We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

Tier Arbeit an der USGS National Wildlife Health Center durchgeführt wurde, in Übereinstimmung mit der NIH Office of Laboratory Animal Welfare Richtlinien und unter institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschussprotokoll # EP080716 geführt. Gewebe von Jäger und geerntet Tiere waren Geschenke von der Wisconsin und Michigan Abteilungen für Naturressourcen. 1. Herstellung der Lösung HINWEIS: Die unten aufgeführten Lösungen sind für die Vorbereitung der CER-Assay-Substrat in Abschnitt 2 unten erforderlich. Planen jeder dieser Lösungen von höherer Konzentration Stammlösungen; empfohlene Konzentration für Stammlösungen werden in Klammern nach jeder jeweiligen chemischen Bezeichnung aufgeführt erhalten. Bereiten Sie alle Lösungen frisch auf Untergrundvorbereitung und bei 4 ° C bis zur Verwendung. <ol><li> Für Lysepuffer, bereiten eine Lösung der folgenden in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5, Stammlösung empfohlen): 100 mM sOdium Chlorid (NaCl, 1 M Stammlösung), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 Stammlösung), 0,5% NP-40 (10% Stammlösung), 0,5% Desoxycholat (DOC, 10% Stammlösung ). </li><li> Zur Umwandlung Puffer wird eine Lösung aus 0,05% Natriumdodecylsulfat (SDS, 10% ige Stammlösung) und 0,5% Triton X-100 (10% -ige Stammlösung) in 1 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10, pH 7,4 Stammlösung). </li><li> Für chaotropen Lösungen, bereiten zwei 3 M Lösungen von Guanidinhydrochlorid (GdnHCl, 8 M Lager) in 1x PBS (10x Stammlösung). Der pH-Wert einer der Lösungen auf 3,5 ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter Salzsäure (HCl). Prüfen, ob der pH-Wert der zweiten Lösung bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und stellen mit konzentrierter HCl oder Natriumhydroxid (NaOH), falls erforderlich. </li></ol> 2. Bereiten Sie CER Assay Substrat-Paare <ol><li> Erhalten gesunde, nicht-TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% Gewicht pro Volumen(W / v) Homogenat in Lysepuffer mit einer der folgenden Methoden: Dounce, Kugelmühle oder Mörser und Stößel Homogenisierung. Weiter verfeinern resultierenden Homogenate indem sie einer Spritze und Nadel-Homogenisierung mit Nadeln zunehmender Spur bis Substrat abgesaugt und mit Leichtigkeit durch eine 27G-Spritzennadel ausgestoßen werden. <ol><li> Für Substrate aus Nagetiere und andere kleine Säugetiere hergestellt homogenisieren gesamte Gehirn (s); für Substrate von größeren Säugetieren bereit, verwenden Obex (Hirnstamm) Gewebe-Homogenate vorzubereiten. Bei der Wahl der Menge von Hirnhomogenat vorzubereiten nicht mehr als 50% der Kapazität der Zentrifuge zur Eiweißfällung in Schritt 2.6 verwendet. </li><li> Wenn die Qualität der erworbenen Hirngewebe ist fraglich, bewerten PrP-C-Spiegel durch SDS-PAGE und Immunoblot 16 17 vor der Untergrundvorbereitung. </li></ol></li><li> Teilen Sie Hirnhomogenat in zwei gleiche Volumina in separaten gekennzeichnete Kunststoff konische Röhrchen. Fügen GdnHCl (3 M Lösung in 1 PBS) bei entweder pH 3,5 oder 7,4 zu jedem Röhrchen in einem 1: 1 Volumenverhältnis zu Hirnhomogenisat. </li><li> Überprüfen Sie die pH-Werte der beiden Lösungen. Den pH-Wert der pH 3,5 Substrat auf pH ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter HCl. Sicherstellen, dass der pH-Wert des anderen Substrats bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und der pH wird, falls notwendig, mit HCl oder NaOH nach Bedarf. Vermeiden Schwingen pH-Werte durch sorgfältige Zugabe von Säure oder Base. </li><li> Drehen Lösungen auf einem End-Over-End-Mixer bei Raumtemperatur (RT) für 5 Stunden. </li><li> Auszufällen Protein durch Zugabe vier Volumina Methanol zu den Substratlösungen in jeden konischen Rohr, Wirbel um gut zu mischen, und Inkubation bei -20 ° C für 16-18 Std. </li><li> Sedimentproben durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie die Überstände und lassen Methanol aus den Pellets verdampfen. Verwenden Sie Wattestäbchen, um bei der Aufnahme von Methanol zu der Innenseite des Rohres klammerte unterstützen. Lassen Sie keine Pellets zu über-dry und einmal Methanol nicht mehr sichtbar ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren. </li><li> Resuspendieren Proteinpellets in Konvertierungspuffer. Verwenden einer Menge des Umwandlungspuffers gleich der Menge Hirnhomogenat Ausgangsmaterial in Schritt 2.2 in jedem Röhrchen verteilt. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Umwandlung Puffer verwendet werden, um Protein-Pellets von beiden pH 3,5 und 7,4 behandelte Substrat Vorbereitungen resuspendieren wird die in Schritt 1.2 (die geringe Reinigungsmittel und einen physiologischen pH-Wert enthält) definiert Lösung. </li><li> Kurz beschallen Substratlösungen in einem cuphorn Ultraschallgerät (10 sec bei ~ 30% der maximalen Leistung), Aliquots in 0,5 bis 1,0 ml-Volumina in der Bezeichnung 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Qualitätskontrolle Immunoblot (Schritt 2.9) aus einem aliquoten Teil von jedem Substrat. Bewahren anderen Aliquots bei -80 ° C bis zum Gebrauch CER-Test (Abschnitt 4) durchzuführen. </li><li> Führen Sie die Qualitätskontrolle auf CER Substrat-Paare vor der Anwendung (Abbildung 2). Diese Schritte sicherzustellen, dass CER Substrate wird provide optimale Ergebnisse bei der Umwandlung Studien. <ol><li> Stellen Sie sicher, vergleichbare Mengen an PrP C in den beiden Substraten. Vergleichen PrP Ebenen in 10-25 ul jedes Substrat durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17. Wenn Protein-Spiegel in der pH 7,4 und 3,5 Substrate innerhalb von ~ 10% voneinander unterscheiden, sind die Substrat-Paare für die Verwendung in CER Studien geeignet. HINWEIS: Die PrP Immunoblots nicht Beweise für umfangreiche PrP C Abbau zeigen. Das PrP Immunreaktivität sollte vor allem&gt; 20 kDa ist. Bands geringer als dieser Molekülmasse können Abbauprodukte sein. Bandenmuster sollte etwa gleich zwischen Substrat-Paare sein. </li><li> Da die PrP C in beiden Substraten sollte PK empfindlich sein, behandeln 10-25 ul jedes Substrats mit PK in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und verdauen Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. Beurteilen verbleibende PrP Signals durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17.Substrate mit PrP res sind nicht für den Einsatz in CER Studien geeignet. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie TSE-Agent Seeds <ol><li> Erhalten TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% (w / v) Homogenat in 1x PBS, pH 7,4, unter Verwendung der in Schritt 2.1 oben genannten Methoden. HINWEIS: Saatgut kann auch aus anderen TSE-infizierten Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems hergestellt werden, aber die Effizienz der Umwandlung der aus dem Gehirn stamm Substraten durch Samen von TSE-infizierten peripheren Geweben abgeleitet wurde noch nicht experimentell in der Literatur untersucht. </li><li> Aliquoten resultierende Homogenat (n) in 100-300 ul-Volumina in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C, bis bereit, die CER-Test durchzuführen. </li></ol> 4. CER Assay HINWEIS: Die CER Test umfasst Zugabe einer relativ kleinen Menge von PrP TSE (in der &quot;Samen&quot; zur Verfügung gestellt) von einer Speziesin einen relativen Überschuss von PrP C von einer anderen Spezies, das teilweise an entweder pH 3,5 oder 7,4 denaturiert (in der nicht-infizierten Hirn &quot;Substrat&quot;, zur Verfügung gestellt). Nach einer längeren Schütteln Inkubationszeit wird vorlagengesteuerten Umwandlung von PrP C von PrP TSE in jeder Reaktion durch densitometrische Signal des PrP res übrigen nach PK-Verdau und Immunoblot-Nachweis untersucht. Vergleichen PrP res Ebenen der Substrate zuvor bei pH 3,5 vs. 7,4 denaturiert liefert ein Maß für die Artenbarriere. Eine experimentelle Übersicht dieses Testverfahrens ist in 1 bereitgestellt. <ol><li> Langsam tauen nicht infizierte CER Substrat-Paare (Assay erfordert gleiche Volumina Substrate zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert) und TSE-infizierte Saatgut-Lösungen, indem sie auf einem Bett aus Eis (ca. 1 Stunde auftauen Zeit). </li><li> Sobald sie vollständig aufgetaut, absaugen und dann vertreiben jedes Substratlösung durch eine27 G Injektionsnadel mehrmals neu zu homogenisieren. Kurz beschallen jeden TSE-infizierten Samen Lösung für 10 s bei ca. 30% der maximalen Leistung. Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis während der Vorbereitung Umwandlungsreaktionen. </li><li> Label 5 Einzel geringe Bindungs, dünnwandigen PCR-Röhrchen pro TSE-Erreger getestet. </li><li> Bereiten Umwandlungsreaktionen in diesen Rohren durch Zugabe von 5 ul 10% TSE-infizierten Samen Lösung in 95 &amp; mgr; l von (a) CER Substrat bei pH 7,4 und (b) CER Substrat bei pH 3,5 hergestellt. <ol><li> Für jede Versuchsprobe, bereiten Parallelreaktionen in CER Substrat-Paare zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert. </li><li> Optimieren Verhältnisse von TSE-Erregern Samen nicht infizierten Gehirnsubstrat durch empirische Bestimmung. Gemeinsame Samen: Substrat Verhältnissen eingesetzt pflegen eine Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul und beinhalten 1:99 ul, 2:98 und 5:95 ul ul. Für die meisten Anwendungen, die 5:95 ul Samen: angemessen ist Substrat-Volumen-Verhältnis und ist das, was in th vorgestelltist Protokoll. </li></ol></li><li> Bereiten Sie drei Kontrollproben pro TSE-Erreger wird wie folgt geprüft: (a) mit 5 ul 10% TSE-infizierte Saatgut Lösung auf 95 &amp; mgr; Konvertierungspuffer als Kontrolle für Eingabe PrP res; mit 5 ul Konvertierungspuffer 95 &amp; mgr; l Substrat in (b) pH 3,5 und (c) pH 7,4 als Kontrollen für nicht-spezifische, nicht-gestützten Umwandlung vorbereitet. </li><li> Vortexen Sie jede Probe in seiner geschlossenen PCR-Röhrchen, um Saatgut und Substrat gut mischen. Folgen Sie mit einem momentanen Impuls in einem Low-Speed-Tisch Mini-Zentrifuge, jede Volumen des Reaktionsgemisches in der PCR-Röhrchen Deckel gefangen zu entfernen. </li><li> Tragen Sie die Proben in individuell-markierten PCR-Röhrchen in einer Tischthermoschüttler ausgestattet, um PCR-Röhrchen zu akzeptieren. Schütteln Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 24 Stunden. </li><li> Nach Umschütteln Sarcosyl in einer Endkonzentration von 2% (w / v) und PK auf eine Endkonzentration von 100 ug / ml. Digest Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. NHINWEIS: Die Zugabe von Sarkosyl Proben nach der Konvertierung hilft bei der PK Verdauung von PrP C. Falsch positive Signale in ungeimpften Proben (Schritt 4.5) praktisch durch Zugabe von Sarkosyl eliminiert. </li><li> Hinzufügen SDS-PAGE-Probenpuffer, Wärme Proben auf 95 ° C für 5 Minuten und Lösung verbleibenden PrP res in jeder Probe durch SDS-PAGE 16 gefolgt von Immunoblotting 17. HINWEIS: Nach Zugabe von Probenpuffer und Heizung, Proben können sofort verarbeitet werden oder Proben können bei -20 ° C oder vor dem Immunoblotting gespeichert -80ºC. Alle hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Novex NuPAGE Gel und Transfersysteme erzeugt. Einzelne Proben aus dem CER-Test wurden mit Probenpuffer und Reduktionsmittel nach Herstellerangaben behandelt. Die Proben wurden anschließend bei 95 ° C für 5 min erhitzt und 30 ul jeder Probe wurde in eine 12% Bis-Tris Fertiggelen geladen. </li><li> Berechnen des Umwandlungswirkungsgrad (CER) als MaßArtenschranke. Maßnahme Ebenen PrP res densitometrisch 17 und unterteilen die Gesamtdichte des pH 7,4 Probe durch diejenige des pH 3,5 Probe. Mit 100 multipliziert, um einen Prozentsatz zu produzieren. </li><li> Kompilieren von Daten aus unabhängigen experimentellen Wiederholungen, um eine mittlere CER ± Standardabweichung für eine Spezies mit einer bestimmten TSE-Erreger zu generieren. </li></ol>

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	<li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).</li><li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+strains+and+species+barriers.">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li><li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques.">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li><li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication.">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li><li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein.">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li><li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE.">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li><li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences.">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).</li><li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+prion+diseases.">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32 (2008).</li><li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene.">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li><li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms:+a+model+for+the+scrapie+species+barrier.">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li><li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans,+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease.">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li><li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier.">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li><li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form.">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li><li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein.">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li><li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+(Ovis+canadensis)+to+transmissible+spongiform+encephalopathies.">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157 (2013).</li><li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material.">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li><li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP.">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li><li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus.">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li><li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen.">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li><li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+species+barrier+by+PrP(Sc)+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions.">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li><li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quaking-induced+conversion:+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection.">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li><li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils.">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).</li><li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats.">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li><li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region.">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).</li><li>Russell, W. M., Burch, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bei erfolgreichem Abschluss des Protokolls sollte die Aufmerksamkeit auf PrP-C-Spiegel bei nichtinfizierten zur Untergrundvorbereitung (Schritt 2.1.2) und der Samen-Verhältnis für Umwandlungsreaktionen (Schritt 4.4.2) Substrat verwendet Hirngewebe zu zahlen. Nach unserer Erfahrung können Gehirne für die Verwendung als CER-Substrat nach einem beträchtlichen Zeitraum post mortem entnommen werden, solange PrP C durch Immunoblotting (Abbildung 4) vorhanden ist. In der Tat wurden e...

Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE, Prionenerkrankungen) sind eine Gruppe von tödlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit verlängerten Inkubationszeiten, die eine Vielzahl von Tieren und Menschen zu beeinflussen. Die mutmaßliche ätiologische Agens von TSE besteht aus einer fehlgefalteten Isomer der Host Prionprotein (PrP), die in der Lage zur Selbstausbreitung von vorlagengesteuerten Umwandlung der normalen zellulären Form PrP (PrP C) in ein infektiöses, krankheitsassoziierte ist umfasste Formular (PrP TSE), die im zentralen Nervensystem Gewebe des infizierten Wirts 1 ansammelt. Infektiöse Prionen übertragen Säugetier Allgemeinen von Host-zu-Host in einem artenspezifisch, was zu dem Begriff der &quot;TSE Artengrenze&quot; Begrenzung Wirtsartwechsels Ereignisse 2 gegeben hat. Die biologischen Determinanten des Prion-Spezies-Barriere sind nicht gut verstanden. Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen der infektiösen PrP TSE und dem Host-PrP C cein stark beeinflussen, ob die Umwandlung erfolgt 3-5, bleibt aber nicht aus, um alle in vivo 6,7 beobachtet Prionenübertragung Ereignisse erklären. Somit hat die Charakterisierung von TSE Artschranken weitgehend von Tierexpositionsstudien herangezogen: Belichten naiven Tieren aus einer bestimmten Art von Prionen von einer anderen und durch Messen der resultierenden Inkubationszeit zu Beginn der Erkrankung und Erkrankungsrate als Indikator für die Übertragungseffizienz. Mäuse, die PrP C von heterologen Spezies werden auch für diese Art von Untersuchung 8 verwendet. Die Kosten im Zusammenhang mit transgenen Maus Produktion und langwierigen Prion Biotests sowie ethischen Überlegungen der Tiernutzung verbunden sind, sind Hindernisse für die experimentelle Untersuchung von TSE Artgrenzen. Bewertung der menschlichen Spezies-Barriere auf TSE vertraut auf Mäuse entwickelt, um menschliche PrP C auszudrücken. Diese Mäuse erfordern langen Inkubationszeiten, um die menschliche TSE oder Modifikationen an t erliegener menschlichen PrP-C-Molekül für eine schnelle Krankheitsbeginn 9. Inkubationszeiten für nicht-menschlichen TSE bei diesen Mäusen kann über die normale Maus Lebensdauer machen Interpretation der negativen Ergebnissen anspruchs erweitern. Nichtmenschliche Primaten sind auch als Stellvertreter für das Studium der menschlichen Spezies Barrieren verwendet worden, aber diese Studien behaftet mit den gleichen Herausforderungen wie andere Arten von Tierversuchen und nicht-menschlichen Primaten nicht genau rekapitulieren Krankheit, wie es in den menschlichen Wirt geht. Tier Biotests bleiben der &quot;Goldstandard&quot; Verfahren zur Messung der Anfälligkeit einer Spezies auf eine TSE, aber die Hürden, Kosten und Ethik dieser Live-Tierstudien Untersuchung Alternativen gezwungen. Eine Reihe von in vitro-Tests, basierend auf der Beurteilung der Umwandlung von Wirts PrP C zu einer Proteinase K (PK) beständigen Zustand (PrP res), wenn sie von PrP TSE ausgesät, wurden entwickelt und verwendet, um zu untersuchen TSE spECIES Barrieren 10-12. Beispiele für in-vitro-Tests sind zellfreie Umwandlung Assays PMCA (PMCA) und die Umwandlungseffizienz-Verhältnis (CER) Assay 10-14. Während keiner dieser Tests in Betracht periphere Faktoren Artgrenzen nach einer natürlichen Infektion beteiligt zu nehmen, kann sinnvoll sein, alle potenziell anfälligen Wirten für TSE zu identifizieren. Hier präsentieren wir das Protokoll für die CER-Test, bei dem zwei denaturiert PrP C Substrate von normalen Hirnhomogenaten abgeleitet sind in Tisch Prion Umwandlungsreaktionen verwendet (Abbildung 1) 13. PrP C in der bei pH 7,4 denaturiert Substrat kann nur an PrP res von PrP TSE umgewandelt werden ausgesät in die Umsetzung in Abwesenheit eines Speziesbarriere 14. Demgegenüber Denaturierung von PrP C in dem anderen Substrat bei pH 3,5 erlaubt es, an PrP res nach Inkubation umgewandelt werdenmit PrP TSE von irgendeiner Spezies und dient als Kontrolle für die Konvertierung. Das Verhältnis der Umwandlung von PrP C zu PrP res in pH 7,4 Substrats relativ gegenüber der pH 3,5 Substrat liefert ein Maß für die Artenbarriere. Wir haben festgestellt, dass die CER-Test prognostiziert bekannten Arten Barrieren der Labormäuse, verschiedene TSE und haben den Test bei den Bemühungen um die Artengrenze zahlreicher Säugetierarten, einschließlich Dickhornschafe, Chronic Wasting Disease (CWD) und anderen TSE 14 vorherzusagen, 15. Ermittler an einer Werkzeug ermöglicht ein schnelles Screening von TSE Artgrenzen oder Bewertung von PrP C to-PrP res Konvertierung wird diese Methode nützlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">ZROB05&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Other varieties of beads are also effective</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:296px;">Antibodies</td>
			<td style="width:205px;">various suppliers</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;">Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bead homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">BBY24M</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:157px;">369434</td>
			<td style="width:287px;">High speed with temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:205px;">Uline</td>
			<td style="width:157px;">S-18991</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Cuphorn sonicator</td>
			<td style="width:205px;">Heat Systems-Ultrasonics</td>
			<td style="width:157px;">W-380</td>
			<td style="width:287px;">Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">Densitometry software program</td>
			<td style="width:205px;">UVP</td>
			<td style="width:157px;">Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td>
			<td style="width:287px;">Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:157px;">885300</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">End-over-end mixer</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">H5600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetra acetic acid</td>
			<td style="width:205px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:157px;">P-770</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine hydrochloride, 8M</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">24115</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating block</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">11-718</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">435570</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: strong acid</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0008</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A454-4</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">C1301</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">L-5125</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:205px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">M158</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">SDS-PAGE gel system</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NuPAGE electrophoresis system</td>
			<td style="width:287px;">Other SDS-PAGE systems will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">PCR tubes (low-binding)</td>
			<td style="width:205px;">Axygen</td>
			<td style="width:157px;">PCR-02-L-C</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Pestle homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">03-392-106</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pH meter</td>
			<td style="width:205px;">Sentron</td>
			<td style="width:157px;">SI600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyvinyldifluoride membrane</td>
			<td style="width:205px;">Millipore</td>
			<td style="width:157px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">V3021</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:296px;">Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0009</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">D6750</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">28364</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">S5881</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemica; strong base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Syringe</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;">Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Syringe needles</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Thermoshaker (PCR tube shaker)</td>
			<td style="width:205px;">Hangzhou All Sheng Instruments</td>
			<td style="width:157px;">MS-100</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Tris base</td>
			<td style="width:205px;">Bio Basic&#160;</td>
			<td style="width:157px;">77-86-1</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:205px;">Integra Chemical Company</td>
			<td style="width:157px;">T756.30.30</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Vortexer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">12-812</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Der erfolgreiche Einsatz des CER Assay hängt weitgehend von der Qualität der in Umwandlungsreaktionen verwendeten Substrat-Paaren. Aus diesem Grund folgt vor, um CER Substratpaare vorbereiten, eine Qualitätskontrolle Immunoblot sollte (Abbildung 2) durchgeführt werden. Für beide Substrate Assay 10-25 ul durch Immunoblotting. PrP C sollte in jedem Substrat leicht nachweisbar sein und PrP C Ebenen müssen etwa gleich zwischen den beiden. Immunreaktivität wird vor allem sichtbar...

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Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Prion Protein-Umwandlungsassay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K Aufrufe.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.