We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Erzeugung und Validierung von Fluorescent Protein Chimären <ol><li> Append grün fluoreszierende Protein (GFP) an die Amino- oder Carboxytermini des Proteins von Interesse unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien, 13. HINWEIS: Auch wenn wir GFP ausgiebig genutzt, andere Varianten wie zum Beispiel Cyan Fluorescent Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), DsRed und mCherry eingesetzt werden. Verbesserungen in der Fluorophor Faltungseffizienz, Helligkeit und Lichtstabilität werden ständig gemacht, und Ermittler sollten sich über die neueste Generation Konstrukte in Anspruch nehmen. <ol><li> Bestätigen korrekte DNA-Sequenz und sicherzustellen, dass die GFP-Einheit ist im Rahmen mit dem interessierenden Protein. Führen Sequenzierung unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien 21. HINWEIS: Viele Institutionen haben Kern DNA Einrichtungen, die der Ermittler ist aufgefordert, für weitere Informationen zu kontaktieren. </li><li> Für Einzel- oder Doppelpass Membranproteine ​​zu erzeugensowohl Amino- und Carboxylende Versionen der Fusionsproteine ​​19. </li><li> Für Multi-Spanning Proteine ​​einfügen GFP im vermeintlichen extramembranären Schleifen, sowie die Enden. Besondere Vorsicht beim Erzeugen Trans Chimären mit dem fluoreszierenden Fusionsprotein mit dem Amino-Terminus des Zielproteins befestigt, wie Signalsequenzen werden oft durch Proteolyse abgespalten, sobald das Protein durch die ER Translokon geleitet. </li><li> Im Fall von noch vorhandenen Signalsequenzen, legen Sie die fluoreszierende Fusionsprotein distal der Spaltstelle, um ein reifes Protein eine intakte aminoterminale getaggte fluoreszierendes Protein enthält, zu erzeugen. Beschäftigen rekombinanten DNA-Standardstrategien zur Erzeugung von Chimären 21. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Anwesenheit von ausreichend entsprechend lokalisierten Fluoreszenz-Signal in der Zelllinie von Interesse. <ol><li> Beachten Sie die Zellen unter Epifluoreszenzmikroskopie mit Hilfe der Eigenfluoreszenz von GFP unter entspreaß Filter festgelegten Bedingungen. Für GFP Filtersätze, die von 510 bis 560 nm umfassen, zu bestätigen, dass die richtigen Filter für die verwendete Fluorophor verwendet. HINWEIS: Ein ausreichendes Signal wird erreicht, wenn Beurteilung mit dem Auge bietet stark genug empfangen, dass die Zellstruktur, in dem das Signal liegt leicht über dem Untergrund gelöst. Zusätzlich sollte das Färbemuster des GFP-Proteins mit derjenigen von Markern zur geeigneten Organelle, und vorzugsweise identisch mit der des nativen unmarkierte Protein sein. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie, ob eine stabile oder transiente Transfektion Ansatz wird basierend auf das Protein evaluiert genutzt werden. HINWEIS: Stabile Transfektanten in der Regel leisten niedrigere Expressionsniveaus als vorüberSysteme. Obwohl die transiente Expression ergibt eine hohe Expression von Proteinen und der Erhöhung der Signalintensität (~ 5-24 h nach der Transfektion in Abhängigkeit von dem Protein), kann es auch zu einer Überexpression Artefakte wie Protein aggr führenegation oder Sättigung der Proteintargetingsignalwege, was zu fehlerhaften subzelluläre Lokalisation. </li></ol> 2. Transfektion von Zellen und Zellkultur ANMERKUNG: Eine Vielzahl von Zellen sind zugänglich für FPP-Analyse, einschließlich HEK293, HeLa, COS-7 und CHO-Zellen 14. Die folgende Beschreibung ist auf das Ausdrücken von Membranproteinen in HEK293-Zellen. <ol><li> Wachsen menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) als adhärente Monolagen in 6 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Natriumpyruvat und 250 &amp; mgr; g / ml Penicillin / Streptomycin ergänzt war, bei 37 &amp; deg; C mit 5% CO 2. Alle Arbeiten mit Zellen in einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze. Wachsen Zellen, die in Kulturmedium, bis ~ 80% Konfluenz in einem T-75-Kolben. </li><li> Transfektion von Zellen mit jedem Standard-High-Effizienz, geringe Toxizität Transfektionsmethode, einschließlich Lipid-, viral- oder Elektroporation basierenden Technologien zu generieren transient oder stabile Expression. Typischerweise 2 &amp; mgr; g Plasmid-DNA pro 1 × 10 6 Zellen ergibt gute reproduzierbare Proteinexpression. Pflegen Zellen 5-48 h in geeigneten Gewebekulturmedien bei 37 ° C in einem CO 2 fähig Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Überwachungszellen für die Expression des GFP-Fusionsprotein unter Verwendung der Epifluoreszenzmikroskopie, mit der intrinsischen Fluoreszenz von GFP-Signal, unter Verwendung von geeigneten Filtersätze gemäß dem Protokoll des Herstellers. Fluoreszenzsignal in der Regel ein Maximum erreicht innerhalb von 24-72 Stunden nach der Transfektion. Verwenden Sie Zellen, wenn das Fluoreszenzsignal einen Maximalwert erreicht. Überwachen Proteinexpressionsniveaus durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die entweder gegen das Protein von Interesse oder das GFP-Einheit geleitet. </li><li> Für experimentelle Analyse Platte Zellen auf beschichteten Deckgläsern. Sehen Sie entweder im Rahmen eines Live-cell-Konfiguration oder nach Fixierung und Montage auf Objektträger. Plattenzellen auf 60% bis 80% Zusammenfluss innerhalb von 24-48 h erreicht. <ol><li> Coat Deckgläser mit Poly-Lysin-Lösung (0,1 mg / ml), so dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren für 30 min unter einem UV-Licht bei Raumtemperatur, gefolgt von 60 min in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C. Überschüssiges Poly-Lysin und spülen Sie die Deckgläser in PBS 3 mal. </li><li> Alternativ Platte die Zellen auf einem Kammer-Deckglas, bestehend aus Zellkultur-Platten mit einem optischen Glasboden, um direkte Abbildung mit Öl-Immersionsobjektive ermöglichen. Die tatsächliche Mikroskopie Setup hängt davon ab, den der Forscher Ausrüstung, sollte aber in der Lage, eine schnelle Lösung Änderungen. Je nach Zelltyp und der Zellform, sollten Zellen um 60-90% konfluente zum Zeitpunkt des FPP-Assay. </li></ol></li></ol> 3. Fluoreszenzmikroskopie-Setup <ol><li> Verwenden Sie eine hohe numerische Apertur (NA) Ölimmersionsobjektiv für maximale Signalerfassung und räumliche Auflösung, wie ein 60X, 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv. Verwenden the folgenden Laser, um die Fluorophore anzuregen: Argongas 488 nm (GFP und YFP) und 561 Dioden (RFP, mCherry). </li><li> Bestimmen Sie die optimale Belichtung, Verstärkung und Erfassungsrate der Bilder für jedes Konstrukt. Passen Laserintensität und Belichtungszeit zu minimieren Photobleaching (siehe Schritt 7.1.2). </li><li> Für Studien mit mehreren Fluorophoren (zB ein löslicher Marker für Membranpermeabilisierung im Konzert mit einem Membran-Protein-Marker), wählen Sie entsprechende Filtersätze zur Signalübersprechen zu minimieren und Signal-zu-Rausch-Verhältnis. </li></ol> 4. Aufbau Optimale Bedingungen für Plasma Membranpermeabilisierung <ol><li> Entfernen des Zellkulturmediums von den Zellen nur lösliche fluoreszierende Proteine ​​exprimieren (zB EGFP, DsRed). In KHM Puffer waschen der Zellen 3 mal (jeweils 1 min) (110 mM Kaliumacetat, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Führen Sie Versuche mit Zellen und alle Reagenzien bei Raumtemperatur. </li><li> Ortszellen on Deckgläser (siehe Schritt 2.4) in KHM-Puffer auf einem Fluoreszenzmikroskop Bühne und sammeln Sie das erste Bild, das die Kontrolle &quot;nicht-permeabilisierten&quot; Stufe stellt. </li><li> Um selektiv durchdringbar, die Plasmamembran, fügen Digitonin (30 uM) in KHM Puffer zu den Zellen. Perfundieren Zellen mit Puffer (buffer + Digitonin) mit einer Geschwindigkeit von 5 ml / min für 10-60 sec. </li><li> Bestimmung der optimalen Digitonin Konzentration durch die schrittweise Erhöhung der Konzentration von Digitonin. Die optimale Digitonin Konzentration erreicht wird, wenn eine vollständige Verlust der Fluoreszenz-Signal von löslichen EGFP innerhalb 10-60 sec Digitonin Anwendung. Für viele Zellen Anwendung von 10-50 &amp; mgr; M Digitonin ausreichend ist, um die Zellmembran zu permeabilisieren. <ol><li> Für alle Anwendungen, die niedrigste mögliche Konzentration von Digitonin. Sammeln Sie die Bilder nach der Digitonin permeabilisierten Permeabilisierung für Hintergrundsignal. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie, dass die GFP-Protein-Chimäre der Umgebung ist die Membran indurch Bestätigen zelluläre Retention des Fluoreszenzsignals nach Digitonin Permeabilisierung der Plasmamembran 16 integriert. <ol><li> Express eine Organelle spezifische fluoreszierende Protein 23. Mitochondriale Proteine ​​funktionieren gut in dieser Hinsicht 16 zB pDsRed2-Mito Vektor. Bestimmen Sie die optimale Expression Bedingungen wie in Schritt 2.1 beschrieben. </li><li> Bestätigen, dass das Digitonin Konzentration für den Zelltyp, indem sichergestellt eingesetzt ist angemessen, dass die Morphologie der intrazellulären Organellen über lange (bis zu 60 min) Einwirkung Digitonin konstant bleibt. HINWEIS: Verwenden Sie Standard-Immunfluoreszenz-Protokolle unter Verwendung von Antikörpern gegen verschiedene Zellkompartimente wie Lysosomen (zB LAMP1), Golgi (zB TGN38) Endoplasmatischen Retikulum (zB Calnexin), Endosomen (zB Rab5), Mitochondrien (zB Cytochrom c). Wenn intrazellulären Organellen-Morphologie / Integrität ändert sich dramatisch over 60 min, ist es wahrscheinlich, dass das Digitonin-Konzentration zu hoch war, und erfordert die Verringerung Digitonin Konzentration und / oder der Belichtungszeit. HINWEIS: Digitonin ist durch Einatmen und Hautkontakt toxisch. Geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen. </li></ol></li></ol> 5. Protease Behandlung von Fluoreszierende Proteine <ol><li> Waschen Sie die Zellen in KHM Puffer und fügen Protease (Proteinase K; 50 ug / ml in Puffer KHM) direkt auf die Zellen. Perfundieren Zellen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min unter Verwendung einer Schwerkraftzufuhr Perfusionssystem kontinuierlich Bad wurde der Zubereitung. <ol><li> Shop-Lösungen in 50 ml Spritzen und Polyethylenschlauch verbunden unabhängige Reservoirs mit einem Verteiler mit einem einzigen Auslass am Bad (5 ml / min Durchflussmenge). Positionieren Sie eine Saugpipette, eine konstante (0,5 ml) Badvolumen erhalten und erzielen Lösung Austausch durch manuelles Umschalten zwischen Perfusion Stauseen. </li></ol></li><li> Sammeln Bilder, ob der Fluor bestimmenzier Signal bestehen bleibt oder verschlechtert. Ein Verlust von&gt; 90% der Ausgangssignalstärke über 30-60 sec ist konsistent mit den proteolytischen Abbau des GFP-Protein-Chimären (siehe Repräsentative Ergebnisse). </li><li> Wenn keine Signalverschlechterung durch Proteinase K zu beachten, wenn ein solcher Verlust zu erwarten ist, ersetzen Sie die Proteinase K-Lösung mit Trypsin (4-8 mM) in KHM-Puffer. Falls erforderlich, verwenden eine Mischung von Proteinase K und Trypsin. Es besteht keine Notwendigkeit, die Protease-Aktivität zu quenchen. </li></ol> 6. alternativer Ansatz für Plasmamembranproteinen mit externen Domains <ol><li> Für Plasmamembranproteinen, führen Sie den Test für externe fluoreszierende Proteine ​​Chimären vor Permeabilisierung Digitonin. Die Zellen auf Deckgläsern in KHM-Puffer (5 ml / min x 3 min) waschen, und nehmen Sie ein Bild für die Pre-Protease-Behandlung und Quantifizierung von Pre-Protease-Fluoreszenz-Signal, wie in Schritt 7. </li><li> Expose Zellen Protease (Proteinase K; 50 &amp; mgr; g / ml Trypsin oder 4-8 mM in KHM Puffer) in ter Abwesenheit Digitonin durch Perfusion der Zellen mit Medium, das KHM Protease (Fließgeschwindigkeit 5 ml / min). Sammeln Bilder des fluoreszierenden Proteins, um zu bestimmen, wie schnell das Signal verschwindet, oder wie lange das Signal andauert. </li><li> Bevor Digitonin Permeabilisierung quenchen alle Proteaseaktivität, entfernt, indem die Zellen dreimal (jeweils 1 min) in Zellkulturmedium, das 10% Serum (FBS). </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Perfusion mit KHM Puffer (Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min) für 2 min. Erwerben Sie eine pre-Permeabilisierung Bild. Permeabilisierung der Zellmembran, wie in Schritt 4 beschrieben. </li><li> Sammeln Sie Bilder folgenden Protease hinaus wie in Schritt 5 beschrieben. </li></ol> 7. Bildanalyse <ol><li> Verwenden eines Umkehrmikroskops fähig &quot;lebenden Zellen&quot; aufzunehmen, in dem der Verlust der Fluoreszenzsignal in Echtzeit überwacht werden. Zur kontinuierlichen Überwachung, beschäftigen identischen Parametern (Belichtungszeit, Verstärkung, Laserintensität, etc.). <ol><li> Bestimmen experimental Parameter durch Beobachten des Fluoreszenzsignals von der GFP-Protein von Interesse unter Kontrollbedingungen (dh KBH Puffer allein). Einstellen der Verstärkung, der Laserintensität und die Belichtungszeit-Einstellungen auf der computergesteuerten Mikroskop, um sicherzustellen, dass es keinen nennenswerten Verlust an Signalintensität über einen Zeitraum von 10-20 Minuten. HINWEIS: Die Signalstärke ist kein absoluter Wert, sondern auf dem Mikroskopsystem und verfügbaren Einstellungen für jedes PI basiert. Überwachen Sie Änderungen der relativen Fluoreszenzintensität. </li></ol></li><li> Alternativ lassen Zellen zu festgelegten Zeitpunkten in Digitonin gefolgt von Protease und fixieren Zellen vor der Montage auf Deckgläser für die Bildgebung. Bestimmen Sie den Zeitpunkten empirisch folgenden Verfahren in den Schritten 4 und 5. Für die erste Untersuchung, beginnen bei 0, 30, 60, 120 und 300 Sekunden nach der Zugabe von Digitonin oder Protease. <ol><li> Fix-Zellen (20 min bei Raumtemperatur) unter Verwendung einer ausreichenden Menge an Fixierungsmittel (3,7% Paraformaldehyd in PBS) vollständig versenken thE-Zellen. </li><li> Quench Restparaformaldehyd durch Spülen Zellen mit PBS, enthaltend 20 mM Glycin (3 x 5 min). </li><li> Montieren Sie Deckgläser durch das Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit aus dem Deckglas und Umkehren des Deckglases auf 50 ul Eindeckmittel auf einem Glasobjektträger für die Bildgebung. Die Objektträger dürfen über Nacht vor der Bildgebung zu trocknen. </li></ol></li><li> Sammeln Fluoreszenzmikroskopiebilder (unter den entsprechenden Filtern setzt kompatibel mit der Fluorophor verwendet wird) unter Verwendung der Videobild-Aufzeichnungsfunktion auf einer computergesteuerten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Quantifizierung Fluoreszenzsignalintensitäten als Funktion der Inkubationszeit Zustand. Besorgen Sie sich die mittlere Pixelintensität innerhalb einer Region of Interest (ROI), die eine einzelne Zelle umschließt. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

Die richtige Orientierung und Topologie von Membranproteinen ist von wesentlicher Bedeutung für die ordnungsgemäße Funktion. Trotz der Bedeutung des Verständnisses Membranproteintopologie gibt viele Proteine, für die diese Daten vollständig fehlen. FPP bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit zur Bestimmung Membranproteintopologie und eine, die von den meisten Labors durchgeführt werden können. Die FPP-Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber den bisherigen Methoden zur Bestimmung von Protein-Topolog...

Die Plasmamembranen sowie die zahlreichen intrazellulären Membranen dienen als Barrieren zwischen zwei wässrigen Kompartimenten. Im Fall der Plasmamembran, ist die Trennung zwischen der Außenseite und der Innenseite der Zelle; für intrazelluläre Organellen ist zwischen dem Zytoplasma und dem Organell Lumen. Zum Beispiel, das Endoplasmatische Retikulum (ER) Membran trennt eine oxidierende Umgebung in dem Lumen des ER aus einer zytosolischen reduzierende Umgebung 1. Membranproteine ​​sind für ER-assoziierten Ribosomen synthetisiert und erreichen ihre endgültige Topologie in der ER-Membran 2. Die Übernahme von geeigneten Membranorientierung und Topologie für Proteine ​​ist entscheidend für ihre normale Funktion. Korrekte Topologie ermöglicht relevanten Domänen von Membranproteinen mit ihren Bindungspartnern zu interagieren, kann es entscheidend posttranslationale Modifikationen auftreten, und im Fall von Plasmamembranproteinen, ermöglicht die Zelle zu interagieren und reagieren to seiner Umgebung. Um die Funktion des Membranproteins bewusst zu werden, ist es natürlich unbedingt wissen, wie das Protein wird mit Bezug auf die Membran in dem sie sich befindet, dh seine Membrantopologie orientiert. Zusätzlich zur Übernahme von wissenschaftlicher Grundlagenforschung, das Verständnis der Topologie eines Membranproteins und welche Aspekte einer Proteinoberfläche an unterschiedliche Umgebungen ausgesetzt hat klinische Implikationen gekennzeichnet, da Membranproteine ​​umfassen die Mehrheit der pharmakologische Targets 3. Bis vor kurzem Ansätze zur Bestimmung der Membranprotein-Topologie haben erhebliche Investitionen in Zeit und Geld erforderlich oder haben Reagenzien, die schwer zu bekommen sind erforderlich. Sowohl experimentelle und in silico Ansätze wurden verwendet, um die Membrantopologie von Proteinen, die sich innerhalb der Plasmamembran bestimmen. Da die ersten Vorhersagen der Membran-überspannende Domänen auf der Grundlage der Auswertung Hydrophobizität indiviDual Aminosäuren 3, zahlreiche Vorhersagealgorithmen sind jetzt im Internet verfügbar und einfach Wissen um Aminosäuresequenz des Proteins erfordern. Allerdings sind Annahmen oft von zentraler Bedeutung für eine solche Modellierungsprogramme, Annahmen, die zu falschen Zuordnungen der Topologie 4,5 führen kann. Hinzu kommt, dass diese Computer-basierten Vorhersagen versuchsmembranüberspannenden Regionen zuzuordnen, aber nicht immer, ob die Amino- oder Carboxy-Termini von Proteinen im Zytoplasma oder Zellorganelle Lumens außen. Selbst bei erhöhter Rechenleistung und die Verwendung von Maschinenlernalgorithmen 6, wie Daten noch ein Modell, und müssen mit experimentell ermittelten Daten validiert werden. Direkte experimentelle Bestimmung der Membrantopologie wurde unternommen unter Verwendung von Platten aus monoklonalen Antikörpern mit bekannten Epitopen gesamten Proteins, wobei die Bewertung ihrer Immunreaktivität wurde vor und nach Zellpermeabilisierung hergestellt wurde verteilt. DieseAnsatz erfordert eine Reihe von Antikörpern, die nicht für das Protein von Interesse verfügbar sein werden. Eine alternative Strategie ist es, Epitop-Tags, wie myc und Hämagglutinin (HA) in verschiedene Positionen in dem Protein, wiederum durch Bestimmung der Immunreaktivität vor und nach einer Membranpermeabilisierung gefolgt Engineer. Neben immunogene Tags, enzymatischen Tags (einschließlich alkalischer Phosphatase, β Galactosidase oder β-Lactamase-) und chemischen Modifikationen, wie Cystein Scannen wurden alle verwendet, um Membranproteintopologie 7,8 zu bestimmen. Eine weitere für die topologische Abbildung von Plasmamembranproteinen verwendete Methode beruht auf einem etwas anderen Ansatz, um Epitop-Tags. In diesem Verfahren wird der Tag-Sequenz ist der N-verknüpften Glykosylierung Consensussequenz NXS / T. Da nur Glykosylierung tritt auf, wenn eine solche Sequenz in das Lumen des Biosynthesewegs der Anwesenheit des Etiketts in einer Lumen Vergleich vorliegta Cytosol wird leicht als Massenverschiebung auf SDS-PAGE-Gelen beobachtet. Eine solche Vorgehensweise hat zur multispanning Ionenkanal CFTR 9 angewandt. Während all diese Ansätze verwendet worden, ist es klar, dass sie alle erfordern erhebliche Investitionen in der Molekularbiologie zu generieren und zu sequenzieren, die vielfältigen Konstruktionen. Um zu bestimmen, topologische Informationen bezüglich Transmembranproteine ​​innerhalb der intrazellulären Organellen hat sich als schwieriger. Die Applikation der fluoreszenzbasierten Technologien hat jedoch die Bestimmung der Membrantopologie viel einfacher. Die Technik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) beruht auf der Wechselwirkung zwischen zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins, das Wiederherstellen der fluoreszierenden Eigenschaften des Proteins 10. Obwohl zunächst zur Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo 10 beschrieben, hat dieser Ansatz auch dazu verwendet worden,Membranproteintopologie in pflanzlichen Zellen 11 zu bestimmen. Dieser Ansatz ist aber auch zeitintensiv, da sie die Bildung nicht nur von Fusionsproteinen mit dem Protein von Interesse, sondern auch eine Vielzahl von Fusionsproteinen in das Cytosol oder Organell Lumen gezielte benötigt und erfordert die Kenntnis über den intrazelluläre Membranen, die das Protein von Interesse besteht in . Ein alternativer einfacherer Ansatz zur Bestimmung Membranprotein Topologie beschrieben worden 12. Der Assay, Fluoreszenz-Protease Protection (FPP) erfordert die Erzeugung eines Fusionsproteins zwischen GFP und das Gen von Interesse. Der Ansatz basiert auf der relativen Zugänglichkeit unspezifische Proteasen zu dem GFP-Einheit basiert; je nachdem, ob GFP aus Proteolyse durch die sich in das Lumen des intrazellulären Organellen oder geschützt wird, um die Proteolyse durch wobei im Cytosol vorliegende ausgesetzt. Wenn somit das GFP Einheit an das Protein von Interesse steht das Zytoplasma, wird es zu belichtendenProtease-Aktivität und das Fluoreszenzsignal verloren. Umgekehrt, wenn das GFP-Einheit an das Protein von Interesse sieht eine Umgebung &quot;geschützt&quot; aus der Protease (wie die Golgi-Lumen) anschließend wird das Fluoreszenz-Signal bestehen. Damit Proteasen in die Zelle eindringen, aber nicht in den intrazellulären Membran Abteile der Cholesterinbindungsarzneimittel Digitonin verwendet. Cholesterin ist der dominierende Sterol in Vertebraten, und ist speziell in der Plasmamembran relativ zu intrazellulären Kompartimenten angereichert. Die Glycosid-Toxin, Digitonin, wird aus der Anlage Digitalis purpurea extrahiert. Digitonin eine Affinität für Cholesterin reiche Membranen, wo sie führt zu einer selektiven Membran permeabiliztion 14,16 (Figur 1). Zusätzlich dazu, dass die Ausfahrt der kleinen cytosolischen Komponenten ermöglicht Digitonin Permeabilisierung auch den Eintritt von exogenen Molekülen, wie Proteinase K oder Trypsin. Die FPP-Protokoll nutzt die fact, dass die Plasmamembran enthält bis zu 80% des zellulären Cholesterin 17, wohingegen andere Zellorganellen, wie ER, Golgi, Endosomen, Mitochondrien, die einen sehr geringen Cholesteringehalt aufweisen, intakte 14 verbleiben. Die selektiven Einbau von Cholesterin in die Plasmamembran wurde in vielen eukaryotischen Zellen beobachtet worden, die die Verwendung von Digitonin-abhängigen Plasma Membranpermeabilisierung in so unterschiedlichen eukaryotischen Spezies wie S. cerevisiae die menschliche 14,18. Die FPP-Assay bietet eine einfache, schnelle und ziemlich robust Mittel zur Bestimmung (a) ob ein Protein membrangebunden / verknüpften oder im Cytosol und (b) die Domäne eines Membranprotein frei diffusions Gesichter der Cytosol oder Organelle Lumen. Sollte ein Membranprotein mehrere Orientierungen, wird das Signal von der dominanten Form entstehen und kleinere Formen werden nicht erkannt. Zwar gibt es einige Bedenken, dass die Zugabe eines GFP-Einheit an das Protein an Interesse kann die Funktion beeinträchtigen und/ Oder subzelluläre Lokalisierung, das ist eigentlich mehr theoretisch als tatsächlich. Tatsächlich wurden viele Studien haben klar gezeigt, dass die GFP-Tag nicht die Eigenschaften des Proteins 19,20 verändern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plasma Membranpermeabilisierung Effiziente Plasma Membranpermeabilisierung wird durch die Verwendung von löslichen, fluoreszierenden Proteinen (zB GFP, DsRed) (Schritt 4) bestimmt. Diese Proteine, wenn sie in Zellen exprimiert wird, frei im Cytosol diffundieren und gehen verloren, wenn die Plasmamembran mit Digitonin (Abbildung 2) permeabilisiert. Ein vollständiges Verschwinden der Fluoreszenz-Signal sollte innerhalb von 10 bis 60 sec von Digitonin Anwend...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K Aufrufe.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

Serie: Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Die Cell-basierten L-Glutathion Schutz Assays zur Endozytose und Recycling von Plasmamembranproteinen Studieren

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.