die HCl-Lösung, sonst wäre es nicht in Lösung zu lösen. Inkubieren Sie die Folie in einer Glasküvette mit dem HCl / Pepsin-Lösung bei 37 ° C für 3-5 min. Dieser Schritt ist sehr kritisch, da zu viel Verdauung wird bewirken, dass die Chromosomen an overdigested werden und zu wenig Verdauung verlassen das Zytoplasma unverdauten, welche könnte um nicht-spezifische Bindung der Sonde führen und interferieren mit dem Hybridisierungssignal. </li><li> Waschen Sie die Folie in einer Glasküvette mit 100 ml 1X-PBS für 5 min zweimal bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Folie in einer Glasküvette mit 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 für 5 min bei Raumtemperatur (50 ml 1 M MgCl 2 in 950 ml 1X-PBS). </li><li> Legen Sie die Folie in einer Coplin containing 100 ml 1% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur (1,7 ml 37% Formaldehyd in 100 ml 1X-PBS/MgCl 2). </li><li> Waschen Sie die Folie in einer Glasküvette mit 100 ml 1X-PBS für 5 min. </li><li> Beachten Sie die Folie unter einem Lichtmikroskop mit 40x Linse trocken, um sicherzustellen, dass die Dias richtig verdaut und kein Zytoplasma vorhanden ist und die Chromosomen-Morphologie erhalten bleibt. Wählen Sie einen Bereich für die Hybridisierung unter Verwendung einer Diamant-Stift. </li></ol> 3. Chromosom und Sonde Denaturierung und Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie frische denaturierenden Lösung (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) und vorwärmen auf 70-80 ° C in einem entsprechenden Gefäß im Wasserbad Ort platziert die Folie in der Glasküvette mit dem denaturierenden Lösung in einem Wasserbad bei 70 ° C Maus-Chromosomen und 80 ° C für den menschlichen Chromosomen für 30er-1.5 min. </li><li> Anschließend wird der Schlitten in eiskaltem 70% Ethanol für 3 min um 80% gefolgt und 100% Ethanol für je 3 min an der Luft trocknen. Untersuchen Sie die Foliefür Chromosom Morphologie. Gute Chromosom Morphologie wird durch dunkle Chromosomen und nicht &quot;-Phase-light&quot; oder Halogen-Chromosomen bezeichnet. </li><li> Erwärmen Sie die SkyPaint Sonde (SKY Paint Kit; Phiole # 1) bei 37 ° C unter Schütteln für 20 min, vortexen und kurz zentrifugieren bei 1000 rpm für ein paar Sekunden. </li><li> Denaturieren die Sonde in einem Thermocycler für eine Zwei-Schritt-Zyklus mit 85 ° C programmiert für 5 min-Takt um 37 ° C für 60 min auf markierten-Sonden-DNA für preannealing genau verfolgt. </li><li> Übernehmen 10 &amp;mgr; l des denaturierten Sonde auf dem Gebiet der Hybridisierung und Abdeckung mit einem 22 mm x 40 mm Deckglas unter Sicherstellung, nicht Luftblasen einzufangen. Seal die Ränder des Deckglases mit Rubber Cement und inkubieren Sie in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 48-72 Stunden. </li></ol> 4. Fluoreszenzsonde Erkennung <ol><li> Entfernen Sie das Deckglas vorsichtig und legen Sie die Folie in einer Glasküvette mit vorgewärmtem (45 ° C) Waschlösung I (frisch zubereitete 50% Formamid in 2 × SSC). Waschen für 5 mindrei Mal bei 45 ° C in einem Schüttelwasserbad bei 45 rpm </li><li> Waschen Sie die Folie in Waschlösung II (1X SSC) bei 45 ° C für 5 min zweimal mit Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Folie in Waschlösung III (4X SSC/0.1% Tween 20) für 5 min bei 45 ° C unter Schütteln. </li><li> Bewerben 80 ul Blockierungsreagenz (SKY Paint Kit; Phiole # 2), legen Sie ein Deckglas und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Folie und lassen Sie die Flüssigkeit ablaufen. Bewerben 80 ul Cy5 Färbereagenz (Concentrated Antikörpernachweis CAD-Kit; Phiole # 3), tragen Sie eine Deckglas und bei 37 ° C für 40 min. </li><li> Waschen Sie die Folie mit Waschlösung III bei 45 ° C für 5 min dreimal mit Schütteln. </li><li> Bewerben 80 ul Cy5.5 Färbereagenz (Concentrated Antikörpernachweis CAD-Kit; Fläschchen # 4), legen Sie ein Deckglas und bei 37 ° C für 40 min. </li><li> Waschen Sie die Folie mit Waschlösung III bei 45 ° C für 5 min dreimal mit Schütteln. </li><li> Kippen Sie die Folie und lassen Sie die Flüssigkeit auf<html> abtropfen lassen. Bewerben 20 ul der Anti-Fade DAPI-Reagenz (SKY Paint Kit; Fläschchen # 5) und legen Sie eine 24 mm x 60 mm Mikroskop Deckglas. Entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen gebildet haben könnte. Dias können sofort abgebildet werden oder bei 4 ° C im Dunkeln nicht länger als 1 Woche. </li></ol> 5. Bilderfassung und-analyse <ol><li> Bildaufnahme wird durch Betrachten der Metaphase Dias mit einem Olympus-Mikroskop mit einem 60X Ölimmersionslinse eine spektrale Würfel (kundenspezifische Triple-Band-Pass-Filter), eine DAPI-Filter und ein Sagnac-Interferometer-Modul mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist vollbracht. </li><li> Spectral-Karyotypen wurden mit Sky View Software (Applied Spectral Imaging Version 1.62) nach der Bedienungsanleitung durchgeführt. </li><li> Nach der Analyse der Bilder können die Chromosomen als Farbbilder (mit spezifischen fluoreszierenden Farben), Pseudo-Farbbilder (mit Farben für die Einstufung) und invertierte DAPI Bilder (spezifisches Bandenmuster) eingesehen werden. </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. repräsentative Ergebnisse Eine komplette SKY Prozedur dauert in der Regel etwa eine Woche Zeit (Abbildung 1). Dies umfasst Bilderfassung und-analyse, sofern die Metaphase-Zellen in ausreichender Menge gibt. Karyotypisierung Analyse zeigt normale Maus Karyotyp (40, XY) von Zellen von Wildtyp-Mäusen (Abbildung 2a). Im Gegensatz dazu Zellen aus PKD1 - zeigt Maus (PKD-Mausmodell) einen signifikanten Anstieg der Chromosomenzahl und strukturelle Anomalien, wie zum Beispiel Chromosom Deletionen (Chromosom # 8) und Translokationen (Chromosomen Nr. 11 und 19) (Abb. 2b) - /. Wir haben auch analysiert Leitgewebe aus den ADPKD Patienten. Eine einfache Untersuchung durch das Zählen der Chromosomen-Zahlen zeigten, dass nicht-ADPKD und einige ADPKD vaskulären Proben normalen Chromosomen-Zahl von 23 Paaren (Abbildung 2c) hatte. Im allgemeinen aber, beobachtet wir ein Versagen der chromosomalen Segregation, was in 46 Paare von Chromosomen in ADPKD Proben anstelle von 23 Paaren (Abbildung 2d). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> Abbildung 1. SKY-Protokoll Flussdiagramm. Ablaufschema des SKY-Protokoll zeigt Schritte, um ein Experiment, ausgehend von Zelle Vorbehandlung und Metaphase Vorbereitungen zur Bildaufnahme und Analyse abzuschließen. Eine ungefähre einwöchige Timeline ist auf der linken Seite mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen für jeden Tag präsentiert. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> Abbildung 2. Spektrale Karyotypisierung auf verewigt Maus-Zelllinien und frisch isolierten humanen primären Zellen. Farbe und invertierte DAPI Bilder von einzelnen Chromosomen werden vor der chromosomalen Sortierung dargestellt. Nach dem Sortieren werden Chromosomen in der &quot;Klassifikation&quot; Tabelle dargestellt. A) SKY Bild einer Metaphase Ausbreitung von Wildtyp-Maus enthält normalem Karyotyp (40, XY). B) </strong&gt; SKY Bild einer Metaphase Ausbreitung von PKD1 - / -. Maus zeigt abnormale Chromosomenzahl (68 statt 40) und Chromosomenanomalien wie Chromosom Deletionen (Chromosom # 8) und Chromosomentranslokationen (Chromosomen Nr. 11 und 19) c) SKY Bild einer Metaphase Ausbreitung aus dem vaskulären Gewebe eines Nicht-ADPKD Patient hat normalem Karyotyp (46, XX). d) SKY Bild einer Metaphase Ausbreitung aus dem vaskulären Gewebe eines ADPKD Patienten enthält abnormalem Karyotyp (92, XXXX). Ersatzteile in der Daten wurden aus früheren Berichten und wiederverwendet mit Genehmigung 14.

<ol>
	<li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes.">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li><li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes.">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li><li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+of+human,+mouse,+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research.">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms.">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 30, 349-363 (2001).</li><li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping.">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li><li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells.">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li><li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids.">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li><li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer.">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li><li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cytogenetics+revisited:+comparative+genomic+hybridization+and+spectral+karyotyping.">Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping.</a> Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li><li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells.">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li><li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1.">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation.">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping.">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes &#38; Cancer. 25, 53-59 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine Technik bei der Untersuchung Zytogenetik genomische und chromosomale Zusammensetzungen verwendet. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, und die Detektion dieser Sonden durchstöberst einem Sagnac-Interferometers erfasst. Die komplette SKY Prozess dauert etwa eine Woche, und es sind mehrere wichtige Schritte (Abbildung 1). Die SKY mit einem Standardprotokoll, das zuerst von Padilla-Nash et al 3 beschrieben wurde. Das P...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / Streptomycin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Himmel zu malen Probe Kit (Human) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> Himmel zu malen Probe Kit (Maus) </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Konzentrierte Antikörper-Nachweis-Kit </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% Formaldehyd </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> Vorbereitung unmittelbar vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Objektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Gummi-Zement </td><td> Elmer in die (lokalen Retail Store) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierung / humidifiedchamber / Fach </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> nasse Papiertücher an der Unterseite </td></tr><tr><td> ThermoCycler </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> / TwinCubator Orbitalschüttler </td><td> Bellco Biotechnologie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schütteln / Wasserbad </td><td> Precision Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI Filterwürfel </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY Filterwürfel </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Applied Spectral Imaging </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inverted Zellkultur Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX70 </td><td> 60X Öl </td></tr></tbody></table>

spectral karyotyping to study chromosome abnormalities in humans and mice with polycystic kidney disease

Konventionelle Methode zum Identifizieren und Klassifizieren einzelnen Chromosomen hängt von der einzigartigen Bandenmuster jedes Chromosoms einer bestimmten Tierart zu analysierenden 1, 2. Diese klassische Banding-Technik, ist aber nicht bei der Identifizierung von komplexen chromosomalen Aberrationen, wie sie im Zusammenhang mit Krebs zuverlässig. Um die Einschränkungen des Banding-Technik zu überwinden, wird Spektrale Karyotypisierung (SKY) eingeführt, um viel zuverlässige Informationen über Chromosomenanomalien bieten. SKY ist eine multicolor Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH) Technik, um Metaphasen-Chromosomen mit spektralen Mikroskop 3, 4 zu erfassen. SKY ist nachgewiesen worden, ein wertvolles Werkzeug für die zytogenetische Analyse eines breiten Spektrums von Chromosomenanomalien mit einer großen Anzahl von genetischen Erkrankungen und Malignome 5, 6 verbunden sein. SKY umfasst die Verwendung von Multicolor-fluoreszierend markierten DNA-Sonden aus dem entarteten Oligonucleotid hergestelltotide Primern durch PCR. Somit hat jeder Chromosom einen einzigartigen spektralen Farbe nach in-situ-Hybridisierung mit Sonden, die differentiell mit einem Gemisch von Fluoreszenzfarbstoffen (Rhodamin, Texas Red, Cy5, FITC und Cy5.5) so gekennzeichnet sind. Die Sonden für SKY verwendet werden, bestehen aus bis zu 55 Chromosomen-spezifischen Sonden 10.07. Das Verfahren für SKY umfasst mehrere Schritte (Abbildung 1). SKY erfordert die Verfügbarkeit von Zellen mit hoher Mitoseindex von normalen oder erkrankten Gewebe oder Blut. Die Chromosomen einer einzelnen Zelle entweder von einem frisch isolierten-Primär-Zelle oder einer Zellinie werden auf einem Glas-Objektträger ausgestrichen. Dieses Chromosom Ausbreitung wird mit einer unterschiedlichen Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen spezifisch für jedes Chromosom markiert. Für Sonde Detektion und Bildaufnahme, besteht die Spectral Imaging System der Sagnac-Interferometer und einer CCD-Kamera. Diese erlaubt die Messung der sichtbaren Lichtspektrums von der Probe emittiert und einen spektralen Bild her zu erwerbenm einzelnen Chromosomen. HiSKY, bietet die Software verwendet, um die Ergebnisse der erfassten Bilder zu analysieren, eine leichte Identifizierung von Chromosomenanomalien. Das Endergebnis ist eine Metaphase und ein Karyotyp Klassifizierung Bildes, bei dem jedes Paar von Chromosomen hat eine bestimmte Farbe (Abbildung 2). Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung des Chromosoms Identitäten und Translokationen. Für weitere Informationen, besuchen Sie bitte Applied Spectral Imaging Website ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY wurde vor kurzem für eine Identifizierung von Chromosomensegregation Mängel und Chromosomenanomalien bei Menschen und Mäusen mit autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), eine genetische Erkrankung, die durch Funktionsstörungen bei primären Zilien 11-13 gekennzeichnet werden. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, das Vorhandensein von abnormen Chromosom Segregation und Chromosomenstörungen in ADPKD Patienten und Mausmodellen 14. Weitere Analysen unter Verwendung SKY nicht nur erlaubt uns, chromosomalen Teilnummer und identifizieren zu identifizieren, sondern auch genau zu erfassen, sehr komplex chromosomalen Abweichungen wie Chromosom Deletionen und Translokationen (Abbildung 2).

Watch this Scientific Journal Video about Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease at JoVE.com

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine fortgeschrittene Technik, um Zytogenetik genomischen und chromosomalen Aberrationen zu identifizieren. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, die es erlauben die Einstufung aller Chromosomen. SKY kann auch identifiziert werden komplexe Chromosomenaberrationen und Segregation Defekte in Mäusen und Menschen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Zystennieren.

Spektrale Karyotypisierung zu Chromosomenanomalien in Menschen und Mäusen mit Kidney Disease Study

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

38.2K Aufrufe.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Spektrale Karyotypisierung (SKY) ist eine fortgeschrittene Technik, um Zytogenetik genomischen und chromosomalen Aberrationen zu identifizieren. Diese Technik nutzt die Vorteile von Chromosom Malerei Sonden, die es erlauben die Einstufung aller Chromosomen. SKY kann auch identifiziert werden komplexe Chromosomenaberrationen und Segregation Defekte in Mäusen und Menschen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Zystennieren.

Serie: Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Forschung

Medizin

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements of homeostasis, integrative animal models are necessary to study development and progression of CKD. To study development of CKD and novel therapeutic interventions in CKD, we use the 5/6th nephrectomy ablation model, a well known experimental model of progressive renal disease, resembling several aspects of human CKD. The gross reduction in renal mass causes progressive glomerular and tubulo-interstitial injury, loss of remnant nephrons and development of systemic and glomerular hypertension. It is also associated with progressive intrarenal capillary loss, inflammation and glomerulosclerosis. Risk factors for CKD invariably impact on endothelial function. To mimic this, we combine removal of 5/6th of renal mass with nitric oxide (NO) depletion and a high salt diet. After arrival and acclimatization, animals receive a NO synthase inhibitor (NG-nitro-L-Arginine) (L-NNA) supplemented to drinking water (20 mg/L) for a period of 4 weeks, followed by right sided uninephrectomy. One week later, a subtotal nephrectomy (SNX) is performed on the left side. After SNX, animals are allowed to recover for two days followed by LNNA in drinking water (20 mg/L) for a further period of 4 weeks. A high salt diet (6%), supplemented in ground chow (see time line Figure 1), is continued throughout the experiment. Progression of renal failure is followed over time by measuring plasma urea, systolic blood pressure and proteinuria. By six weeks after SNX, renal failure has developed. Renal function is measured using 'gold standard' inulin and para-amino hippuric acid (PAH) clearance technology. This model of CKD is characterized by a reduction in glomerular filtration rate (GFR) and effective renal plasma flow (ERPF), hypertension (systolic blood pressure&gt;150 mmHg), proteinuria (&gt; 50 mg/24 hr) and mild uremia (&gt;10 mM). Histological features include tubulo-interstitial damage reflected by inflammation, tubular atrophy and fibrosis and focal glomerulosclerosis leading to massive reduction of healthy glomeruli within the remnant population (&lt;10%). Follow-up until 12 weeks after SNX shows further progression of CKD.

A two-stage method to establish chronic kidney disease (CKD) in the Lewis rat by surgically removing 5/6th of renal mass is described. Combination of the surgical procedure, NOS-inhibition and a high-salt diet leads to a model resembling human CKD, allowing study of causal mechanisms and development of novel therapeutic interventions.

5/6th Nephrektomie in Kombination mit hohen Salz-Diät-und Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmung zu Chronic Kidney Disease in der Lewis-Ratte induzieren

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Eine mögliche Zebrafisch-Modell der Kidney Disease: Knockdown von<em&gt; Wnt5a</em&gt; Ursachen Zysten in Zebrafisch-Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

Symmetrische Bihemispheric Postmortem Gehirn Schneiden Gesund und krankhafte Gehirnbedingungen beim Menschen zu studieren

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Ein Modell Simulieren von klinisch relevanter Hypoxie beim Menschen

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

Abgabe von exogenen künstlich synthetisierten miRNA-Nachahmungen an die Niere unter Verwendung von Polyethylenimin-Nanopartikeln in verschiedenen Mausmodellen für Nierenerkrankungen

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...