We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.

Animal lavoro condotto presso l&#39;USGS National Wildlife Health Center è stata eseguita in accordo con l&#39;Ufficio NIH di linee guida Laboratory Animal Welfare e sotto la cura degli animali istituzionale e comitato uso protocollo # EP080716. I tessuti di animali cacciatori-raccolta erano doni del Wisconsin o Michigan dipartimenti delle risorse naturali. 1. Soluzione Preparazione NOTA: Le soluzioni elencate di seguito sono necessari per la preparazione del substrato test CER nella Sezione 2 sotto. Preparare ciascuna di queste soluzioni di elevate soluzioni concentrazione azionari; Le concentrazioni consigliate per soluzioni madre sarà dato in parentesi dopo ogni rispettivo nome chimico elencato. Preparare tutte le soluzioni fresche sulla preparazione del substrato e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. <ol><li> Per tampone di lisi, preparare una soluzione delle seguenti in Tris 10 mM, pH 7.5 (1 M Tris, pH 7.5 soluzione madre consigliato): 100 mm scloruro di odium (NaCl, 1 M soluzione madre), 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, EDTA 500 mm, pH 8.0 soluzione madre), 0,5% NP-40 (10% soluzione madre), 0,5% desossicolato (DOC, 10% soluzione madre ). </li><li> Per buffer di conversione, preparare una soluzione di 0,05% sodio dodecil solfato (SDS, 10% soluzione madre) e 0,5% Triton X-100 (10% soluzione madre) in 1 tampone fosfato salino (PBS, 10, pH 7.4 soluzione stock). </li><li> Per le soluzioni caotropici, preparare due 3 M soluzioni di guanidina cloridrato (GdnHCl, 8 m stock) in 1x PBS (10x soluzione madre). Regolare il pH di una delle soluzioni di 3,5 ± 0,05 con acido cloridrico concentrato (HCl). Verificare che il pH della seconda soluzione rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare utilizzando idrossido concentrato HCl o di sodio (NaOH) se necessario. </li></ol> 2. Preparare CER Assay substrato Pairs <ol><li> Ottenere tessuto cerebrale sano, non-TSE-infettati da specie di interesse e preparare un volume peso-per-10%(W / v) omogenato in tampone di lisi utilizzando uno dei seguenti metodi: Dounce, branello-mulino, o mortaio e pestello omogeneizzazione. Ulteriori definire risultante omogenati sottoponendoli a siringa e ago omogeneizzazione, usando aghi di calibro crescente fino substrato può essere aspirato ed espulsa con facilità attraverso un ago di siringa G 27. <ol><li> Per sottofondi preparati da roditori e altri piccoli mammiferi, omogeneizzare tutto il cervello (s); per substrati preparati da grandi mammiferi, utilizzare OBEX (tronco encefalico) tessuto da preparare omogeneizzati. Quando si seleziona la quantità di omogenato cerebrale, preparare non più del 50% della capacità della centrifuga utilizzata per precipitazione delle proteine ​​nel passo 2.6. </li><li> Se la qualità del tessuto cerebrale acquisita è discutibile, valutare i livelli di PrP C da SDS-PAGE 16 e immunoblot 17 prima del substrato di preparazione. </li></ol></li><li> Dividere omogenato cervello in due volumi uguali a tubi conici di plastica etichettati separati. Aggiungi GdnHCl (3 M soluzioni in 1 PBS) a pH 3,5 o 7,4 a ciascuna provetta in un rapporto 1: 1 volume di omogenato cerebrale. </li><li> Controllare i valori di pH delle due soluzioni. Regolare il pH del pH 3.5 ± substrato a pH 0,05 con HCl concentrato. Assicurarsi che il pH del altro substrato rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare il pH se necessario con HCl o NaOH come necessario. Evitare di superamento dei valori di pH da giudiziosa aggiunta di acido o di base. </li><li> Ruotare soluzioni in un mixer end-over-end a temperatura ambiente (RT) per 5 ore. </li><li> Precipitato proteico aggiungendo quattro volumi di metanolo alle soluzioni substrato in ogni provetta conica, vortex per miscelare bene, e incubare a -20 ° C per 16-18 ore. </li><li> Campioni di sedimento di centrifugazione a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C. Decantare con cautela e scartare il surnatante e lasciare evaporare il metanolo dai pellet. Utilizzare applicatori con punta di cotone per aiutare ad assorbire metanolo aggrappato alla parte interna del tubo. Non permettere pellets di over-dry e una volta metanolo non è più visibile, procedere al passo successivo. </li><li> Pellets proteine ​​Risospendere in tampone di conversione. Utilizzare una quantità di tampone di conversione pari alla quantità di omogenato cerebrale materiale di partenza erogato in ogni provetta nel passo 2.2. NOTA: E &#39;fondamentale che il buffer di conversione usato per risospendere pellet di proteine ​​sia da pH 3,5 e preparati substrato 7,4-trattati è la soluzione di cui al precedente punto 1.2 (che contiene bassi livelli di detersivi e un pH fisiologico). </li><li> Soluzioni brevemente agli ultrasuoni substrato in un sonicatore cuphorn (10 sec al ~ 30% di potenza massima), aliquota in 0,5-1,0 ml di volume in etichetta 1,5 ml microprovette. Eseguire un immunoblot controllo di qualità (passo 2.9) su un&#39;aliquota di ciascun substrato. Conservare le altre aliquote a -80 ° C fino al momento di effettuare test CER (sezione 4). </li><li> Eseguire il controllo della qualità su coppie substrato CER prima dell&#39;uso (Figura 2). Questi passaggi assicurano che substrati CER saranno provide risultati ottimali in studi di conversione. <ol><li> Garantire quantità comparabili di PrP C nei due substrati. Confronta i livelli di PrP in 10-25 ml di ogni substrato mediante SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17. Se i livelli di proteine ​​nel pH 7.4 e 3.5 supporti si trovano a circa il 10% di ogni altro, le coppie substrato sono appropriati per l&#39;utilizzo in studi CER. NOTA: Le immunoblots PrP non dovrebbero mostrare la prova di un&#39;eccessiva degradazione PrP C. L&#39;immunoreattività PrP dovrebbe essere principalmente&gt; 20 kDa. Bands meno di questa massa molecolare possono essere prodotti di degradazione. Modelli banding dovrebbero essere più o meno equivalente tra coppie substrato. </li><li> Come la PrP C in entrambi i substrati dovrebbe essere sensibile PK, trattare 10-25 microlitri di ciascun substrato con PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml e digerire campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker. Valutare qualsiasi segnale PrP rimanente SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17.Substrati con res PrP non sono adatti per l&#39;utilizzo in studi CER. </li></ol></li></ol> 3. Preparare TSE Agente Seeds <ol><li> Ottenere tessuto cerebrale TSE-infettati da specie di interesse e di preparare un 10% (w / v) omogeneizzato in 1x PBS pH 7.4 con le modalità di cui al punto 2.1. NOTA: Semi potrebbero essere ottenuti anche da altri tessuti infetti da TSE fuori del sistema nervoso centrale, tuttavia, l&#39;efficienza di conversione del cervello derivato substrati da semi derivati ​​da tessuti periferici TSE-infette non è ancora stata valutata sperimentalmente nella letteratura pubblicata. </li><li> Aliquota risultante omogeneizzato (s) in 100-300 volumi microlitri in 0,5 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C fino al momento di eseguire il test CER. </li></ol> 4. CER Assay NOTA: Il test CER comporta aggiunta di una quantità relativamente piccola di PrP TSE (fornito nel &quot;seme&quot;) da una speciein un eccesso relativo di PrP C (fornito nel cervello non infette &quot;substrato&quot;) da un&#39;altra specie che è stato parzialmente denaturati a pH 3.5 o 7.4. Dopo un periodo di incubazione prolungato tremante, la conversione template-driven di PrP C da PrP TSE in ogni reazione è valutata dal segnale densitometrica di PrP res rimanente dopo PK digestione e la rilevazione immunoblot. Confrontando livelli res PrP nei substrati precedentemente denaturate a pH 3,5 contro 7,4 fornisce una misura della barriera di specie. Una panoramica sperimentale di questa procedura di analisi è fornito in Figura 1. <ol><li> Lentamente scongelare infetti coppie substrato CER (test richiede volumi uguali di substrati precedentemente denaturato sia a pH 3.5 e 7.4) e le soluzioni di semi TSE-infetti mettendoli sulla cima di un letto di ghiaccio (a circa 1 ora di tempo disgelo). </li><li> Una volta completamente scongelati, aspirare e poi espellere ogni soluzione substrato attraverso un27 G siringa più volte a ri-omogeneizzare. Brevemente agli ultrasuoni ogni soluzione seme TSE-infettati per 10 secondi al ~ 30% di potenza massima. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio mentre si prepara reazioni di conversione. </li><li> Label 5 singoli, pareti sottili tubi basso legame PCR per agente TSE in fase di sperimentazione. </li><li> Preparare reazioni di conversione in questi tubi aggiungendo 5 ml di soluzione al 10% di semi TSE-infetta a 95 ml di (a) substrato CER preparati a pH 7,4 e (b) substrato CER preparati a pH 3,5. <ol><li> Per ogni campione sperimentale, preparare reazioni parallele a coppie substrato CER precedentemente denaturato sia a pH 3,5 e 7,4. </li><li> Ottimizzare i rapporti di TSE seme agente per substrato cervello infetto attraverso la determinazione empirica. Seme Comune: rapporti substrato impiegati mantengono un volume totale di reazione di 100 ml e comprendono 1:99 microlitri, 2:98 e 5:95 ul ul. Per la maggior parte delle applicazioni, il seme 5:95 microlitri: rapporto volume del substrato è adeguato ed è quello che si presenta in thè il protocollo. </li></ol></li><li> Preparare tre campioni di controllo per agente TSE in fase di test nel modo seguente: (a) aggiungere 5 ml di soluzione al 10% di semi di TSE-infetta al buffer di conversione 95 microlitri come controllo per ingresso res PrP; aggiungere buffer di conversione 5 ml a 95 ml di substrato preparato a (b) pH 3.5 (c), pH 7,4 come controlli per non-specifico, la conversione non su modelli. </li><li> Brevemente vortice ogni campione nella sua provetta PCR chiuso mescolare semi e substrato bene. Seguire con un impulso momentaneo in una bassa velocità da banco mini-centrifuga per rimuovere qualsiasi volume della miscela di reazione intrappolato nel coperchio provetta PCR. </li><li> Caricare i campioni in tubi PCR singolarmente etichettati in un banco top termo-shaker attrezzato per accettare provette PCR. Agitare campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Dopo agitazione, aggiungere sarcosile ad una concentrazione finale del 2% (w / v) e PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Campioni Digest a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker. NOTE: aggiunta di sarcosile campioni aiuti post-conversione in PK digestione di PrP C. Segnali positivi falsi in campioni non teste di serie (punto 4.5) sono virtualmente eliminati con l&#39;aggiunta di sarcosile. </li><li> Aggiungere tampone campione SDS-PAGE, campioni di calore a 95 ° C per 5 minuti e risolvere rimanenti PrP res in ciascun campione mediante SDS-PAGE seguita da immunoblotting 16 17. NOTA: Dopo l&#39;aggiunta di tampone campione e riscaldamento, i campioni possono essere immediatamente elaborato o campioni possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C prima di immunoblotting. Tutti i dati qui presentati sono stati generati utilizzando i sistemi di gel e di trasferimento Novex NuPAGE. I singoli campioni del test CER sono stati trattati con il tampone e la riduzione dell&#39;agente secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati successivamente riscaldati a 95 ° C per 5 min e 30 microlitri di ciascun campione sono stati caricati in un 12% bis-tris gel prefabbricati. </li><li> Calcolare il rapporto efficienza di conversione (CER) come misurabarriera di specie. Misura i livelli di res PrP di densitometria 17 e dividono la densità totale del campione pH 7,4 da quella del campione di 3,5 pH. Moltiplicare per 100 per produrre una percentuale. </li><li> Compilare i dati da repliche sperimentali indipendenti di generare una media CER ± deviazione standard per una specie con un determinato agente TSE. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Per il completamento di questo protocollo, occorre prestare attenzione ai livelli PrP C nel tessuto cerebrale infetto usato per la preparazione del substrato (fase 2.1.2) e il seme al substrato rapporto per le reazioni di conversione (passo 4.4.2). Nella nostra esperienza, cervello possono essere estratte per uso come substrato CER dopo un sostanziale periodo post-mortem, purché PrP C è presente per immunoblotting (Figura 4). In effetti, alcuni autolisi è stato osservato nel cer...

Encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie prioniche) sono un gruppo di malattie neurodegenerative fatali con periodi di incubazione lunghi che interessano una varietà di animali ed esseri umani. L&#39;agente eziologico putativo di TSE comprende un isomero misfolded della proteina prionica host (PrP) che è in grado di auto-propagazione per conversione template-driven della forma cellulare normale PrP (PrP C) in una, associata malattia infettiva forma (PrP TSE) che si accumula nei tessuti del sistema nervoso centrale dell&#39;ospite infettato 1. Prioni mammiferi infettive in genere trasmettono da host-to-host in modo specifico per le specie, che ha dato origine al concetto di &quot;TSE specie barriera&quot; limitare gli eventi di trasmissione interspecie 2. I fattori biologici della barriera prione specie non sono ben compresi. Sequenza aminoacidica somiglianza tra il infettiva PrP TSE e l&#39;host PrP C cUn&#39;influenza fortemente se conversione avviene 3-5, ma rimane insufficiente per spiegare tutti gli eventi di trasmissione dei prioni osservati in vivo 6,7. Così, la caratterizzazione delle barriere di specie TSE ha largamente invocato studi di provocazione animale: esporre animali ingenui da una determinata specie di prioni da un altro e misurando il tempo di incubazione risultante per l&#39;insorgenza della malattia e il tasso di attacco come indicatori di efficienza di trasmissione. I topi che esprimono PrP C da specie eterologhe sono utilizzati anche per questo tipo di studio 8. I costi associati alla produzione di topo transgenico e biotest prioni prolungati, così come le considerazioni etiche di utilizzo degli animali, sono ostacoli alla ricerca sperimentale di TSE barriere di specie. Valutazione della barriera di specie umana di TSE si basa su topi ingegnerizzati per esprimere umana PrP C. Questi topi richiedono periodi di incubazione lunghi a soccombere alle TSE o modifiche al T umaniegli molecola PrP C umana per la malattia rapida insorgenza 9. Periodi di incubazione delle EST non umano in questi topi possono estendersi oltre la normale durata di vita del mouse facendo interpretazione dei risultati negativi difficili. I primati non umani sono stati utilizzati anche come proxy per lo studio delle barriere di specie umane, ma questi studi sono irto le stesse sfide degli altri tipi di sperimentazione animale e primati non umani non può ricapitolare precisamente malattia procede nell&#39;ospite umano. Analisi su animali rimangono il metodo &quot;gold standard&quot; per misurare la suscettibilità di una specie di TSE, ma gli ostacoli, i costi e l&#39;etica di questi studi su animali vivi hanno costretto indagini alternative. Un certo numero di saggi in vitro, basati sulla valutazione della conversione di ospitante PrP C ad una proteinasi K (PK) Stato -resistenti (res PrP) quando seminato da PrP TSE, sono stati sviluppati e utilizzati per studiare TSE spECIES barriere 10-12. Esempi di saggi in vitro includono test cell-free di conversione, proteine ​​misfolding di amplificazione ciclica (PMCA), e il rapporto di efficienza di conversione (CER) dosaggio 10-14. Anche se nessuno di questi test tiene conto di fattori periferici coinvolti in barriere di specie dopo l&#39;infezione naturale, tutto può essere utile per identificare gli host potenzialmente sensibili per le TSE. Qui vi presentiamo il protocollo per il test CER, in cui due substrati denaturati PrP C derivati ​​da normali omogenati cerebrali sono utilizzati in reazioni di conversione prione banco (Figura 1) 13. PrP C nel substrato denaturato a pH 7,4 può essere convertito solo res PrP da PrP TSE seminate nella reazione in assenza di una barriera di specie 14. Al contrario, denaturazione di PrP C in altro substrato a pH 3.5 permette di essere convertito PrP res seguente incubazionecon PrP TSE da qualsiasi specie e serve come controllo per la conversione. Il rapporto di conversione di PrP C res PrP in pH 7,4 substrato rispetto a quella del substrato pH 3.5 fornisce una misura della barriera di specie. Abbiamo scoperto che il test CER predice noto barriere di specie di topi di laboratorio per varie TSE e hanno utilizzato il test nel tentativo di prevedere la barriera di specie di numerose specie di mammiferi, tra cui pecore bighorn, alla malattia del dimagrimento cronico (CWD) e altre TSE 14, 15. Gli investigatori interessati in uno strumento che consenta il rapido screening delle TSE specie barriere o valutazione della conversione PrP C-to-PrP res troveranno questa metodologia utile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">12% Bis-Tris SDS-PAGE gels</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">0.5 mm zirconium oxide beads</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">ZROB05&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Other varieties of beads are also effective</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:296px;">Antibodies</td>
			<td style="width:205px;">various suppliers</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;">Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bead homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Next Advance</td>
			<td style="width:157px;">BBY24M</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:157px;">369434</td>
			<td style="width:287px;">High speed with temperature control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:205px;">Uline</td>
			<td style="width:157px;">S-18991</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Cuphorn sonicator</td>
			<td style="width:205px;">Heat Systems-Ultrasonics</td>
			<td style="width:157px;">W-380</td>
			<td style="width:287px;">Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">Densitometry software program</td>
			<td style="width:205px;">UVP</td>
			<td style="width:157px;">Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software</td>
			<td style="width:287px;">Other programs, such as NIH ImageJ, will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:157px;">885300</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">End-over-end mixer</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">H5600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetra acetic acid</td>
			<td style="width:205px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:157px;">P-770</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine hydrochloride, 8M</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">24115</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating block</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">11-718</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">435570</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: strong acid</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0008</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">A454-4</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:205px;">any brand</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:205px;">Labnet International</td>
			<td style="width:157px;">C1301</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">L-5125</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:205px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">M158</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin irritation, eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:296px;">SDS-PAGE gel system</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NuPAGE electrophoresis system</td>
			<td style="width:287px;">Other SDS-PAGE systems will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">PCR tubes (low-binding)</td>
			<td style="width:205px;">Axygen</td>
			<td style="width:157px;">PCR-02-L-C</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Pestle homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">03-392-106</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">pH meter</td>
			<td style="width:205px;">Sentron</td>
			<td style="width:157px;">SI600</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyvinyldifluoride membrane</td>
			<td style="width:205px;">Millipore</td>
			<td style="width:157px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:205px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">V3021</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin &#38; eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:296px;">Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">NP0009</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">D6750</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">28364</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:205px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:157px;">S5881</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemica; strong base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Syringe</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;">Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Syringe needles</td>
			<td style="width:205px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:157px;">various</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Thermoshaker (PCR tube shaker)</td>
			<td style="width:205px;">Hangzhou All Sheng Instruments</td>
			<td style="width:157px;">MS-100</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Tris base</td>
			<td style="width:205px;">Bio Basic&#160;</td>
			<td style="width:157px;">77-86-1</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:205px;">Integra Chemical Company</td>
			<td style="width:157px;">T756.30.30</td>
			<td style="width:287px;">Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Vortexer</td>
			<td style="width:205px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">12-812</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing transmissible spongiform encephalopathy species barriers with an in vitro prion protein conversion assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Uso di successo del dosaggio CER dipende in gran parte dalla qualità delle coppie substrato utilizzati nelle reazioni di conversione. Per questo motivo, secondo procedure per preparare CER coppie substrato, un immunoblot controllo di qualità deve essere eseguito (Figura 2). Per entrambi i substrati, dosaggio 10-25 ml per immunoblotting. PrP C dovrebbe essere facilmente rilevabile in ogni substrato e livelli di PrP C deve essere di circa la stessa tra i due. Immunoreattività sar?...

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Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Valutare l&#39;encefalopatia spongiforme trasmissibile Specie Barriere con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Protein Assay Conversion

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

7.7K Views.  USGS National Wildlife Health Center. Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.