Wir möchten Thomas Lecuit (SQH Utrophin :: GFP-Linie), die Bloomington Stock Center, und der Entwicklungsforschung Hybridoma Bank für Reagenzien danken. Wir danken ferner alle Mitglieder der Tootle Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Finanzierung durch die National Science Foundation MCB-1158527 und Start-up-Fonds aus der Anatomie und Zellbiologie Department, University of Iowa unterstützt diese Arbeit. National Institutes of Health Predoctoral Ausbildungsförderung in Pharmakologische Wissenschaften T32GM067795 AJS unterstützt. Datenspeicherung Unterstützung wurde von der ICTS, die durch die CTSA vom National Center for Research Resources und dem National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unterstützt durch Zuschuss UL1RR024979 finanziert wird.

1. Vorbereitung Drosophila Vor der Isolation Bühne <ol><li> Machen nassen Hefe-Paste durch die Kombination von 50 g Trockenhefe mit 90 ml destilliertem Wasser. Mischen Sie mit einem Spatel zu kombinieren. Lassen Sie die Mischung für ca. 30 Minuten vor der Beurteilung Konsistenz. Die Konsistenz sollte nur dick genug, um an der Seite einer Fliege Fläschchen halten, aber nicht heruntergekommen die Seite. Um die gewünschte Konsistenz zu erreichen, kann es notwendig sein, bis zu 10 ml zusätzlichem Wasser oder einer kleinen Menge von Trockenhefe hinzuzufügen. Lagerung in einem geschlossenen Behälter bei 4 ° C Die gespeicherte Hefe kann für ~ 1-2 Wochen verwendet werden. </li><li> Sammeln &lt;24 h alten erwachsenen Fliegen (beide Männer und Frauen) der gewünschten Genotypen und legte sie in ein Fläschchen mit Fliegen Essen und nasse Hefe-Paste auf der Seite der Fläschchen verschmiert. Die Temperatur, bei der die Fliegen gehalten wird abhängig von dem Experiment ab. Für Routineversuche werden entfernt bei Raumtemperatur gehalten. Wohingegen Versuche, in denen ein Genwobei unter Verwendung des Systems 15 UAS/GAL4 überexprimiert erfordern die Aufrechterhaltung der Fliegen bei 25 ° C oder höher ist, als angemessen. </li><li> Geben Sie die Fliegen mit einer frischen Abstrich von Hefe-Paste täglich für 2 Tage. HINWEIS: Follikel-Entwicklung ist eng mit den Ernährungszustand des weiblichen Fliege reguliert, ist es wichtig, die Fliege mit dem nährstoffreichen Hefe-Paste für mindestens 36 Stunden vor der Präparation werden. </li></ol> 2. Isolieren von Mid-zu-spät Inszenierte Drosophila Follikel <ol><li> Ermöglichen, dass die Medien auf Raumtemperatur (~ 30 min) kommen. Wenn die Follikel inszeniert gehen, um für in-vitro-Entwicklungstests verwendet werden, frisch vorbereiten IVEM Medien (Grace Insekten Medien, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin). Wenn die Follikel inszeniert gehen, um verwendet für die mRNA-oder Proteinisolierung entweder Grace Insekt oder IVEM Medien werden. WICHTIG: Medientemperatur ist kritisch. Wenn die Medien ist kalt wird es ändernsowohl das Aktin und Mikrotubuli-Zytoskelett und Blockbebauung. </li><li> Anesthetize die Fliegen in der yeasted Fläschchen durch die Injektion von CO 2-Gas und legen 3-5 weibliche Fliegen auf einer Fliege Lage unter CO 2. WICHTIG: mehr Frauen, als in einem 10 Minuten Zeit auf der Fliege Pad seziert Lassen Sie keine verlängerte Exposition gegenüber CO 2 verursachen können Unfruchtbarkeit und Tod. </li><li> Füllen Sie eine Vertiefung einer 9-Punkt-Platte mit Medien und legen Sie es auf einer dunklen Fläche (ein Stück schwarzes Plexiglas funktioniert gut). Fokussieren Sie das Binokular auf dem Grund des Brunnens. </li><li> Mit # 5 Dumont Zange holen eine einzige Frau mit einer Hand (dies wird am besten mit der dominanten Hand). Es ist oft am einfachsten zu holen die weiblichen von den Flügeln, Beinen, Bauch oder Brustkorb Übergang. Tauchen Sie die Frau in den Medien gut gefüllt. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops wie nötig. </li><li> Mit einer zweiten Pinzette in der nicht-dominanten Hand, greifen die weibliche am vorderen Ende des Abdomensso dass das hintere Ende in Richtung auf die dominante Hand (2A) angeordnet ist. Stellen Sie sicher, die Fliege in den Medien unter Wasser zu halten. </li><li> Mit der dominanten Hand, verwenden Sie die Zange, um die Nagelhaut bei der 2. hintersten pigmentierte Segment packen und zerreißen es vom Rest des Bauches (2B-C). </li><li> Mit der Zange in der dominanten Hand, drücken Sie leicht die vorderen Ende des Abdomens, bis die Eierstöcke entstehen (Abb. 2D-E). Falls nötig, in die Zange zwischen den beiden Eierstöcke und ziehen sie aus der Karkasse. </li><li> Entweder gehen die Eierstöcke zu einer neuen und mit frischem Medium (2F) oder entfernen Sie die Karkasse zu einem Kimwipe oder Papiertuch. Dies ist besonders wichtig, wenn Follikel ist für die in vitro Entwicklung isoliert. </li><li> Wiederholen, bis 3-5 Paar Eierstöcke isoliert. HINWEIS: Jeder Eierstock ist von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifung Follikel zusammen. Jeder Ovarioleinnerhalb einer Muskelhülle enthalten. </li><li> Mit Stift Schraubstöcke und die mit ihnen gelieferten Nadeln vorsichtig auseinander ziehen den Eierstock, indem Sie die Nadeln zwischen den Ovariolen (2G). Dies wird manchmal lösen die einzelnen Follikel als gut. </li><li> Individuelle Ovariolen und die leicht zu unterscheiden morphologischen Stadien der Follikel-Entwicklung sollte jetzt sichtbar (Abbildung 2G, neckte auseinander Ovar) sein. Siehe Fig. 1 und 2H morphologischen Unterschiede, die verwendet werden können, um die verschiedenen Phasen zu unterscheiden. Um Follikel, die in intakten Ovariolen sind und immer noch innerhalb einer Muskelhülle enthalten isolieren, verwenden Sie eine Nadel, über die an der vorderen Ovariole des vorangehenden Follikel und an der hinteren der Follikel unmittelbar nach der Follikel von Interesse geschnitten. Dadurch wird die Muskelhülle zu brechen und die Follikel von Interesse kann nun entfernt von den benachbarten Follikel ohne es zu beschädigen geschnitten werden. </li&gt; <li> Da die einzelnen Stufen voneinander getrennt sind, bewegen Sie die Follikel von Interesse, mit einer Glaspipette, zu einem neuen und frischen Medien. Dies ist besonders wichtig bei der Isolierung von Follikeln zur in vitro-Entwicklung. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Pipette Glühbirne vor dem Eintritt in die Medien, um die Luftblasen aus Umverteilung der Follikel of Interest der auch verhindern zu quetschen. Außerdem, wenn die Follikel Verkleben mit der Glaspipette, die Pipette mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) durch Pipettieren der BSA-Lösung und mehrmals nieder und Spülen mit Sezieren Medien vorbeschichtet werden. </li><li> Sobald genügend Follikel isoliert wurden, fahren Sie mit den nachfolgenden Experimenten. </li></ol> 3. In-vitro-Entwicklung von S10B Follikel <ol><li> Isolieren S10B Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) in IVEM Medien. Stellen Sie sicher, dass die Follikel schnell von Schutt bewegt. Da diese Follikel weiter zu reifen, ist es important dass S10Bs sind für 30-60 min gesammelt und dann in die Reifung Medium der Wahl gestellt. HINWEIS: S10B müssen sorgfältig von S10A Follikel (Fig. 1C im Vergleich zu 1B) unterschieden werden, wie S10A Follikel nicht im IVEM Kulturmedien reifen. In beiden S10A und S10B Follikel wird die Hälfte der Länge der Krankenschwester Zellen zusammengesetzt und die andere Hälfte ist die Eizelle, aber in S10B die Länge der Follikel gleich, dass der S14 Follikel ist. </li><li> Mit einer Glaspipette, bewegen ~ 30 S10B Follikel in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie überprüfen, ob alle der Follikel übertragen sind S10B und nicht zu S11 gereift. </li><li> Bereiten 1 ul der Reifung Medien pro Vertiefung, dh IVEM Medien sowie pharmakologische Reagenzien. </li><li> Mit einer Glaspipette gezogen *, entfernen Sie so viel Medien aus dem Brunnen (Schritt 3.2), wie möglich und schnell hinzufügen Reifung Medium der Wahl. HINWEIS: Es ist wichtig, ein Glas gezogen pip verwendenette als inszeniert Follikel kann leicht entweder mit Glaspipetten oder Pipettenspitzen mit einem Pipetman genommen werden. * Um gezogen Pipetten machen: 1) erhitzen das dünne Teil der lang, Glaspipetten in der Flamme eines Bunsenbrenners nur, bis das Glas weich zu werden beginnt, 2) die Pipette sofort zu bewegen aus der Flamme und ziehen horizontal, um die Pipette in zeichnen ein feiner Schlauch, 3) zu brechen, um eine Geldstrafe zu generieren. VORSICHT: Augenschutz wie Glasscherben können sich lösen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4 für so viele Brunnen, wie das Experiment erfordert. </li><li> Lassen Follikel für&gt; 10 h entwickeln und Gäste die Entwicklungsfortschritt unter einem Binokular. HINWEIS: Die Experimente werden in der Regel am nächsten Tag hat, um ausreichend Zeit für die Follikel entwickeln kann. S10B ist ~ 5 Stunden, ist S11 ~ 30 min, S12 ~ 2 h und S13 ~ 1 Stunde Dauer bei 25 ° C 1 und Entwicklung bei Raumtemperatur wird etwas länger dauern. Ähnliche Experimente wie für S10B Follikel beschrieben werden kannunter Verwendung von S11-S13 Follikel. </li></ol> 4. Bühnen Isolierung für die Live-Imaging <ol><li> Isolieren spät Follikel (S10B-14), in den Fluoreszenzmarker der Wahl mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) in IVEM Medien, schnell bewegt Follikel weg von Schutt. </li><li> Bewegen Sie Follikel von Interesse in neuen Medien und dann durch Glaspipette übertragen, um einem Deckglas Boden Petrischale. Achten Sie auf Medien hinzufügen, so dass es sprudelt in der Deck unteren Bereich, aber nicht überschwappen. </li><li> Für längere Zeitraffer-Filme, ist es manchmal notwendig, um Feuchtigkeit in der Petrischale durch Zugabe einer aufgerollt Kimwipe, mit Wasser befeuchtet, an den inneren Rand der Petrischale zu halten. Legen Sie den Deckel auf. </li><li> Bild auf einem inversen Mikroskop. Detailauflösung wird der konfokalen Mikroskopie erforderlich. Es ist notwendig, Frequenz-Bildgebung, Beleuchtungsstärke und die Länge des Abbildungsleichen, dies muss unabhängig arbeitet werden für jedes lAbeling Werkzeug-und Entwicklungsprozess. </li></ol> 5. Bühnen Isolierung für die mRNA-Vorbereitung <ol><li> Isolieren Sie einzelne Stufe Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) entweder mit Grace oder IVEM Medien. </li><li> Mit einer Glaspipette, verschieben Sie die einzelnen Stufen von Interesse in neue Brunnen mit den Medien, ist es möglich, mehrere Stufen auf einmal zu sammeln. </li><li> Halten Abholzeiten unter 1 Stunde. Bewegen Sie die Follikel, mit einer Glaspipette auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Drehen Sie das Rohr kurz in einem Mini-Mikrozentrifuge, um alle Follikel zu pelletieren. Mit einer Glaspipette gezogen (siehe Schritt 3.4) entfernen Sie vorsichtig alle Medien. HINWEIS: Wenn Sie eine volle Größe Mikro, Spin-Down der Follikel bei niedriger Geschwindigkeit. </li><li> 100 l Trizol und schleifen von Hand für ~ 20 sec mit einem Kunststoff-Stößel. Spin down bei voller Geschwindigkeit in einer Mikro und bewegen Trizol auf ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig, keine pelletiert d störenebris. Bei -80 ° C </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,1-5,5 bis genügend Follikel wurden für das Experiment erhalten wurde. Routinemäßig ~ 75 S10B, ~ 75 S12 und S14 ~ 100 Follikel ergeben ~ 10 ug RNA. </li><li> Tauen Sie die Proben auf Eis. Kombinieren Proben, gegebenenfalls in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bringen die Trizol Volumen von bis zu 800 ul. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung, wie vom Hersteller gerichtet. WICHTIG: Denken Sie daran, DNase behandeln die isolierte RNA mit RNase freier DNase. </li></ol> 6. Bühnen Isolation für Western Blotting <ol><li> Heizen Sie einen Wärmeblock bis 100 ° C </li><li> Isolieren Sie einzelne Stufe Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) entweder mit Grace oder IVEM Medien. HINWEIS: Es ist notwendig, empirisch festzustellen, wie viele von einer bestimmten Stufe Follikel werden benötigt, um jede spezifische Protein zu beobachten. Für stark exprimierten Proteine ​​S10B 1-3 Follikel / gut genug, um ein starkes Signal auf einem Western-Blot zu sehen. Es ist jedoch wichtig, um einerepräsentativen Stichprobe unter Follikel aus mehreren Weibchen. Somit sind 15-20 Follikel einer bestimmten Stufe in der Regel gesammelt. </li><li> Follikel bewegen, unter Verwendung einer Glaspipette in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Spin kurz in einem Mini-Mikrozentrifuge, um die Follikel zu pelletieren (siehe Schritt 5.4). Mit einer Glaspipette gezogen Entfernen Sie vorsichtig alle Medien (siehe Schritt 3.4) und 50 ul 1x PBS und 50 ul 2x Laemmli-Puffer. </li><li> Schleifen von Hand für ~ 20 sec mit einer Kunststoff-Stößel. HINWEIS: Kunststoff Stößel kann zum Schleifen westlichen Proben durch Waschen und Autoklavieren sie wiederverwendet werden. </li><li> Kochen Sie die Proben für 10 min in der Wärmeblock. </li><li> Kühlen Sie kurz auf Eis und Spin bei voller Geschwindigkeit für 15 Sekunden in einer Mikrozentrifuge. Entweder sofort auf eine SDS-PAGE-Gel oder bei -20 ° C laden HINWEIS: Wenn die Proben gespeichert sind, denken Sie daran, die Proben vor dem Laden auf das Gel aufzukochen. </li><li> Führen Western-Blot-Analyse nach Standardprotokollen. </li></ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. 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H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kelso, R. 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Es gibt nichts zu offenbaren.

Die Drosophila Follikel von nur einer kleinen Anzahl von Zelltypen aufgebaut, so dass es ideal für morphologische und molekulare Analysen. Außerdem ist es aufgrund der Struktur des Eierstocks, ist es relativ einfach, eine große Zahl von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung mit einem gemeinsamen Binokular und minimales Training erhalten. Wie jede Stufe stellt eine kurze Zeitfenster, können Stufen-Isolations signifikante Einblicke in die molekularen Entwicklungsprozesse während dieser Phase auftrete...

Jeder Drosophila Eierstock von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifekammern oder-Ei Follikel zusammen. Jeder Follikel besteht aus einer einzigen Eizelle, 15 Keimbahn abgeleitet Krankenschwester oder Stützzellen und ~ 650 somatischen Zellen bezeichnet Follikel-Zellen (Abbildung 1A) zusammen. Wird Drosophila Oogenese in 14 morphologisch definierten Entwicklungsstufen 1 unterteilt. Jedes Stadium der Follikelentwicklung wird viele Male innerhalb einer Fliege beobachtet, so dass es relativ einfach, eine beträchtliche Anzahl von stufenspezifischen Follikel zu isolieren. Die mittleren bis späten Stadien der Oogenese (Stages 10B-14) sind besonders gut geeignet für die Bühne Trennung (Abbildung 1). In Stufe 10B (S10B) wird das Follikel vollständig gestreckt (dh gleich dem eines Stage-14 (S14) Follikel seine Länge, siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 H) und die Hälfte der Länge der Follikel der Krankenschwester Zellen zusammengesetztdie andere Hälfte ist die Eizelle (Abbildung 1C). In diesem Stadium die Krankenschwester Zellen durchlaufen dramatischen Aktin-Umbau, die Stärkung der kortikalen Aktin und Erzeugung parallelen Bündeln von Aktin-Filamenten 2. Zur gleichen Zeit, eine Bevölkerung von Follikel-Zellen, genannt zentripetalen Zellen wandern zwischen den Nährzellen und der Eizelle und zwei Rücken Gruppen von Follikelzellen angegebenen geworden, Migration zu unterziehen, um die Rückenanhänge, Röhrenatemgeräten für den Embryo bilden 3 . Die Zellen werden dann Krankenschwester Vertrag (S11), drückte ihre zytoplasmatische Inhalt in die Eizelle in einem Prozess namens Krankenschwester Zelle Dumping, das die Eizelle bietet mit den notwendigen Faktoren für sie Embryogenese (1D), um abzuschließen. Die Krankenschwester Zellen durchlaufen dann den Zelltod (S12-S13) 4, und die Follikel-Zellen sezernieren und die Eierschale Muster 5 (1E-G). So reich an wichtigen Entwicklungs eine ist das Ende der Oogenesed morphogenetischen Prozessen. Isoliert mittleren bis späten Stadium Follikel (S10B, S14) für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der molekularen Analysen verwendet werden. Beispielsweise kann mRNA aus statt Follikel für RT-PCR, Microarray isoliert werden oder RNA-seq analysiert. Dies erlaubt es, bei der Genexpression in kurzer Entwicklungs Fenster schauen, mit nur wenigen Zelltypen vorhanden, und bestimmen, wie die Genexpression entweder durch pharmakologische oder genetische Störungen verändert. Stufe Isolierung kann auch verwendet werden, um auf Proteine ​​durch Western-Blotting zu suchen. Eine solche Analyse ist wichtig, weil es erlaubt, die Höhe der Proteinexpression in Wildtyp-Mutanten gegenüber in bestimmten Phasen zu quantifizieren. Während einer Immunfluoreszenzanalysen verwenden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen, die Quantifizierung der Fluoreszenz weniger robust ist aufgrund der strengen Anforderungen, die alle Pixel innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises 6 sein. Zusätzlich können Western-Blot-Analyse von anderen Informationen, wie eins, wenn das Protein posttranslational modifiziert oder von einer bestimmten Spleiß-Isoform exprimiert. Isoliert Stufen können auch für weitere Proteinreinigung, einschließlich subzelluläre Fraktionierung oder Coimmunpräzipitation verwendet werden. Stufe spezifischen Follikel Isolierung kann auch für die in vitro Entwicklung Assays 7 und Live-Abbildungs ​​8 verwendet werden. Isoliert S10B-S13 Follikel wird weiterhin auf S14 in einfachen Kulturmedien zu entwickeln (siehe unten). Es ist wichtig zu beachten, dass S10A Follikel nicht durch Dumping Krankenschwester Zelle mit Hilfe der Kulturbedingungen in diesem Manuskript diskutiert Fortschritte. Wir haben S10B in-vitro-Tests zur Entwicklung der Rolle der Prostaglandine sowohl pharmakologisch und genetisch zu definieren, bei der Regulierung der Aktin-Umbau durch die Verwendung Krankenschwester Zelle Dumping und Entwicklung Auslesen 7,9. Ebenso können die späteren Entwicklungsstadien isoliert werden, um die Wirkungen von pharmakologischen Behandlungen oder genetische Menschen bestimmenipulations auf bestimmte Prozesse wie zentripetale Zellmigration, Rücken Anhängsel Migration / Bildung 10 und Krankenschwester Zelltod. Solche Tests können verwendet werden, um dominante Wechselwirkung Bildschirmen oder Tests durchzuführen, zum Beispiel, während Heterozygotie für Mutationen in pxt oder Fascin allein haben keine Auswirkungen auf S10B in vitro Entwicklung von Follikeln Doppel Heterozygoten zeigen Krankenschwester Zelle Dumping Fehler und ein Block in der Entwicklung 9. Darüber hinaus, da S10B-13 in Kultur entwickeln, werden alle Prozesse, die während dieser Zeit auftreten kann mit Live-Bildgebung beobachtet werden. Solche Bildgebung kann einfach mit Durchlicht (wenn man nur daran interessiert, große Änderungen in der Morphologie ist) oder mit der konfokalen Mikroskopie mit transgenen Fliegen exprimieren Fluoreszenzsonden oder Follikel mit Live-Bildfarbstoffe gefärbt durchgeführt werden. Live-Bildgebung verwendet wird, um unser Verständnis der Entwicklungsprozesse wesentlich voranzubringen. Tatsächlich leben imaging spät Follikel hat das Wissen der dorsalen Anhängsel Migration, ein Beispiel Tubulogenese 10 erweitert. Wir erwarten, dass die Live-Darstellung von zusätzlichen späten Stadium Prozesse, einschließlich der Aktin-Dynamik während Krankenschwester Zelle Dumping, werden neue Einblicke in diesen Entwicklungs Veranstaltungen. Es ist wichtig zu beachten, dass während S10A und frühen Stadien der Follikel-Entwicklung wird nicht weiter in der Kultur in eine S14 zu entwickeln, ist Live-Imaging von Veranstaltungen in diesen Stadien der Entwicklung auftreten können, die alternative Kulturbedingungen 11-14 (siehe Diskussion für mehr Information). Hier bieten wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung spät Follikel entweder für in-vitro-Entwicklung und Live-Bildgebung, oder molekulare Analysen (mRNA-und Protein-Trennung).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Drosophila Oogenese oder Follikel-Entwicklung wurde häufig verwendet, um das Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse und Zell biologischen voranzutreiben. Das Methodenpapier beschrieben, wie Sie mittleren bis späten Stadium Follikel (Stufe 10B-14) zu isolieren und zu nutzen, um neue Einblicke in die molekularen und morphologischen Ereignisse während dichte Fenster der Entwicklungs Zeit auftreten werden. Isolierte Haarfollikel kann für eine Vielzahl von experimentellen Techniken, einschließlich in vitro-Assays Entwicklung, Echtzeit-Bildgebung, mRNA-Analyse und Western-Blot-Analyse von Proteinen verwendet werden. Follikel bei Stage 10B (S10B) oder später wird die Entwicklung in Kultur zu vervollständigen, dies erlaubt es, genetische oder pharmakologische Störungen mit in-vitro-Entwicklung zu kombinieren, um die Auswirkungen dieser Manipulationen auf die Prozesse zu bestimmten Zeiten auftretenden Entwicklung zu definieren. Darüber hinaus, da diese Follikel entwickeln, in der Kultur, sind sie ideal für Live-Imaging-Studien geeignet sind, Die oft zeigen neue Mechanismen, die morphologische Ereignisse zu vermitteln. Isoliert Follikel kann auch für molekulare Analysen verwendet werden. Zum Beispiel können Veränderungen in der Genexpression, die von genetischen Störungen führen zu spezifischen Entwicklungs Fenster definiert werden. Zusätzlich können Protein-Ebene, die Stabilität und / oder posttranslationale Modifikation Zustand während einer bestimmten Stufe der Follikelentwicklung durch Western-Blot-Analysen untersucht werden. So Stufe spezifischen Isolierung von Drosophila Follikel bietet eine reiche Quelle von Informationen in stark konservierten Prozesse der Entwicklung und Morphogenese.

Bei der Isolierung von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung von Drosophila ist es wichtig, in der Lage, die unterschiedlichen morphologischen Stufen präzise zu unterscheiden. Dies ist für S10A und S10B etwas schwierig, da die Krankenschwester Zellen und die Eizelle nehmen jeweils die Hälfte der Länge der Follikel in diesen Phasen (Abbildung 1B im Vergleich zu 1C). Jedoch S10A Follikel kürzer als S10B Follikel, da die S10B Follikel vollständig gedehnt und somit in...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K Aufrufe.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden. 

Serie: The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Gezielte Expression von GFP in den Haarfollikel mit Ex Vivo viralen Transduktion

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Forschung

Biologie

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...