We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

עבודה בבעלי חיים שנערכו במרכז בטבע הלאומי USGS הבריאות בוצעה בהתאם להנחיות משרד NIH של בעלי החיים במעבדת רווחה ותחת טיפול בבעלי חיים מוסדי ו# פרוטוקול EP080716 ועדת שימוש. רקמות מבעלי החיים שנקטפו-צייד היו מתנות ומיסקונסין או מישיגן מחלקות משאבי טבע. 1. פתרון הכנה הערה: הפתרונות המפורטים להלן נדרשות להכנת מצע assay CER בסעיף 2 להלן. הכן כל אחד מפתרונות אלה מפתרונות מניות ריכוז גבוהים יותר; ריכוזים מומלצים עבור פתרונות מניות יינתנו בסוגריים אחרי כל שם כימי המתאים מופיע ברשימה. הכן את כל הפתרונות הטריים על הכנת מצע ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למאגר תמוגה, להכין פתרון מאלה ב 10 מ&quot;מ טריס, pH 7.5 (1 M טריס, פתרון 7.5 pH המניה מומלץ): 100 מ&quot;מ שלכלוריד גנות (NaCl, פתרון מניות 1 M), חומצת ethylenediaminetetraacetic 10 מ&quot;מ (EDTA, 500 mM EDTA, pH פתרון מניות 8.0), 0.5% NP-40 (פתרון מניות 10%), deoxycholate 0.5% (DOC, פתרון מניות 10% ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ המרה, להכין פתרון של סולפט 0.05% dodecyl נתרן (SDS, 10% מניות פתרון) ו 0.5% Triton X-100 (פתרון 10% מניות) בתמיסת מלח 1 פוספט (PBS, 10, pH פתרון מניות 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרונות chaotropic, להכין שני 3 M פתרונות של hydrochloride guanidine (GdnHCl, 8 M מלאי) ב1x PBS (פתרון המניות 10x). התאם את ה- pH של אחד מהפתרונות ל -3.5 ± 0.05 באמצעות חומצה מרוכזת הידרוכלורית (HCl). בדוק שpH של התמיסה השנייה נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים באמצעות הידרוקסיד מרוכז HCl או נתרן (NaOH) במידת צורך. </li></ol> 2. הכן זוגות CER Assay מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמה בריאה, שאינו נגועה TSE-מוח ממינים של ריבית ולהכין 10% נפח משקל לכל(W / v) homogenate במאגר תמוגה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: dounce, חרוז-טחנה, או הומוגניזציה מכתש ועלי. לחדד עוד וכתוצאה מכך homogenates על ידי חשיפתם להומוגניזציה מזרק ומחט, באמצעות מחטים של מד הגדלת עד מצע יכול להישאף וגורש בקלות באמצעות מחט מזרק G 27. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצעים שהוכנו ממכרסמים ויונקים קטנים אחרים, homogenize מוח כולו (ים); למצעים שהוכנו מיונקים גדולים יותר, להשתמש OBEX רקמה (גזע המוח) להכין homogenates. בעת בחירת כמות homogenate המוח, להכין לא יותר מ -50% מהקיבולת של צנטריפוגות משמשת למשקעי חלבון בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האיכות של רקמת המוח רכשה מוטלת בספק, להעריך את רמות PRP C על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblot 17 הכנה מוקדמת למצע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלק homogenate המוח לשני כרכים שווים בצינורות חרוטי נפרדים שכותרתו פלסטיק. להוסיף GdnHCl (3 M פתרונות ב1 PBS) בשני pH 3.5 או 7.4 לכל צינור ביחס של 1: 1 נפח לhomogenate המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ערכי ה- pH של שני פתרונות. התאם את ה- pH של pH 3.5 המצע לpH ± 0.05 באמצעות HCl המרוכז. להבטיח את ה- pH של המצע האחר נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים את ה- pH במידת צורך עם HCl או NaOH במידת הצורך. הימנע מהחטאת ערכי pH על ידי תוספת מושכלת של חומצה או בסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב פתרונות במיקסר הסוף-over-הסוף בטמפרטורת חדר (RT) במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז חלבון על ידי הוספת ארבעה כרכים של מתנול לפתרונות מצע בכל צינור חרוטי, מערבולת לערבב היטב, דגירה ב -20 ° C ל16-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות משקעים על ידי צנטריפוגה ב× גרם 13,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג בזהירות וזורקי supernatants ולאפשר מתנול להתאדות מהכדורים. השתמש בהחלה מכותנה שקצה כדי לסייע בקליטת מתנול נצמד לחלק הפנימי של הצינור. אל תאפשר כדורים ליותר מ-dry ופעם מתנול הוא כבר לא נראה לעין, להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי חלבון Resuspend במאגר המרה. השתמש בכמות של חיץ ההמרה שווה לכמות חומר התחלת homogenate המוח לוותר לתוך צינור אחד בשלב 2.2. הערה: זה קריטי, כי המאגר משמש להמרת resuspend כדורי חלבון משני pH 3.5 והכנות מצע שטופלו 7.4 הוא הפתרון המוגדר בשלב 1.2 לעיל (המכיל רמות נמוכות של חומרי ניקוי וpH פיסיולוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות בקצרה sonicate מצע בsonicator cuphorn (10 שניות ב ~ 30% כוח מרבי), aliquot לתוך 0.5-1.0 מיליליטר כרכים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge שכותרת. בצע immunoblot בקרת איכות (שלב 2.9) על aliquot של כל מצע. אחסן aliquots האחר ב -80 ° C עד מוכן לבצע assay CER (סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בקרת איכות על זוגות מצע CER לפני השימוש (איור 2). צעדים אלה להבטיח כי מצעי CER יהיו providתוצאות אופטימליות דואר בלימודי גיור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח כמויות דומות של PRP C בשני מצעים. להשוות רמות PRP ב10-25 μl של כל מצע על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17. אם רמות החלבון בpH 7.4 ו -3.5 מצעים נמצאים ב~ 10% של כל אחד אחר, זוגות המצע מתאימים לשימוש במחקרי CER. הערה: immunoblots PRP לא צריך להראות ראיות של השפלה PRP C הנרחבת. Immunoreactivity PRP צריך להיות בעיקר&gt; 20 kDa. להקות פחות ממסה מולקולרית זה יכול להיות מוצרים פגומים. דפוסי פסים צריכים להיות שווי ערך פחות או יותר בין זוגות מצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כC PRP בשני מצעים צריך להיות PK רגיש, טיפול 10-25 μl של כל מצע עם PK בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ולעכל דגימות ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. להעריך כל אות PRP שנותר על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17.מצעים עם מיל PRP אינם מתאימים לשימוש במחקרי CER. </li></ol></li></ol> 3. להכין זרעי TSE סוכן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג רקמת מוח נגוע TSE ממינים של ריבית ולהכין 10% (w / v) homogenate ב1x PBS pH 7.4 באמצעות השיטות מפורטות בשלב 2.1 לעיל. הערה: זרעים גם יכולים להיות מיוצרים מרקמות נגועים TSE אחרות מחוץ למערכת העצבים המרכזית, לעומת זאת, יעילות ההמרה של מצעי המוח מפיק זרעים נגזרים מרקמות היקפי נגועים TSE טרם הוערכה באופן ניסיוני בספרות שפורסמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot וכתוצאה מכך homogenate (ים) לתוך 100-300 כרכי μl בצינורות 0.5 מיליליטר microcentrifuge וחנות ב -80 ° C עד מוכן לבצע את assay CER. </li></ol> Assay 4. CER הערה: assay CER כרוך תוספת של כמות קטנה יחסית של PRP TSE (הניתנת ב&quot; הזרע &quot;) ממין אחדלעודף יחסי של PRP C (הניתן במוח נגוע &quot;המצע&quot;) ממין אחר שכבר מפוגל באופן חלקי בשני pH 3.5 או 7.4. בעקבות תקופת דגירה ממושכת רועדת, המרה מונעת תבנית של PRP C על ידי PRP TSE בכל תגובה מוערכת על ידי אות densitometric של PRP מיל שנותר לאחר עיכול PK וזיהוי immunoblot. השוואת רמות מיל PRP במצעים המפוגלים בעבר ב- pH 3.5 לעומת 7.4 מספקת מדד של מחסום המינים. סקירה ניסיונית של הליך assay זה מסופקת באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להפשיר זוגות מצע CER נגוע (assay דורש כמויות שווה של מצעים המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4) ופתרונות זרע TSE נגועים על ידי הצבת אותם על גבי מצע של קרח (כ זמן הפשרה 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהפשיר באופן מלא, ולאחר מכן לשאוב לגרש כל פתרון מצע דרך27 כמה פעמים מחט מזרק G מחדש homogenize זה. בקצרה sonicate כל פתרון זרע נגוע TSE במשך 10 שניות ב ~ 30% כוח מקסימאלי. שמור את כל הפתרונות על קרח בעת הכנת תגובות המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית 5 צינורות בודדים נמוכים מחייב, דק דופן PCR לסוכן TSE נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תגובות גיור בצינורות אלה על ידי הוספת 5 μl של 10% פתרון זרע TSE נגוע עד 95 μl של (א) מצע CER מוכן בpH 7.4 ו- (ב) מצע CER מוכן ב- pH 3.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת ניסוי, להכין תגובות מקבילות בזוגות מצע CER המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל יחסים של זרע סוכן TSE למצע מוח נגוע באמצעות קביעה אמפירית. Common זרעים: יחסי מצע המועסקים לשמור על סך נפח תגובה של 100 μl וכוללים 1:99 μl, 2:98 μl ו5:95 μl. עבור מרבית היישומים, זרע 5:95 μl: יחס מצע הנפח מתאים והוא מה שמוצג בההוא פרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלוש דגימות בקרה לסוכן TSE נבדקות באופן הבא: (א) להוסיף 5 μl של 10% פתרון זרע TSE הנגוע לחיץ המרה 95 μl כביקורת למיל PRP קלט; להוסיף למאגר המרה 5 μl 95 מצע μl מוכן בpH (ב) 3.5 pH ו( ג) 7.4 כפקדים לגיור שאינו ספציפי, שאינה בתבניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת מדגם זה בצינור PCR הסגור שלה כדי לערבב זרע ומצע היטב. פעל עם דופק רגעי במיני-צנטריפוגה גבי ספסל במהירות נמוכה כדי להסיר כל נפח של תערובת התגובה לכודה במכסה צינור PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען בצינורות PCR בנפרד כותרת לתרם-אכר העליון ספסל מצויד לקבל צינורות PCR. Shake דגימות ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טלטול, להוסיף sarkosyl לריכוז סופי של 2% (w / v) וPK לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגימות Digest ב 1000 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. NOTE: תוספת של sarkosyl לדגימות עזרים שלאחר המרה בעיכול PK של PRP C. אותות חיוביים כוזבים בדגימות unseeded (שלב 4.5) בוטלו כמעט על ידי תוספת של sarkosyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מדגם SDS-PAGE, דגימות חום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולפתור מיל PRP שנותר בכל דגימה על ידי SDS-PAGE 16 ואחרי 17 immunoblotting. הערה: לאחר תוספת של חיץ מדגם וחימום, דגימות עשויה להיות מעובד או ניתן לאחסן דגימות ב -20 ° C או -80 ° C לפני immunoblotting מייד. כל הנתונים שהוצגו כאן היו שנוצרו באמצעות מערכות ג&#39;ל והעברת Novex NuPAGE. דוגמאות בודדות מassay CER טופלו במאגר מדגם וצמצום סוכן על פי הוראות יצרן. דגימות היו מחוממות לאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -30 μl של כל דגימה היה עמוסה לג&#39;לי טרומי bis-טריס 12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יחס יעילות המרה (CER) כאמצעישל מחסום מינים. רמות מדד מיל PRP על ידי צפיפות 17 ולחלק את הצפיפות הכוללת של מדגם pH 7.4 ידי שמדגם 3.5 pH. להכפיל ב -100 לייצר אחוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים ממשכפל ניסיוני עצמאי כדי ליצור CER סטיית תקן ממוצע ± למינים עם סוכן TSE נתון. </li></ol>

<ol>
	<li>Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).</li><li>Hill, A. F., Collinge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+strains+and+species+barriers.">Prion strains and species barriers.</a> Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).</li><li>Scott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+hamster+prion+protein+produce+species-specific+scrapie+infectivity+and+amyloid+plaques.">Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques.</a> Cell. 59 (5), 847-857 (1989).</li><li>Prusiner, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenetic+Studies+Implicate+Interactions+between+Homologous+Prp+Isoforms+in+Scrapie+Prion+Replication.">Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication.</a> Cell. 63, 673-686 (1990).</li><li>Telling, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+Propagation+in+Mice+Expressing+Human+and+Chimeric+Prp+Transgenes+Implicates+the+Interaction+of+Cellular+Prp+with+Another+Protein.">Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein.</a> Cell. 83, 79-90 (1995).</li><li>Hill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+same+prion+strain+causes+vCJD+and+BSE.">The same prion strain causes vCJD and BSE.</a> Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).</li><li>Torres, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+modulating+the+prion+species+barrier+and+its+passage+consequences.">Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences.</a> PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).</li><li>Groschup, M. H., Buschmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+prion+diseases.">Rodent models for prion diseases.</a> Vet Res. 39 (4), 32 (2008).</li><li>Korth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abbreviated+incubation+times+for+human+prions+in+mice+expressing+a+chimeric+mouse-human+prion+protein+transgene.">Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).</li><li>Kocisko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+specificity+in+the+cell-free+conversion+of+prion+protein+to+protease-resistant+forms:+a+model+for+the+scrapie+species+barrier.">Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).</li><li>Raymond, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+molecular+barrier+limiting+susceptibility+of+humans,+cattle+and+sheep+to+chronic+wasting+disease.">Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease.</a> EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).</li><li>Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+the+transmission+barrier.">In vitro studies of the transmission barrier.</a> Prion. 3 (4), 220-223 (2009).</li><li>Zou, W. Q., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+detergents+enhance+in+vitro+conversion+of+human+brain+PrPC+to+a+PrPSc-like+form.">Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form.</a> J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).</li><li>Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+barriers+for+chronic+wasting+disease+by+in+vitro+conversion+of+prion+protein.">Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).</li><li>Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+prion+protein+conversion+suggests+risk+of+bighorn+sheep+(Ovis+canadensis)+to+transmissible+spongiform+encephalopathies.">In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies.</a> BMC Vet Res. 9, 157 (2013).</li><li>Chandler, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encephalopathy+in+mice+produced+by+inoculation+with+scrapie+brain+material.">Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.</a> Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).</li><li>Browning, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+prions+from+mule+deer+and+elk+with+chronic+wasting+disease+to+transgenic+mice+expressing+cervid+PrP.">Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP.</a> J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).</li><li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+sheep+and+goats+with+transmissible+mink+encephalopathy+virus.">Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus.</a> Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).</li><li>Rubenstein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+surveillance+and+antigen+conformation+determines+humoral+immune+response+to+the+prion+protein+immunogen.">Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen.</a> J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).</li><li>Castilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+species+barrier+by+PrP(Sc)+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions.">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134 (5), 757-768 (2008).</li><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).</li><li>Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quaking-induced+conversion:+a+highly+sensitive+assay+for+prion+detection.">Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection.</a> Prion. 5 (3), 150-153 (2011).</li><li>Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaking+Alone+Induces+De+Novo+Conversion+of+Recombinant+Prion+Proteins+to+beta-Sheet+Rich+Oligomers+and+Fibrils.">Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils.</a> PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).</li><li>Mathiason, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+domestic+cats+to+chronic+wasting+disease.">Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease.</a> J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).</li><li>Seelig, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesion+Profiling+and+Subcellular+Prion+Localization+of+Cervid+Chronic+Wasting+Disease+in+Domestic+Cats.">Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats.</a> Vet Pathol. , (2014).</li><li>Stewart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predictions+of+prion+disease+susceptibility+in+carnivore+species+based+on+variability+of+the+prion+gene+coding+region.">Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region.</a> PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).</li><li>Russell, W. M., Burch, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לסיום מוצלח של פרוטוקול זה, יש לשים לב לרמות PRP C ברקמות מוח נגוע משמשות להכנת מצע (שלב 2.1.2) והזרע למצע יחס לתגובות המרה (שלב 4.4.2). מניסיוננו, ניתן לחלץ את המוח לשימוש כמצע CER לאחר נתיחה שלאחר מות תקופה משמעותית, כל עוד PRP C נמצא על ידי immunoblotting (איור 4). למ?...

&quot;ספגות מוח מדבק (TSEs, מחלות פריון) הוא קבוצה של מחלות ניווניות קטלניות עם תקופות דגירה ממושכות המשפיעות על מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם. סוכן etiological המשוער של TSEs מורכב מהאיזומר misfolded של חלבון פריון מארח (PRP), כי הוא מסוגל התפשטות עצמית על ידי המרה מונעת תבנית של הטופס הסלולרי הרגיל של PRP (PRP C) ל, הקשורים למחלות זיהומיות טופס (PRP TSE) המצטבר ברקמות מערכת עצבים מרכזיות של המארח הנגוע 1. פריונים יונקים זיהומיות בדרך כלל להעביר ממארח ​​למארח באופן מינים ספציפיים, דבר שהוביל לרעיון של &quot;מחסום מיני TSE&quot; הגבלת אירועי שידור interspecies 2. הגורמים הביולוגיים של מחסום מיני פריון אינם מובנה היטב. דמיון רצף חומצות האמיניות בין PRP TSE זיהומיות והמארח ג PRP Cמאוד משפיע אם הגיור מתקיים 3-5, אבל נשאר מספיק כדי להסביר את כל אירועי שידור הפריון נצפו in vivo 6,7. לפיכך, אפיון חסמי מיני TSE הסתמך במידה רבה על מחקרים בבעלי החיים אתגר: חשיפת בעלי חיים תמימים ממין נתון לפריונים מאחרים ומדידת זמן דגירה וכתוצאה מכך להתפרצות מחלה ושיעור התקפת כאינדיקטורים של יעילות העברת. עכברים להביע PRP C ממיני Heterologous משמשים גם לסוג זה של מחקר 8. העלויות כרוכות בייצור מהונדס עכבר וbioassays פריון הממושך, כמו גם שיקולים אתיים של שימוש בבעלי חיים, הם מכשולים בדרך לחקירה ניסויית של מחסומי מיני TSE. הערכה של מכשול המין האנושי לTSEs מסתמכת על עכברים שהונדסו אדם PRP C. עכברים אלה דורשים תקופות דגירה ארוכות להיכנע לTSEs או שינויים כדי לא אנושייםהוא מולקולת PRP C בבני אדם למחלה מהירה תחילת 9. תקופות דגירה לTSEs לא אנושי בעכברים אלה עשויות להאריך את תוחלת החיים מעבר לעכבר הרגיל עושה פרשנות של תוצאות שליליות מאתגרות. פרימטים שאינם בני אדם יש גם שימשו כשליחים ללימוד מחסומי מין אנושיים, אך מחקרים אלה הם טומנים בחובה אותם האתגרים כמו סוגים אחרים של ניסויים בבעלי חיים וקופים שאינם בני אדם עשוי שלא בדיוק לשחזר מחלה כפי שהוא ממשיך במארח האנושי. bioassays בעלי החיים יישאר בשיטה &quot;תקן זהב&quot; למדידת הרגישות של מינים לTSE, אבל המכשולים, העלויות והאתיקה של מחקרים בבעלי החיים חיים אלה אילצו את חקירת חלופות. מספר מבחני במבחנה, המבוססים על הערכת ההמרה של מארח PRP C לproteinase K (PK) מדינת -resistant (מיל PRP) כאשר שנזרעו על ידי PRP TSE, פותחו ושימוש כדי לחקור sp TSEמחסומי ecies 10-12. דוגמאות למבחנים במבחנה כוללות מבחני תא ללא המרה, חלבון misfolding הגברה מחזורית (PMCA), ויחס יעילות המרת assay (CER) 10-14. למרות שאף אחד ממבחנים אלה לקחת בחשבון גורמים היקפיים המעורבים במחסומי מינים לאחר הדבקה טבעית, כולם יכולים להיות שימושיים כדי לזהות מארחים פוטנציאליים רגישים לTSEs. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור assay CER, שבו שני מצעי PRP C מפוגלים נגזרים מhomogenates המוח הנורמלית משמשים בתגובות המרת פריון העליונה ספסל (איור 1) 13. PRP C במצע המפוגל ב- pH 7.4 ניתן להמיר רק למיל PRP ידי PRP TSE זורעים לתוך התגובה בהיעדר מחסום מינים 14. בניגוד לכך, denaturation של PRP C במצע האחר ב- pH 3.5 מאפשר לה להיות מומר לדגירה הבאה מיל PRPעם PRP TSE מכל מינים ומשמש כביקורת לגיור. יחס ההמרה של PRP C למיל PRP בpH 7.4 ביחס מצע לזה של מצע 3.5 pH מספק מדד של מחסום המינים. מצאנו כי assay CER מנבא ידוע מחסומי מינים של עכברי מעבדה לTSEs השונים והשתמש assay במאמצים כדי לחזות את מחסום המינים של מינים רבים של יונקים, כוללים איל בר, למחלה כרונית לבזבז (CWD) וTSEs האחר 14, 15. חוקרים מעוניינים בכלי המאפשר סינון מהיר של מחסומים או הערכה של המרת PRP C מיל -כדי-PRP מיני TSE ימצא מתודולוגיה זו שימושית.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm Zirconium oxide beads</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>Other varieties of beads are also effective</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td>various suppliers</td><td></td><td>Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrP&lt;sup&gt;res&lt;/sup&gt; from species of interest</td></tr><tr><td>Bead homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>High speed with temperature control</td></tr><tr><td>Conical tubes</td><td>any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicator</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn sonicator</td><td>Heat Systems-Ultrasonics</td><td>W-380</td><td>Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometry software program</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td><td>Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>End-over-end mixer</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetra acetic acid</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Hazardous chemical: eye irritation</td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td></tr><tr><td>Heating block</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Hazardous chemical: strong acid</td></tr><tr><td>Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Hazardous chemical: skin &amp;amp; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L-5125</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel system</td><td>Life Technologies</td><td>NuPAGE electrophoresis system</td><td>Other SDS-PAGE systems will also work</td></tr><tr><td>PCR tubes (low-binding)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Pestle homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyldifluoride membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Hazardous chemical: skin &amp;amp; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td></tr><tr><td>Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D6750</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Hazardous chemical; strong base</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>various</td><td>Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td></tr><tr><td>Syringe needles</td><td>BD Biosciences</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (PCR tube shaker)</td><td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

שימוש מוצלח של assay CER תלוי במידה רבה על האיכות של זוגות המצע המשמשים בתגובות המרה. מסיבה זו, בעקבות הליכים להכין זוגות מצע CER, immunoblot בקרת איכות צריכה להתבצע (איור 2). עבור שני מצעים, assay 10-25 μl על ידי immunoblotting. PRP C צריך להיות בקלות לזיהוי בכל מצע ורמות PRP C ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay at JoVE.com

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

assessing-transmissible-spongiform-encephalopathy-species-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K Views.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Video: Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Immunology and Infection

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

בדיקת החלקה של מעבדת בטיחות פריון

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

זיהוי של חלבון פריון חריג על ידי אימונוהיסטוכימיה

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Neuroscience

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Biology

Detecting Abnormal Prion Proteins in Brain Tissue Using Immunohistochemistry

Source: Orge, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64560">Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates a technique to detect misfolded prion protein in brain sections using immunohistochemistry. Upon treating the brain section with formic acid to denature prions and minimize infection risk, as well as unmasking the prion aggregates using heat-induced epitope retrieval, the sections are immunolabeled for the misfolded prion protein aggregates and observed under a microscope.

איתור חלבוני פריון חריגים ברקמת המוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה

1. Tissue sectioning and slide preparation

	Cut sections of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues at 3-5 &#181;m thickness using a microtome.
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

Take tissue homogenate from a mammalian brain that contains both normal prion proteins and misfolded prion aggregates responsible for neurodegenerative diseases.
Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.
Treat the aggregates with a denaturing buffer at a high temperature to linearize the proteins and impart a uniform negative charge.
Load the sample onto an electrophoresis gel and separate the proteins into bands, which confirms the presence of aggregates.
Using an electric field, transfer the separated proteins onto a membrane.
Incubate the membrane in a blocking solution to mask non-specific binding sites.
Incubate with peroxidase enzyme-tagged antibodies, which bind specifically to the prion aggregates.
Wash the membrane to remove unbound antibodies, minimizing non-specific signals.
Add a chemiluminescent substrate and an oxidizing agent, enabling the peroxidase to oxidize the substrate and produce light.
Measure the light intensity to quantify misfolded prions in the homogenate.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video