Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Epigenetik-Bereich zu beantworten, wie viel chromatische Modifikationen in einer zelltypspezifischen Weise zusammen mit Genomen reguliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir Chromatin aus den Zielzellen isolieren und dann typischzigeunernachgelagert folgen können. So kann diese Methode Einblicke in neuronspezifische Trimincil, Lysinc 4, opisoncilly.
Es kann auch auf andere Histonmodifikation, andere Zelltypen und dann andere Modellorganismen angewendet werden. Demonstrieren sie das Verfahren wird Mari Mito, ein Techniker aus meinem Labor. Um zu beginnen, verwenden Sie feine Federschere, um das Gewebe von Interesse in kleine Stücke zu sezieren.
Fügen Sie die Gewebefragmente in einen sauberen Behälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Übertragen Sie dann die Gewebefragmente in zwei Milliliter-Röhren, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt sind. Bewahren Sie die Rohre bei minus 80 Grad Celsius für fünf Minuten auf, wobei die Kappe geöffnet ist, um den flüssigen Stickstoff zu verdampfen.
Legen Sie die Rohre mit den Gewebeproben auf ein gekühltes Metalleisregal. Dann legen Sie eine Metallkugel in ein 1,5-Milliliter-Rohr und kühlen Sie es mit flüssigem Stickstoff. Legen Sie die gekühlte Metallkugel in eines der Probenrohre.
Schließen Sie die Kappe und setzen Sie die Röhre in den Rohrhalter eines kryogenen Schleifers. Tauchen Sie den montierten Rohrhalter sofort für eine Minute in flüssigen Stickstoff. Setzen Sie den gefrorenen Rohrhalter in die außenkassette des kryogenen Schleifers ein.
Und schütteln Sie es kräftig für 30 Sekunden, 60 Mal. Anschließend den kryogenen Schleifer zerlegen, entfernen Sie die Metallkugel. Und legen Sie die Röhre in einen vorgekühlten Probenkühler.
Den Kühler bei minus 20 Grad Celsius 15 Minuten aufbewahren. Dann fügen Sie 900 Mikroliter 1%Formaldehyd in das Rohr und die Pipette, um zu mischen. Übertragen Sie die Suspension auf ein neues Zwei-Milliliter-Rohr mit 900 Mikroliter n. Chr. 1%Formaldehyd.
Als nächstes fixieren Sie die Federung für 10 Minuten mit sanfter Drehung bei 23 Grad Celsius. Um die Fixierreaktion zu stoppen, fügen Sie 100 Mikroliter 2,5 Molglycin in das Rohr. Und Zentrifuge bei 3.000 Mal Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Danach entsorgen Sie den Superüberstand. Fügen Sie einen Milliliter PBS in die Röhre und Wirbel zu mischen. Zentrifuge bei 3.000-facher Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Wiederholen Sie diesen Waschschritt, zwei weitere Male. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Lyse Puffer eins auf das Pellet und Pipette zu mischen. Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 3.000-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie einen Milliliter Lysepuffer zwei in das Pellet und Wirbel zu mischen. Dann zentrifugieren Sie die Suspension für fünf Minuten bei 3.000 Mal Schwerkraft bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand. Danach fügen Sie 800 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Asssay-Puffer mit Protease-Hemmer-Cocktail in das Pellet und pipette zum Mischen.
Zentrifugieren Sie die Suspension für fünf Minuten bei 3.000-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes 500 Mikroliter RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail in das Pellet geben. Dann zentrifugieren Sie die Suspension für fünf Minuten bei 3.000 Mal Schwerkraft bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie einen Milliliter RIPA-Puffer mit Protease-Hemmer-Cocktail hinzu. Unmittelbar nach Zugabe des RIPA-Puffers mit Protease-Hemmer-Cocktail das Lysat in ein Beschallungsrohr übertragen. Und legen Sie das Rohr auf einen Ultraschallgerät.
Scheren Sie das Chromatin mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Einstellungen. Dann übertragen Sie die Probe in ein 1,5 Milliliter Protein Low Binding Tube. Und zentrifugieren Sie es für fünf Minuten bei 20.000 Mal Schwerkraft bei vier Grad Celsius.
Sammeln Sie den Überstand aus der Probe und übertragen Sie ihn in eine neue proteinarme Röhre. In diesem Protokoll wurde die Tandemchromatin-Immunpräzipizierung eingeführt und demonstriert. Während des Eingriffs wurde die Qualität der DNA in mehreren Schritten getestet.
Unmittelbar nach der Beschallung wurde die geerbte DNA isoliert und mit einer mikrofluidischen Elektrophoresemaschine getestet. Nach der Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern und Anti-H3K3me3-Antikörpern zur Affinitätsreinigung wurde die DNA-Qualität erneut überprüft. Die Spezifität der Immunreinigung von DNA auf H2B-FLAG wurde mit Negativkontrollproben bestätigt.
Wo vernachlässigbare Mengen an DNA entdeckt wurden. Weiter in das Protokoll hinein wurde die Qualität der Sequenzierungsbibliothek überprüft. Die erfolgreichen ChIP und T-ChIP wurden durch Anreicherungsanalyse mit Primern nachgewiesen, die auf die Promotorregion des GAPDH-Gens abzielten.
Repräsentative Umverteilungen entlang dreiNeuronengene wurden erhalten. Und die Anreicherung von Lesevorgängen an den fünf Hauptenden der Gene durch Neuron T-ChIP suchen über das ganze Gehirn T-ChIP suchen wurde beobachtet. Nach einer Stabilisierung ebnet diese Technik den Weg für Forscher im epigenetischen Bereich, um zelltypspezifische Histonmodifikation allgemein in Neuronen bei Mäusen zu erforschen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formaldehyd extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Gummibekleidung und Brille sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
