We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

Tier Arbeit an der USGS National Wildlife Health Center durchgeführt wurde, in Übereinstimmung mit der NIH Office of Laboratory Animal Welfare Richtlinien und unter institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschussprotokoll # EP080716 geführt. Gewebe von Jäger und geerntet Tiere waren Geschenke von der Wisconsin und Michigan Abteilungen für Naturressourcen. 1. Herstellung der Lösung HINWEIS: Die unten aufgeführten Lösungen sind für die Vorbereitung der CER-Assay-Substrat in Abschnitt 2 unten erforderlich. Planen jeder dieser Lösungen von höherer Konzentration Stammlösungen; empfohlene Konzentration für Stammlösungen werden in Klammern nach jeder jeweiligen chemischen Bezeichnung aufgeführt erhalten. Bereiten Sie alle Lösungen frisch auf Untergrundvorbereitung und bei 4 ° C bis zur Verwendung. <ol><li> Für Lysepuffer, bereiten eine Lösung der folgenden in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5, Stammlösung empfohlen): 100 mM sOdium Chlorid (NaCl, 1 M Stammlösung), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 Stammlösung), 0,5% NP-40 (10% Stammlösung), 0,5% Desoxycholat (DOC, 10% Stammlösung ). </li><li> Zur Umwandlung Puffer wird eine Lösung aus 0,05% Natriumdodecylsulfat (SDS, 10% ige Stammlösung) und 0,5% Triton X-100 (10% -ige Stammlösung) in 1 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10, pH 7,4 Stammlösung). </li><li> Für chaotropen Lösungen, bereiten zwei 3 M Lösungen von Guanidinhydrochlorid (GdnHCl, 8 M Lager) in 1x PBS (10x Stammlösung). Der pH-Wert einer der Lösungen auf 3,5 ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter Salzsäure (HCl). Prüfen, ob der pH-Wert der zweiten Lösung bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und stellen mit konzentrierter HCl oder Natriumhydroxid (NaOH), falls erforderlich. </li></ol> 2. Bereiten Sie CER Assay Substrat-Paare <ol><li> Erhalten gesunde, nicht-TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% Gewicht pro Volumen(W / v) Homogenat in Lysepuffer mit einer der folgenden Methoden: Dounce, Kugelmühle oder Mörser und Stößel Homogenisierung. Weiter verfeinern resultierenden Homogenate indem sie einer Spritze und Nadel-Homogenisierung mit Nadeln zunehmender Spur bis Substrat abgesaugt und mit Leichtigkeit durch eine 27G-Spritzennadel ausgestoßen werden. <ol><li> Für Substrate aus Nagetiere und andere kleine Säugetiere hergestellt homogenisieren gesamte Gehirn (s); für Substrate von größeren Säugetieren bereit, verwenden Obex (Hirnstamm) Gewebe-Homogenate vorzubereiten. Bei der Wahl der Menge von Hirnhomogenat vorzubereiten nicht mehr als 50% der Kapazität der Zentrifuge zur Eiweißfällung in Schritt 2.6 verwendet. </li><li> Wenn die Qualität der erworbenen Hirngewebe ist fraglich, bewerten PrP-C-Spiegel durch SDS-PAGE und Immunoblot 16 17 vor der Untergrundvorbereitung. </li></ol></li><li> Teilen Sie Hirnhomogenat in zwei gleiche Volumina in separaten gekennzeichnete Kunststoff konische Röhrchen. Fügen GdnHCl (3 M Lösung in 1 PBS) bei entweder pH 3,5 oder 7,4 zu jedem Röhrchen in einem 1: 1 Volumenverhältnis zu Hirnhomogenisat. </li><li> Überprüfen Sie die pH-Werte der beiden Lösungen. Den pH-Wert der pH 3,5 Substrat auf pH ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter HCl. Sicherstellen, dass der pH-Wert des anderen Substrats bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und der pH wird, falls notwendig, mit HCl oder NaOH nach Bedarf. Vermeiden Schwingen pH-Werte durch sorgfältige Zugabe von Säure oder Base. </li><li> Drehen Lösungen auf einem End-Over-End-Mixer bei Raumtemperatur (RT) für 5 Stunden. </li><li> Auszufällen Protein durch Zugabe vier Volumina Methanol zu den Substratlösungen in jeden konischen Rohr, Wirbel um gut zu mischen, und Inkubation bei -20 ° C für 16-18 Std. </li><li> Sedimentproben durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie die Überstände und lassen Methanol aus den Pellets verdampfen. Verwenden Sie Wattestäbchen, um bei der Aufnahme von Methanol zu der Innenseite des Rohres klammerte unterstützen. Lassen Sie keine Pellets zu über-dry und einmal Methanol nicht mehr sichtbar ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren. </li><li> Resuspendieren Proteinpellets in Konvertierungspuffer. Verwenden einer Menge des Umwandlungspuffers gleich der Menge Hirnhomogenat Ausgangsmaterial in Schritt 2.2 in jedem Röhrchen verteilt. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Umwandlung Puffer verwendet werden, um Protein-Pellets von beiden pH 3,5 und 7,4 behandelte Substrat Vorbereitungen resuspendieren wird die in Schritt 1.2 (die geringe Reinigungsmittel und einen physiologischen pH-Wert enthält) definiert Lösung. </li><li> Kurz beschallen Substratlösungen in einem cuphorn Ultraschallgerät (10 sec bei ~ 30% der maximalen Leistung), Aliquots in 0,5 bis 1,0 ml-Volumina in der Bezeichnung 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Qualitätskontrolle Immunoblot (Schritt 2.9) aus einem aliquoten Teil von jedem Substrat. Bewahren anderen Aliquots bei -80 ° C bis zum Gebrauch CER-Test (Abschnitt 4) durchzuführen. </li><li> Führen Sie die Qualitätskontrolle auf CER Substrat-Paare vor der Anwendung (Abbildung 2). Diese Schritte sicherzustellen, dass CER Substrate wird provide optimale Ergebnisse bei der Umwandlung Studien. <ol><li> Stellen Sie sicher, vergleichbare Mengen an PrP C in den beiden Substraten. Vergleichen PrP Ebenen in 10-25 ul jedes Substrat durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17. Wenn Protein-Spiegel in der pH 7,4 und 3,5 Substrate innerhalb von ~ 10% voneinander unterscheiden, sind die Substrat-Paare für die Verwendung in CER Studien geeignet. HINWEIS: Die PrP Immunoblots nicht Beweise für umfangreiche PrP C Abbau zeigen. Das PrP Immunreaktivität sollte vor allem&gt; 20 kDa ist. Bands geringer als dieser Molekülmasse können Abbauprodukte sein. Bandenmuster sollte etwa gleich zwischen Substrat-Paare sein. </li><li> Da die PrP C in beiden Substraten sollte PK empfindlich sein, behandeln 10-25 ul jedes Substrats mit PK in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und verdauen Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. Beurteilen verbleibende PrP Signals durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17.Substrate mit PrP res sind nicht für den Einsatz in CER Studien geeignet. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie TSE-Agent Seeds <ol><li> Erhalten TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% (w / v) Homogenat in 1x PBS, pH 7,4, unter Verwendung der in Schritt 2.1 oben genannten Methoden. HINWEIS: Saatgut kann auch aus anderen TSE-infizierten Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems hergestellt werden, aber die Effizienz der Umwandlung der aus dem Gehirn stamm Substraten durch Samen von TSE-infizierten peripheren Geweben abgeleitet wurde noch nicht experimentell in der Literatur untersucht. </li><li> Aliquoten resultierende Homogenat (n) in 100-300 ul-Volumina in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C, bis bereit, die CER-Test durchzuführen. </li></ol> 4. CER Assay HINWEIS: Die CER Test umfasst Zugabe einer relativ kleinen Menge von PrP TSE (in der &quot;Samen&quot; zur Verfügung gestellt) von einer Speziesin einen relativen Überschuss von PrP C von einer anderen Spezies, das teilweise an entweder pH 3,5 oder 7,4 denaturiert (in der nicht-infizierten Hirn &quot;Substrat&quot;, zur Verfügung gestellt). Nach einer längeren Schütteln Inkubationszeit wird vorlagengesteuerten Umwandlung von PrP C von PrP TSE in jeder Reaktion durch densitometrische Signal des PrP res übrigen nach PK-Verdau und Immunoblot-Nachweis untersucht. Vergleichen PrP res Ebenen der Substrate zuvor bei pH 3,5 vs. 7,4 denaturiert liefert ein Maß für die Artenbarriere. Eine experimentelle Übersicht dieses Testverfahrens ist in 1 bereitgestellt. <ol><li> Langsam tauen nicht infizierte CER Substrat-Paare (Assay erfordert gleiche Volumina Substrate zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert) und TSE-infizierte Saatgut-Lösungen, indem sie auf einem Bett aus Eis (ca. 1 Stunde auftauen Zeit). </li><li> Sobald sie vollständig aufgetaut, absaugen und dann vertreiben jedes Substratlösung durch eine27 G Injektionsnadel mehrmals neu zu homogenisieren. Kurz beschallen jeden TSE-infizierten Samen Lösung für 10 s bei ca. 30% der maximalen Leistung. Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis während der Vorbereitung Umwandlungsreaktionen. </li><li> Label 5 Einzel geringe Bindungs, dünnwandigen PCR-Röhrchen pro TSE-Erreger getestet. </li><li> Bereiten Umwandlungsreaktionen in diesen Rohren durch Zugabe von 5 ul 10% TSE-infizierten Samen Lösung in 95 &amp; mgr; l von (a) CER Substrat bei pH 7,4 und (b) CER Substrat bei pH 3,5 hergestellt. <ol><li> Für jede Versuchsprobe, bereiten Parallelreaktionen in CER Substrat-Paare zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert. </li><li> Optimieren Verhältnisse von TSE-Erregern Samen nicht infizierten Gehirnsubstrat durch empirische Bestimmung. Gemeinsame Samen: Substrat Verhältnissen eingesetzt pflegen eine Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul und beinhalten 1:99 ul, 2:98 und 5:95 ul ul. Für die meisten Anwendungen, die 5:95 ul Samen: angemessen ist Substrat-Volumen-Verhältnis und ist das, was in th vorgestelltist Protokoll. </li></ol></li><li> Bereiten Sie drei Kontrollproben pro TSE-Erreger wird wie folgt geprüft: (a) mit 5 ul 10% TSE-infizierte Saatgut Lösung auf 95 &amp; mgr; Konvertierungspuffer als Kontrolle für Eingabe PrP res; mit 5 ul Konvertierungspuffer 95 &amp; mgr; l Substrat in (b) pH 3,5 und (c) pH 7,4 als Kontrollen für nicht-spezifische, nicht-gestützten Umwandlung vorbereitet. </li><li> Vortexen Sie jede Probe in seiner geschlossenen PCR-Röhrchen, um Saatgut und Substrat gut mischen. Folgen Sie mit einem momentanen Impuls in einem Low-Speed-Tisch Mini-Zentrifuge, jede Volumen des Reaktionsgemisches in der PCR-Röhrchen Deckel gefangen zu entfernen. </li><li> Tragen Sie die Proben in individuell-markierten PCR-Röhrchen in einer Tischthermoschüttler ausgestattet, um PCR-Röhrchen zu akzeptieren. Schütteln Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 24 Stunden. </li><li> Nach Umschütteln Sarcosyl in einer Endkonzentration von 2% (w / v) und PK auf eine Endkonzentration von 100 ug / ml. Digest Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. NHINWEIS: Die Zugabe von Sarkosyl Proben nach der Konvertierung hilft bei der PK Verdauung von PrP C. Falsch positive Signale in ungeimpften Proben (Schritt 4.5) praktisch durch Zugabe von Sarkosyl eliminiert. </li><li> Hinzufügen SDS-PAGE-Probenpuffer, Wärme Proben auf 95 ° C für 5 Minuten und Lösung verbleibenden PrP res in jeder Probe durch SDS-PAGE 16 gefolgt von Immunoblotting 17. HINWEIS: Nach Zugabe von Probenpuffer und Heizung, Proben können sofort verarbeitet werden oder Proben können bei -20 ° C oder vor dem Immunoblotting gespeichert -80ºC. Alle hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Novex NuPAGE Gel und Transfersysteme erzeugt. Einzelne Proben aus dem CER-Test wurden mit Probenpuffer und Reduktionsmittel nach Herstellerangaben behandelt. Die Proben wurden anschließend bei 95 ° C für 5 min erhitzt und 30 ul jeder Probe wurde in eine 12% Bis-Tris Fertiggelen geladen. </li><li> Berechnen des Umwandlungswirkungsgrad (CER) als MaßArtenschranke. Maßnahme Ebenen PrP res densitometrisch 17 und unterteilen die Gesamtdichte des pH 7,4 Probe durch diejenige des pH 3,5 Probe. Mit 100 multipliziert, um einen Prozentsatz zu produzieren. </li><li> Kompilieren von Daten aus unabhängigen experimentellen Wiederholungen, um eine mittlere CER ± Standardabweichung für eine Spezies mit einer bestimmten TSE-Erreger zu generieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).</li><li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+strains+and+species+barriers.">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li><li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques.">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li><li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication.">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li><li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein.">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li><li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE.">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li><li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences.">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).</li><li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+prion+diseases.">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32 (2008).</li><li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene.">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li><li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms:+a+model+for+the+scrapie+species+barrier.">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li><li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans,+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease.">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li><li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier.">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li><li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form.">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li><li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein.">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li><li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+(Ovis+canadensis)+to+transmissible+spongiform+encephalopathies.">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157 (2013).</li><li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material.">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li><li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP.">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li><li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus.">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li><li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen.">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li><li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+species+barrier+by+PrP(Sc)+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions.">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li><li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quaking-induced+conversion:+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection.">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li><li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils.">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).</li><li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats.">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li><li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region.">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).</li><li>Russell, W. M., Burch, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bei erfolgreichem Abschluss des Protokolls sollte die Aufmerksamkeit auf PrP-C-Spiegel bei nichtinfizierten zur Untergrundvorbereitung (Schritt 2.1.2) und der Samen-Verhältnis für Umwandlungsreaktionen (Schritt 4.4.2) Substrat verwendet Hirngewebe zu zahlen. Nach unserer Erfahrung können Gehirne für die Verwendung als CER-Substrat nach einem beträchtlichen Zeitraum post mortem entnommen werden, solange PrP C durch Immunoblotting (Abbildung 4) vorhanden ist. In der Tat wurden e...

Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE, Prionenerkrankungen) sind eine Gruppe von tödlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit verlängerten Inkubationszeiten, die eine Vielzahl von Tieren und Menschen zu beeinflussen. Die mutmaßliche ätiologische Agens von TSE besteht aus einer fehlgefalteten Isomer der Host Prionprotein (PrP), die in der Lage zur Selbstausbreitung von vorlagengesteuerten Umwandlung der normalen zellulären Form PrP (PrP C) in ein infektiöses, krankheitsassoziierte ist umfasste Formular (PrP TSE), die im zentralen Nervensystem Gewebe des infizierten Wirts 1 ansammelt. Infektiöse Prionen übertragen Säugetier Allgemeinen von Host-zu-Host in einem artenspezifisch, was zu dem Begriff der &quot;TSE Artengrenze&quot; Begrenzung Wirtsartwechsels Ereignisse 2 gegeben hat. Die biologischen Determinanten des Prion-Spezies-Barriere sind nicht gut verstanden. Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen der infektiösen PrP TSE und dem Host-PrP C cein stark beeinflussen, ob die Umwandlung erfolgt 3-5, bleibt aber nicht aus, um alle in vivo 6,7 beobachtet Prionenübertragung Ereignisse erklären. Somit hat die Charakterisierung von TSE Artschranken weitgehend von Tierexpositionsstudien herangezogen: Belichten naiven Tieren aus einer bestimmten Art von Prionen von einer anderen und durch Messen der resultierenden Inkubationszeit zu Beginn der Erkrankung und Erkrankungsrate als Indikator für die Übertragungseffizienz. Mäuse, die PrP C von heterologen Spezies werden auch für diese Art von Untersuchung 8 verwendet. Die Kosten im Zusammenhang mit transgenen Maus Produktion und langwierigen Prion Biotests sowie ethischen Überlegungen der Tiernutzung verbunden sind, sind Hindernisse für die experimentelle Untersuchung von TSE Artgrenzen. Bewertung der menschlichen Spezies-Barriere auf TSE vertraut auf Mäuse entwickelt, um menschliche PrP C auszudrücken. Diese Mäuse erfordern langen Inkubationszeiten, um die menschliche TSE oder Modifikationen an t erliegener menschlichen PrP-C-Molekül für eine schnelle Krankheitsbeginn 9. Inkubationszeiten für nicht-menschlichen TSE bei diesen Mäusen kann über die normale Maus Lebensdauer machen Interpretation der negativen Ergebnissen anspruchs erweitern. Nichtmenschliche Primaten sind auch als Stellvertreter für das Studium der menschlichen Spezies Barrieren verwendet worden, aber diese Studien behaftet mit den gleichen Herausforderungen wie andere Arten von Tierversuchen und nicht-menschlichen Primaten nicht genau rekapitulieren Krankheit, wie es in den menschlichen Wirt geht. Tier Biotests bleiben der &quot;Goldstandard&quot; Verfahren zur Messung der Anfälligkeit einer Spezies auf eine TSE, aber die Hürden, Kosten und Ethik dieser Live-Tierstudien Untersuchung Alternativen gezwungen. Eine Reihe von in vitro-Tests, basierend auf der Beurteilung der Umwandlung von Wirts PrP C zu einer Proteinase K (PK) beständigen Zustand (PrP res), wenn sie von PrP TSE ausgesät, wurden entwickelt und verwendet, um zu untersuchen TSE spECIES Barrieren 10-12. Beispiele für in-vitro-Tests sind zellfreie Umwandlung Assays PMCA (PMCA) und die Umwandlungseffizienz-Verhältnis (CER) Assay 10-14. Während keiner dieser Tests in Betracht periphere Faktoren Artgrenzen nach einer natürlichen Infektion beteiligt zu nehmen, kann sinnvoll sein, alle potenziell anfälligen Wirten für TSE zu identifizieren. Hier präsentieren wir das Protokoll für die CER-Test, bei dem zwei denaturiert PrP C Substrate von normalen Hirnhomogenaten abgeleitet sind in Tisch Prion Umwandlungsreaktionen verwendet (Abbildung 1) 13. PrP C in der bei pH 7,4 denaturiert Substrat kann nur an PrP res von PrP TSE umgewandelt werden ausgesät in die Umsetzung in Abwesenheit eines Speziesbarriere 14. Demgegenüber Denaturierung von PrP C in dem anderen Substrat bei pH 3,5 erlaubt es, an PrP res nach Inkubation umgewandelt werdenmit PrP TSE von irgendeiner Spezies und dient als Kontrolle für die Konvertierung. Das Verhältnis der Umwandlung von PrP C zu PrP res in pH 7,4 Substrats relativ gegenüber der pH 3,5 Substrat liefert ein Maß für die Artenbarriere. Wir haben festgestellt, dass die CER-Test prognostiziert bekannten Arten Barrieren der Labormäuse, verschiedene TSE und haben den Test bei den Bemühungen um die Artengrenze zahlreicher Säugetierarten, einschließlich Dickhornschafe, Chronic Wasting Disease (CWD) und anderen TSE 14 vorherzusagen, 15. Ermittler an einer Werkzeug ermöglicht ein schnelles Screening von TSE Artgrenzen oder Bewertung von PrP C to-PrP res Konvertierung wird diese Methode nützlich.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm Zirconium oxide beads</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>Other varieties of beads are also effective</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td>various suppliers</td><td></td><td>Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrP&lt;sup&gt;res&lt;/sup&gt; from species of interest</td></tr><tr><td>Bead homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>High speed with temperature control</td></tr><tr><td>Conical tubes</td><td>any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicator</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn sonicator</td><td>Heat Systems-Ultrasonics</td><td>W-380</td><td>Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometry software program</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td><td>Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>End-over-end mixer</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetra acetic acid</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Hazardous chemical: eye irritation</td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td></tr><tr><td>Heating block</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Hazardous chemical: strong acid</td></tr><tr><td>Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Hazardous chemical: skin &amp;amp; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L-5125</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel system</td><td>Life Technologies</td><td>NuPAGE electrophoresis system</td><td>Other SDS-PAGE systems will also work</td></tr><tr><td>PCR tubes (low-binding)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Pestle homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyldifluoride membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Hazardous chemical: skin &amp;amp; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td></tr><tr><td>Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D6750</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Hazardous chemical; strong base</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>various</td><td>Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td></tr><tr><td>Syringe needles</td><td>BD Biosciences</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (PCR tube shaker)</td><td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Der erfolgreiche Einsatz des CER Assay hängt weitgehend von der Qualität der in Umwandlungsreaktionen verwendeten Substrat-Paaren. Aus diesem Grund folgt vor, um CER Substratpaare vorbereiten, eine Qualitätskontrolle Immunoblot sollte (Abbildung 2) durchgeführt werden. Für beide Substrate Assay 10-25 ul durch Immunoblotting. PrP C sollte in jedem Substrat leicht nachweisbar sein und PrP C Ebenen müssen etwa gleich zwischen den beiden. Immunreaktivität wird vor allem sichtbar...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay at JoVE.com

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Prion Protein-Umwandlungsassay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K Aufrufe.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Serie: Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Medizin

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Prion Safety Laboratory Wischtest

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Nachweis von abnormalem Prionprotein durch Immunhistochemie

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Neurowissenschaften

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Biologie

Detecting Abnormal Prion Proteins in Brain Tissue Using Immunohistochemistry

Source: Orge, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64560">Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates a technique to detect misfolded prion protein in brain sections using immunohistochemistry. Upon treating the brain section with formic acid to denature prions and minimize infection risk, as well as unmasking the prion aggregates using heat-induced epitope retrieval, the sections are immunolabeled for the misfolded prion protein aggregates and observed under a microscope.

Nachweis abnormaler Prionenproteine im Hirngewebe mittels Immunhistochemie

1. Tissue sectioning and slide preparation

	Cut sections of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues at 3-5 &#181;m thickness using a microtome.
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

Take tissue homogenate from a mammalian brain that contains both normal prion proteins and misfolded prion aggregates responsible for neurodegenerative diseases.
Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.
Treat the aggregates with a denaturing buffer at a high temperature to linearize the proteins and impart a uniform negative charge.
Load the sample onto an electrophoresis gel and separate the proteins into bands, which confirms the presence of aggregates.
Using an electric field, transfer the separated proteins onto a membrane.
Incubate the membrane in a blocking solution to mask non-specific binding sites.
Incubate with peroxidase enzyme-tagged antibodies, which bind specifically to the prion aggregates.
Wash the membrane to remove unbound antibodies, minimizing non-specific signals.
Add a chemiluminescent substrate and an oxidizing agent, enabling the peroxidase to oxidize the substrate and produce light.
Measure the light intensity to quantify misfolded prions in the homogenate.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video