This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins&#8217; laboratory for the help on the OCT imaging.

HINWEIS: Tierversuchsprotokolle wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität zugelassen. CD1-Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von P10 bis P20 sind in dieser Studie verwendet. 1. Lösungen für Chirurgie und Experimental-Aufnahme <ol><li> Bereiten normalen künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) enthaltenden Puffer (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, Dextrose 10 und CaCl 2 2. Verwenden dieses normalen aCSF zur Gewebewiederherstellung nach der Sektion, als auch für Waschsystem zu Beginn des Experiments. </li><li> Bereiten Saccharose aCSF, die während des Hippocampus Dissektion verwendet wird und enthält (mM): Saccharose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, Dextrose 10 und CaCl 2 2. Um epileptiforme Aktivität in intakten Hippocampus Gewebeaufbereitung induzieren, fügen Sie 4-Aminopyridin (4-AP) in den Normal aCSF andie Konzentration von 100 uM. </li></ol> 2. Chirurgische Verfahren für die Intact Hippocampus Vorbereitung <ol><li> Tropfen Isofluran (1 ml) in die Kammer an der Unterseite der Exsikkator Glas (No.1 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) und mit einem normalen Papiertuch, um die Oberfläche der Bodenstufe abdecken so das Tier nicht in Kontakt kommen die Flüssigkeit. Legen Sie dann die CD1-Maus in den Topf und den Deckel schließen. Halten Sie das Tier in dem geschlossenen Gefäß für etwa 1 min bis 2 min. Bei Atemfrequenz etwa einem pro Sekunde, entfernen Sie die Maus aus dem Glas. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Bühne und enthaupten mit einer geeigneten Schere. Unmittelbar nach der Enthauptung, legen Sie den Kopf in den eiskalten (3-4 ° C), sauerstoff Saccharose aCSF für etwa 30 sec. </li><li> Verwenden einer feinen Schere (No.5 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung), um die Haut auf der Oberseite des Schädels zu entfernen und die Schädel entlang der Mittellinie des Kopfes als auch an den beiden Enden in der Nähe der Tempo geschnittenral Lappen. Verwenden einer Pinzette (No. 6 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung), um den Schnitt Schädel zu jeder Seite des Kopfes, um das Gehirn ausgesetzt schälen. </li><li> Legen Sie eine Mikro-Labor Spatel (No. 8 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) in den Spalt zwischen den Scheitellappen des Gehirns und des Schädels, um sorgfältig schälen das Gehirn von der Unterseite des Schädels und dann legen Sie es auf eine vorbereitete eiskaltem (3 -4 ° C) Operationstisch mit feuchtem Filterpapier (Nr.2 in spezifischen Materialien und Geräte) abgedeckt. Entfernen des Cerebellum mit eisgekühltem Klinge und trennen die beiden Hemisphären durch Schneiden der Mittellinie des Gehirns. Legen Sie dann die beiden Hemisphären getrennt in ein Becherglas mit dem eiskalten Saccharose aCSF mit 95% O 2/5% CO 2 sprudelte gefüllt. </li><li> Nehmen Sie die Hälfte der Hemisphäre und auf den eiskalten Filterpapier Bühne. Zeigen regelmäßigen Küchenpapier oder Filterpapier, um das Gehirn, um die zusätzliche Lösung zu saugen. Verwenden Sie zwei feuerpolierte Glaspipette-Tools (No. 10 in Materialien undAusrüstung), den Kortex vom Rest des zentralen Teils des Gehirns zu trennen. </li><li> Nach der Hippocampus aus dem Inneren der Hirnrinde freigelegt und auf dem eiskalten Bühne zu bringen, indem Sie zwei oder drei Tropfen eiskalten Saccharose aCSF auf das Gewebe und entfernen Sie zusätzliche Lösung rund um den Hippocampus. Schneiden Sie die Verbindungen mit dem Kortex an zwei Enden des Hippocampus. Dann sezieren den Hippocampus aus dem Gehirn mit den feuerpolierten Glaswerkzeuge und den verbleibenden Teil des Gehirns zu entfernen. </li><li> Trennen Sie die gesamte Hippocampus mit seinen alveus Seite nach oben und Sulcus hippocampi nach unten. Drop schnell zwei oder drei Tropfen eiskaltem Saccharose aCSF auf das Gewebe wieder und entfernen Sie die zusätzliche Lösung um das Gewebe mit einem Stück Küchenpapier. Verwenden Sie eine feuerpolierte Glas Werkzeug drehen Sie den ganzen Hippocampus, den Sulcus (1B, C) ​​aussetzen. </li><li> Unter einem normalen Lichtmikroskop, legen Sie eine maßgeschneiderte Glas Nadel (No. 11 in bestimmten MateriALS und Equipment) in ein Ende des Sulcus und schneiden die Faserverbindungen von Gyrus dentatus (DG), um Subiculum oder der CA1-Feld, entlang der Richtung des Sulcus (Abbildung 1C). Tragen Sie eine eiskalte Klinge, um die Scheidewand und zeitliche Enden des Hippocampus bei Bedarf trimmen. Legen Sie eine maßgeschneiderte Metalldrahtschleife (No. 12 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) in den Ausschnitt Sulcus und ziehen Sie über die GD von dem Gewebe, während die Subiculum / CA1 Ende des Hippocampus halten durch eine feuerpolierte Glaswerkzeug (1D) . </li><li> Nach der Entfaltung Verfahren vor, fügen Sie noch zwei oder drei Tropfen des eiskalten Saccharose aCSF auf das Gewebe und entfernen Sie die zusätzliche Lösung um das Gewebe. Dann schneiden Sie die ungefaltet Hippocampus mit der eiskalte Klinge an den Rändern (1E) und legen Sie die Vorbereitung mit einem Spatel in die Rückgewinnungskammer mit normaler aCSF gefüllt und bei Raumtemperatur mit 95% O 2/5% CO 2 sprudelte (ca. 25 ° C). Stehen Lassendie entfaltete Hippocampus Gewebe ca. 1 Stunde, bevor Sie sie in den Aufnahmeraum zu erholen. </li><li> Fahren Sie auf der anderen Gehirnhälfte und es verwenden, um durch die Schritte 2,5-2,9 gehen. In der Regel dauert etwa 1 bis 2 min, das gesamte Verfahren zu beenden, um eine einzelne Hippocampus entfalten &amp; Drop eiskalten Saccharose aCSF kontinuierlich, um das Gewebe mit Sauerstoff angereichert und mit Feuchtigkeit versorgt. </li></ol> 3. Experimentelle System-Setup- <ol><li> Kleben Sie ein individuell gefertigter PMEA auf einem Pin-Grid-Array (PGA) Paket und nutzen Mikrodrahtbonden, jede Unterlage aus einer Mikroelektrode auf das Kissen der auf der Verpackung (3B) einen Stift zu verbinden. Legen Sie dann das Paket in die Buchse an einem maßgeschneiderten Leiterplatte 13. </li><li> Individuell verbinden jeden Mikro seiner Filter mit Bandpassgrenzfrequenz von 1 Hz bis 4 kHz und Verstärker mit Verstärkung von 100 auf der maßgeschneiderte Leiterplatte 13. Digitalisieren des Analogausgangssignal von der Platine durch einen A / D CONVerting System und Erfassen und Speichern der Daten auf einem Computer. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Kunststoffaufnahmekammer um das Array mit Ein- und Auslaufschlauch für das Lösungsstrom (4A). Verwenden Sie mindestens zwei Flaschen, verschiedene Lösungen im System zu belassen, und kommen und den Ausgangsschlauch der Flaschen Kontrolle durch eine Tri-Ventil. Verbinden Sie den Ausgang des Tri-Ventil an ein Schlauchsystem mit einer IV Tropfkammer, die Führung wird die Lösung in den Aufnahmeraum. </li><li> Zwischen dem tri-Ventil und dem Einlass der Aufzeichnungskammer, fügen eine elektrische Heizung, die Lösung auf einer kontrollierten Temperatur (35 ° C), bevor die Lösung auf das Aufzeichnungskammer geführt zu erhitzen. Befestigen Sie den Ausgang der Aufnahmekammer an eine Vakuumröhre, die Lösung in eine Vakuumröhre verbunden Kolben sammeln. Sie bereiten keine Lösung in jedem Experiment in dieser Studie. </li></ol> 4. Platzieren des Unfolded Hippocampus auf die PMEA die neuronale Aktivität aufzuzeichnen </p&gt; <ol><li> Um die Versuchsanordnung vorzubereiten, füllen Sie eine Flasche mit normaler aCSF und eine Flasche mit 4-AP aCSF. In beiden Flaschen, Blase 95% O 2/5% CO 2 von Beginn eines jeden Versuchs. Verwenden Sie ein Tri-Ventilstecker zu steuern, welche Lösung bei einem Experiment ausgewählt werden. Anschließen eines Vakuumrohres am Auslaß der Kammer, um die Lösung in einen Staubbehälter zu pumpen. Erhitzen Sie die Pipeline vor der Zustellung in den Aufnahmeraum und halten Sie die Lösung bei einer kontrollierten Temperaturniveau (35 ° C). </li><li> Wenn der Einlass und Auslass des Aufnahmekammer geschlossen sind, verwenden Sie eine maßgeschneiderte Glaspipette Pipette, um in den Aufnahmeraum zu übertragen und setzen Sie den ausgeklappten Hippocampus. Unter dem Mikroskop positionieren entfaltet Hippocampus mit einem normalen kleinen Pinsel, während das Gewebe in der Lösung schweben. Stellen Sie den aufgeklappten Hippocampus mit seinen alveus Seite nach unten, CA3 Bereich wegweisend und CA1 Feld in Richtung der Forscher. </li&gt; <li> Sorgfältig abzusaugen, die Lösung in der Kammer mit einer Vakuumpipette von der Kante des Aufzeichnungskammer, die Lösungspegel zu reduzieren, bis die Kammer wird getrocknet und das Gewebe wird auf die Anordnung gesenkt. Dann setzt vorsichtig eine maßgeschneiderte Gewebeanker (Bild 4) (No. 14 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) auf der Oberseite des Gewebes, um die entfaltete Hippocampus auf die Anordnung zu halten. Geben Sie einige Tropfen der Lösung in die Aufnahmekammer, um sie wieder zu füllen, und nach und nach öffnen Sie den Eingang und Ausgang zum Durchflussmenge auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde in der IV Tropfkammer einzustellen. </li><li> Inkubieren Sie die Gewebe in der Aufnahme Kammer mit normaler aCSF für ca. 1 min zu erholen, dann schalten Sie die Lösung Versorgung 4-AP aufgelöst aCSF und stellen Sie die Durchflussrate korrekt. Inkubieren des Gewebes in 4-AP aufgelöst aCSF für etwa 5 bis 10 Minuten und dann konnte der Forscher die Software zu starten, um das Signal aufnehmen, wenn spontane Aktivität angezeigt. </li></ol> 5. Entfernen derGewebe aus dem PMEA Nach einem Experiment <ol><li> Steuern Sie die Gewebeanker durch einen Mikromanipulator und allmählich heben Sie das Gewebe aus der Aufnahmekammer. Fahren Sie sowohl Ein- und Ausgang, um den Fluss in der Aufnahmekammer zu stoppen. Die Aufnahmekammer sollte voll mit Lösung sein oder ein paar Tropfen der Lösung, um die Kammer zu füllen, wenn die Aufnahme Kammer nicht voll ist. </li><li> Mit einem kleinen Pinsel, um jede Ecke des Gewebes zu heben. Wenn das Gewebe nicht in der Lösung schweben, dann verwenden die Vakuumröhre in die Kammer sorgfältig mit dem Gewebe immer noch auf der Anordnung sitzt trocknen. Öffnen Sie dann vorsichtig den Einlass schrittweise füllen Sie die Kammer und fahren Sie den Einlass, um den Fluss zu stoppen, wenn der Aufnahmeraum ist voll. Übernehmen Sie die kleinen Pinsel, um jede Ecke des Gewebes wieder zu heben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis zum Gewebe wird aus dem Feld gelöst und schwebend in der Lösung. Wenn das Gewebe in der Lösung schwimmen, dann mit der Vakuumröhre, um das Gewebe entfernt saugen. Offene ter in der Einlassstrom und öffnen Sie den Unterdruck in der Steckdose. Waschen Sie das System mit destilliertem Wasser und trocknen Sie es heraus. </li></ol>

<ol>
	<li>Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+traveling+waves+in+the+Mammalian+cortex.">Control of traveling waves in the Mammalian cortex.</a> Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).</li><li>Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+propagation+of+4-AP-induced+epileptiform+activity+in+neonatal+intact+limbic+structures+in+vitro.">Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).</li><li>Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+spread+of+electrical+activity+in+rat+hippocampal+slices+by+voltage-sensitive+optical+probes.">Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes.</a> J Physiol. 333, 269-291 (1982).</li><li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus.">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li><li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation:+a+review+of+anatomical+data.">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).</li><li>Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+of+the+hippocampus+and+hippocampal-dependent+behaviors:+insights+from+interdisciplinary+studies+and+tips+for+new+investigators.">Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators.</a> Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+Epileptiform+Activity+Can+Be+Independent+of+Synaptic+Transmission,+Gap+Junctions,+or+Diffusion+and+Is+Consistent+with+Electrical+Field+Transmission.">Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission.</a> J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).</li><li>Kibler, A. B., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+wave+propagation+of+epileptiform+activity+in+the+planar+mouse+hippocampus+in+vitro.">Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro.</a> Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).</li><li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice.">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).</li><li>Wingenfeld, K., Wolf, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+,+memory,+the+hippocampus.">Stress , memory, the hippocampus.</a> Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).</li><li>Liu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+high-K+-induced+epileptiform+discharges+in+hippocampal+slice+and+the+effects+of+valproate.">Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate.</a> Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).</li><li>Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+planar+multielectrode+array+for+extracellular+recording:+application+to+hippocampal+acute+slice.">A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice.</a> J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).</li><li>Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+aspect+ratio+microelectrode+array+for+mapping+neural+activity+in+vitro.">A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro.</a> J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).</li><li>Schechter, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potassium+channel+blockers+4-aminopyridine+and+tetraethylammonium+increase+the+spontaneous+basal+release+of+[3H]5-hydroxytryptamine+in+rat+hippocampal+slices.">The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices.</a> J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).</li><li>Perreault, P., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-aminopyridine-induced+epileptiform+activity+and+a+GABA-mediated+long-lasting+depolarization+in+the+rat+hippocampus.">4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus.</a> J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).</li><li>Chesnut, T. J., Swann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptiform+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+immature+hippocampus.">Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus.</a> Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).</li><li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Microelectrode+Array+Technology+and+Neural+Recordings.">In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neuron+firing+and+local+field+potentials+in+the+in+vitro+4-aminopyridine+epilepsy+model.">Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model.</a> J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Entwicklung des ungefalteten Hippocampus Zubereitung, wobei die Längs- und Querachse des Hippocampus in Kombination mit einem durchdringenden Mikroelektrodenanordnung erhalten, stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Anatomie Verbindungen oder neuronale Ausbreitung im Hippocampus 7 zu untersuchen. Diese sich entfaltenden Verfahren ist auch für das Studium Hippocampus in erwachsenen Mäusen. Jüngste Studien mit diesem Präparat zeigten, daß das 4-AP-induzierte epileptiforme Aktivität kann mit ei...

Das Verständnis der neuronalen Leitungs oder eine Ausbreitung einer neuronalen Signale ist für die Bestimmung des Mechanismus der neuronalen Kommunikation sowohl in der normalen Funktion und pathologischen Zuständen im Gehirn 1-3. Der Hippocampus ist eine der am besten untersuchten Strukturen im Gehirn, da sie wesentliche Rolle spielt in verschiedenen Gehirnfunktionen wie Speicher und räumliche Verfolgung und ist in mehreren pathologischen Veränderungen, die dramatisch beeinflussen Verhalten sowie 1,6 beteiligt. Zwar weist der Hippocampus eine komplexe Organisation, können die verschiedenen Elemente der Struktur leicht identifiziert und im Schnittpräparat 4-6 aufgerufen werden. In der Querrichtung des Hippocampus wird die neuronale Aktivität bekannt, durch das tri-synaptischen Weg, Gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 aufweisen ausbreiten. Es wird angenommen, dass die synaptische Übertragung und axonalen Leitungs spielen eine wichtige Rolle für die Kommunikatiauf in dieser Querschluss 4,6. Jedoch Ausbreitungs neuronalen Signals findet in sowohl Quer- als auch Längsrichtungen 4,6. Dies impliziert, dass der Hippocampus nicht vollständig durch Verwendung Schnittpräparate, die die Beobachtung zu einer bestimmten Ausbreitungsrichtung 4 begrenzen sucht werden. Die Längs Scheibe wurde entwickelt, um die axonalen Bahnen entlang der Längsachse 5 zu untersuchen. Forscher haben Verhalten spezifischen gamma und theta Schwingungen vorwiegend entlang der Quer- und Längsachsen jeweils 6 beobachtet. Diese Verhaltensweisen wurden getrennt untersucht, aber gleichzeitigen Zugriff auf beide Richtungen ist von entscheidender Bedeutung, um dieses Verhalten zu verstehen. Auch bei der Entwicklung des intakten Hippocampus Herstellung ist es schwierig, die Ausbreitung über den gesamten Gewebes infolge gefalteten Struktur des Hippocampus 4 überwachen. Die entfaltete Hippocampus bietet Zugriff auf die verpackt Neuronenin einer Form einer flachen Zellschicht 7,8 zweidimensional. Durch Entfalten des Gyrus dentatus (DG) (Abbildung 1), der Hippocampus nimmt eine abgeflachte Form mit einer rechteckigen Konfiguration, in welcher sowohl Quer- und Längsverbindungen intakt mit der pyramidalen Zellschicht in einer zweidimensionalen Platte, die sowohl CA3 und CA1 angeordnet zu bleiben, wobei ein Flachstück Nervengewebe, die verwendet werden können, um neuronale Ausbreitungs untersuchen (Figur 2) 8. Neuronale Aktivität kann dann mit einzelnen Glaspipetten Mikroelektrodenarrays, Stimulationselektroden sowie spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSD) 3,7,8 überwacht werden. Zusätzlich können genetisch kodierte Spannungsanzeige aus transgenen Mäusen verwendet, um die Ausbreitungsmuster 9 verfolgen. Die flache Konfiguration des ungefalteten hippocampalen Netzwerk für optische Aufzeichnungsverfahren, sondern auch für eine Mikroelektrodenanordnung geeignet. Most der im Handel erhältlichen Arrays werden mit ebenen oder flachen Elektroden hergestellt und kann die neuronale Aktivität in beiden Gewebeschnitten und kultivierten Neuronen 10-12 aufzeichnen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) verringert sich jedoch, wenn die Signale von einem intakten Gewebe erhalten werden, da das Soma der Neuronen befinden tiefer in das Gewebe. Mikroelektrodenanordnungen mit hohen Aspektverhältnissen erforderlich sind, um das SNR zu verbessern. Zu diesem Zweck ist eine durchdringende Mikroelektroden-Anordnung (PMEA) in unserem Labor entwickelt worden sind, und bietet die Möglichkeit, direkt in die Gewebeprobe durch Einführen 64 Spitzen mit einem Durchmesser von 20 &amp; mgr; m und einer Höhe von 200 um in der aufgeklappten Hippocampus 7,13 . Das Mikroelektrodenanordnung eine höhere SNR im Vergleich zu der spannungsempfindlichen Farbstoff-Bildgebung und die SNR bleibt während eines Experiments 7,13 stabil. Die Kombination des ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA bietet einen neuen Weg zu investierenIgate das neuronale Ausbreitung über einer zweidimensionalen Ebene. Experimente mit dieser Technik bereits erbrachte wichtige Ergebnisse über die Mechanismen der neuronalen Signalausbreitung im Hippocampus, wobei die neuronale Aktivität kann unabhängig von synaptischen oder elektrischen Synapsen 7 verbreiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>desiccator jar</td>
			<td>LABRECYCLERS Inc.</td>
			<td>5410</td>
			<td>Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue recovery chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Operating&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17336B&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Medco Instruments No.:81995&#160;</td>
			<td>This scissors is used to&#160;&#160; decapitate the mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Miltex Goldman-Fox&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-517&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MILTEX INC&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; No.:5-SC-320</td>
			<td>This scissors is used to cut the skull of the mice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex 
			Hysterectomy Forceps</td>
			<td>Claflin Medical equipment</td>
			<td>CESS-722033-00001</td>
			<td>This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>tem #:&#160;105657&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Model #:&#160;90219</td>
			<td>The one with the smallest size in a normal paint brush package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fire polished glass help tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass tool with a metal wire loop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass solution dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was&#160; made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue anchor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated microelectrode array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made filter and amplifiers circuits for the array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition processor 3400a</td>
			<td>Microstar Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a complete data acquisition system with A/D converter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural activity propagation in an unfolded hippocampal preparation with a penetrating micro-electrode array

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines neuen in vitro Flach Hippocampus Zubereitung in Kombination mit einer mikrobearbeiteten Array auf neuronale Aktivität Karte im Hippocampus. Die Querschnittpräparat Hippocampus ist die häufigste Gewebeaufbereitung zu Hippocampus Elektrophysiologie zu studieren. Eine Längshippocampusschnitt wurde um Längsverbindungen im Hippocampus untersuchen entwickelt. Die intakten Hippocampus der Maus kann auch in vitro aufrechterhalten werden, weil seine Dicke gestattet ausreichende Sauerstoffdiffusion. Allerdings sind diese drei Zubereitungen, bieten direkten Zugriff auf neuronale Ausbreitung da ein Teil des Gewebes ist nicht vorhanden oder gefaltet. Die abgewickelte intakten Hippocampus bietet sowohl Quer- und Längsverbindungen in einer flachen Konfiguration für den direkten Zugang zu dem Gewebe, das volle Ausmaß der Signalausbreitung im Hippocampus in vitro analysiert. Um die neuronale Aktivität von t wirksam zu überwachener Zellschicht, eine maßgeschneiderte dringenden Mikroelektrodenarrays (PMEA) wurde hergestellt und in die entfaltete Hippocampus angewendet. Die PMEA mit 64 Elektroden von 200 um in der Höhe könnte neuronale Aktivität tief in Hippokampus der Maus aufzeichnen. Die einzigartige Kombination von einem ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA stellt ein neues in vitro-Werkzeug, um die Geschwindigkeit und die Richtung der Ausbreitung der Nervenaktivität in der zweidimensionalen CA1-CA3 Hippocampus Regionen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu untersuchen.

Die in den Figuren hier dargestellten Daten wurden im entfalteten Hippocampus Zubereitung mit 4-AP (100 uM) aCSF während der Inkubation des Gewebes in der Aufzeichnungskammer gegeben bei RT (25 ° C) aufgezeichnet. Normalerweise Aktivität beginnt innerhalb von 5 Minuten, aber in einigen Hippocampus-Gewebe von den älteren Tieren kann es länger dauern. Die mit der PMEA beobachtet 4-AP-induzierte neuronale Aktivität ist die gleiche wie zuvor berichtet 14,15. Da die Elektroden haben eine Höhe von 200 &amp; ...

Watch this Scientific Journal Video about Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array at JoVE.com

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Wir haben einen in vitro ungefalteten Hippocampus die CA1-CA3 Anordnung von Neuronen bewahrt entwickelt. In Kombination mit der durchdringenden Mikroelektrodenanordnung kann die neuronale Aktivität in sowohl der Längs- und Querrichtungen überwacht werden. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber hippocampalen Schnittpräparaten, wie die Ausbreitung im gesamten Hippocampus gleichzeitig aufgenommen werden.

Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

neural-activity-propagation-an-unfolded-hippocampal-preparation-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Aufrufe.  Case Western Reserve University.  Wir haben einen in vitro ungefalteten Hippocampus die CA1-CA3 Anordnung von Neuronen bewahrt entwickelt. In Kombination mit der durchdringenden Mikroelektrodenanordnung kann die neuronale Aktivität in sowohl der Längs- und Querrichtungen überwacht werden. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber hippocampalen Schnittpräparaten, wie die Ausbreitung im gesamten Hippocampus gleichzeitig aufgenommen werden. 

Serie: Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Wachstum und Differenzierung von adulten Hippocampus Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Die Erstellung eines Awake Mausklick für Aufnahme neuronalen Antworten und Einspeisen von Tracer

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.

Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...