Ein SEC-Profil ist eine leistungsstarke Methode, um die Qualität eines Proteins zu analysieren. Ziel ist es, mittels Fluoreszenz ein SEC-Profil für ein Membranprotein zu erstellen, das Aufschluss über die Probenqualität geben kann. FSEC verwendet kleine Probenmengen und kann zur Aufreinigung durchgeführt werden, ist relativ einfach und kann auf Geräten durchgeführt werden, die in vielen Labors verfügbar sind.
Das Verfahren wird von Jack Wright, einem leitenden Proteinwissenschaftler von Peak Proteins, demonstriert. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zellpaletten, indem Sie die bei minus 80 Grad Celsius bei Raumtemperatur gelagerte Zellpalette 15 Minuten lang auftauen oder bis die Probe nicht mehr gefroren ist. Bewegen Sie die Probe sofort auf Eis.
Um die Probe wieder zu suspendieren und zu solubilisieren, fügen Sie der Zellpalette zwei Milliliter des Solubilisierungspuffers hinzu. Inkubation mit End-over-End-Inversion bei vier Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten. Fügen Sie dann vorgemischte Waschmittelbrühe hinzu, um eine Endkonzentration von 1% Dodecylmaltosid oder DDM und 0,1% Cholesterinhemisuccinat oder CHS zu erhalten.
30 Minuten lang mit Ende-über-Ende-Inversion bei vier Grad Celsius auflösen. Um einen Zentrifugationsschritt mit niedriger Geschwindigkeit durchzuführen, zentrifugieren Sie die Probe in einer Tischzentrifuge mit einem ausschwenkbaren Eimer und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 2000 g. Führen Sie dann eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation durch, indem Sie den Überstand von der Niedergeschwindigkeitszentrifugation in Ultrazentrifugationsröhrchen übertragen, wobei eine stumpfe Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist.
Achten Sie darauf, die Palette nicht zu stören. Nachdem Sie die Röhrchenpaare ausbalanciert haben, legen Sie sie in einen Ultrazentrifugationsrotor mit festem Winkel und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250.000 g. Bereiten Sie das schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie- oder FPLC-System vor, indem Sie das System mit Größenausschlusschromatographie oder SEC-Puffer füllen und die Luftpumpen spülen.
Schließen Sie die SEC-Säule an die FPLC an, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Säule eindringt. Die SEC-Säule wird voräquilibriert, indem sie in 1,5-fachem Kolonnenvolumen destilliertem und gefiltertem Wasser in Laborqualität gewaschen wird, gefolgt von dem 1,5-fachen Säulenvolumen SEC-Puffer bei der empfohlenen Durchflussrate und dem empfohlenen Druck für die Säule. Um das SEC-Experiment durchzuführen, übertragen Sie den Überstand aus dem Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsschritt auf eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen Nadel, die an der Spritze befestigt ist.
Legen Sie die Sample-Schleife auf "Load" fest. Überfüllen Sie eine 500-Mikroliter-Probenschleife, indem Sie 600 bis 700 Mikroliter der Probe aus der Spritze in die Ladeöffnung injizieren. Als nächstes injizieren Sie die Probe aus der Schleife in die Säule, indem Sie sie mit vier Millilitern SEC-Puffer bei der empfohlenen Durchflussrate und dem empfohlenen Druck entleeren.
Lassen Sie die Säule mit der gleichen Durchflussrate laufen, bis das 1,5-fache des Puffervolumens passiert ist, und beginnen Sie mit dem Sammeln von 90 Fraktionen von 0,2 Millilitern, nachdem Sie das 0,25-fache des Säulenvolumens passiert haben. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 90 Mikroliter destilliertes Wasser in Laborqualität aus einem Reservoir in jede Vertiefung einer undurchsichtigen Platte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen. Übertragen Sie dann die 10 Mikroliter der Proben von einer 96-Well-Platte auf die undurchsichtige 96-Well-Platte mit flachem Boden und legen Sie die Well-Platte in einen Plattenleser.
Für das fluoreszenzmarkierte GFP et die Anregung so nah wie möglich an 488 Nanometer und die Erkennung der Fluoreszenzemission so nah wie möglich an 507 Nanometer, bevor das Signal gemessen wird. Die Untersuchung des Dynamikbereichs und der unteren Grenzen des verbesserten grün fluoreszierenden Proteins oder der EGFP-Detektion für den Plattenleser ergab, dass der Plattenleser eine untere Nachweisgrenze von 30 Nanogramm und einen Dynamikbereich von bis zu 500 Nanogramm EGFP-markiertem Protein pro Well vor der Signalsättigung aufwies. Die Umrechnung der Elutionsvolumina in Kav und die Darstellung gegen logarithmische Molekulargewichte ermöglichte die Abschätzung des Molekulargewichts der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durch Interpolation der Standardkurve.
Die optimalen Bedingungen für die Membranextraktion wurden untersucht, indem das DDM- und Laurylmaltose-Neopentylglykol gegen die detergenzientfreie Extraktion mit Styrol-Maleinsäure-Copolymer getestet wurde. Die Wirkung der Ligandenaddition auf das Fluoreszenzgrößen-Ausschluss-Chromatographieprofil wurde durch Zugabe von Sphingosin-1-phosphat oder S1P zur Probe während der Solubilisierung untersucht. Die in Gegenwart von S1P solubilisierte Probe zeigte eine überlegene Spur mit reduzierter Aggregation.
Die Untersuchung der Langzeitstabilität des Serotoninrezeptors 5HT2AR unter verschiedenen Bedingungen zeigte, dass das Protein in Styrol-Maleinsäure-Lipidpartikeln auch bei ungünstigen Temperaturen länger stabil blieb. Die Zeit zwischen dem Punkt der Solubilisierung und dem Durchgang der Probe durch die SEC-Säule ist zeitkritisch. Es darf keine Pausen geben und die Probe muss kalt gehalten werden.
Nach der FSEC wird ein Verständnis für das beste Konstrukt, das beste Reinigungsmittel oder den besten Puffer gewonnen. Dies ermöglicht die Optimierung der Proteinaufreinigung und unterstützt die nachgelagerte biophysikalische und strukturelle Charakterisierung.
