Diese Arbeit wurde vom US Army Medical Research und Materiel Command gewähren # 05178001 und NS041069-06 aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke unterstützt. Wir danken Joel Vonnahme für hilfreiche Kommentare über das Protokoll.

1. AGS Neural Stem Cell and Media Preparation <ol><li> Adult Hippocampus Arctic Ziesel (AGS) neurale Stammzellen in einer Art und Weise isoliert zuvor beschriebenen 9 kann ab sofort im Handel als kryokonserviert Fläschchen erhältlich. Die Zellen werden über Nacht in isolierten Pakete mit Trockeneis, um sicherzustellen, dass die Zellen in einer kryokonservierten Zustand bleiben ausgeliefert. Zur Aufrechterhaltung Integrität, entpacken Sie die Zellen sofort nach Erhalt und an einem niedriger als -150 ° C oder in der Gasphase eines Flüssigstickstoff Dewar. </li><li> Bereiten agsNSC Basal Medium + 5% FBS durch Zugabe von 5 ml FBS (LS-1012) auf 95 mL agsNSC Basal Medium </li><li> Bereiten agsNSC Expansion Medium durch Zugabe von 500 ul B-27 Supplement (Invitrogen) zu 50 mL agsNSC Basal Medium. Teilen Sie den Rest der B27 in 1 ml Aliquots und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Warm 25 ml agsNSC Basal Medium + 5% FBS und 20 ml agsNSC Expansion Medium in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Coat-Kolben für die Erweiterung mit Poly-L-Ornithin verwendet <ol><li> Thaw der Poly-L-Ornithin (10 ug / mL) funktionierende Lösung. Bewahren Sie die Lösung zwischen 2-8 ° C für bis zu 1 Monat nach dem Auftauen. </li><li> 8 ml Poly-L-Ornithin funktionierende Lösung zu einem belüfteten T-75 Kolben und verteilen die Lösung über die gesamte Kultur Oberfläche des Kolbens. (Passen Umfang der Arbeitszeit für andere Kulturgefäße, die verwendet werden mit 0,5 mag -.. 1,0 ml Poly-L-Ornithin funktionierende Lösung pro 10 cm 2 Kulturfläche) </li><li> Inkubieren Kolben bei 37 ° C für mindestens 24 Stunden. (Verwenden eines Inkubators ohne Zusatz von CO 2 ist für die Inkubation von Poly-L-Ornithin beschichteten Kulturgefäße bevorzugt.) Beschichtete Kolben für gespeichert werden können bis zu zwei Wochen in den Brutkasten. </li><li> Vor dem Gebrauch absaugen Poly-L-Ornithin funktionierende Lösung aus dem Kolben und waschen zweimal mit steriler Gewebekultur-Wasser. Flüssigkeitsaufnahme, bis der Kolben ist fast trocken sein. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen aus dem Dewar und überprüfen Sie, ob Sie den Verschluss fest verschlossen ist. Halten Sie die Oberseite der Durchstechflasche Verlassen der unteren Hälfte der Flasche in einem 37 ° C Wasserbad für ca. 60-90 Sekunden oder bis Fläschchen fast vollständig aufgetaut ist, eine kleine Menge Eis sollte noch sichtbar sein. Um mögliche Kontaminationen, halten Sie den Verschluss aus dem Wasser. Nicht zu tauen, da dies kann die Zellen schädigen. </li><li> Besprühen Sie die Außenseite der Flasche mit 70% Ethanol oder Isopropanol, dann die Flasche in einem biologischen Sicherheitsschrank. Entfernen Sie den Deckel vorsichtig, um eine Verunreinigung oder Spritzer zu vermeiden. </li><li> Vorsichtig wieder die Zellen in der Ampulle durch Zugabe von 1 ml agsNSC Basal Medien + 5% FBS mit einer sterilen Pipette. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in 25 ml warmem agsNSC Basal Medium + 5% FBS in einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen Sie die Kryo-Röhrchen einmal mit verdünnten Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 xg für 6 Minuten. Für beste Ergebnisse, die Berechnung der Geschwindigkeit für jedes einzelne Zentrifuge Typ. </li><li> Während die Zellen Spinnen sind hinunter, 10 ml agsNSC Expansion Medium auf die trockene Poly-L-Ornithin beschichteten T-75 einwiegen und 40 ul rh FGF-basic (40ng/mL). Nach der Zentrifugation absaugen die überstehende Flüssigkeit darauf achten, nicht saugen das Pellet. Re-die Zellen in 10 ml agsNSC Expansion Medium. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in agsNSC Expansion Medium in den Medien in den T-75 Kolben. </li><li> Schütteln Sie die Kulturgefäß Seite an Seite gleichmäßig zu verteilen Zellen innerhalb des Gefäßes. </li><li> Ort ausgesät Kulturgefäß in ein 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. Die Zellen sollten in den Kolben legen und beginnen, um Prozesse innerhalb von zwei Stunden der Aussaat zu bilden. Wenn die Zellen schweben bleiben und ballte innerhalb des Mediums, dann Zentrifuge Zellen in 5% FBS und führen Sie die Schritte 1,8-1,10 mit frischem Medium und Kolben. </li></ol> 2. Ausbau der AgsNSC <ol><li> Zwei Tage (~ 48 Stunden) nach dem Auftauen und Aussäen der Zellen, sollte eine vollständige Medium Ersatz erfolgt mit 20 ml agsNSC Expansion Medium plus 40 ul spike von rh FGF-basic werden. </li><li> Spike-Kolben mit 40 ul rh FGF-basic am Tag nach der Impfung. Die Zellen werden bereit sein, trypsinize, wenn sie 75-80% Konfluenz von der dritten oder vierten Tag nach der Impfung erreicht haben. Die Kultivierung der undifferenzierten Stammzellen für länger als 4 Tage nach der Impfung wird nicht empfohlen, da längere Inkubationszeit wird es Zellen zu beginnen, zu Neuronen und Neuronen differenzieren kann durch Trypsinierung in Schritt 3 verletzt werden. Die rh FGF-basic kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einer Woche und noch pflegen Aktivität. Die rh FGF-basic kann auch durch einen zusätzlichen Frost / Tau bei -20 ° C zu gehen, wenn mehr Zeit benötigt wird. </li></ol> 3. Trypsinierung der Zellen <ol><li> agsNSC sollte 3 bis 4 Tage nach der Inokulation passagiert werden. Bereiten Sie eine Poly-L-Ornithin beschichteten Kolben zwischen 24 Uhr und eine Woche vor Passagierung wenn die agsNSC wieder ausgebaut werden soll. </li><li> Saugen Sie dasMedium aus dem Kulturgefäß. Fügen Sie 2,5 ml 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017), um das Schiff für jede 75 cm 2 Oberfläche. Vorsichtig, um alle Zellen zu gewährleisten sind mit dem Trypsin / EDTA beschichtet. Zellen, die normalerweise anfangen, von der Oberfläche lösen innerhalb von 60 Sekunden, abhängig von der Mündung der Zellen. Nicht über trypsinize, als damit die Zellen beschädigen. Leichtes Antippen des Kulturgefäß von mehreren Seiten ermutigen Distanz. </li><li> Sobald die Zellen ablösen, 10 ml agsNSC Basal Medium + 5% FBS in den Kolben. Vorsichtig schwenken, um alle Trypsin-Lösung gewährleistet wird neutralisiert. Unter aseptischen Labormethoden, Pipette die Zellen in ein steriles Zentrifugenröhrchen mit 10 ml agsNSC Basal Medium +5% FBS. Wiederholen Sie durch Waschen der Kolben wieder mit einem zusätzlichen 10 ml agsNSC Basal Medium + 5% FBS und verbinden sich mit der ersten Wäsche. </li><li> Centrifuge Zellen bei 150 xg für 6 Minuten, wie oben beschrieben. Nach der Zentrifugation sollte die Zellen bilden eine saubere lose Pellets. Saugen Sie neutralisiert Trypsin und Medium aus dem Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL (pro T-75 Kolben) der vorgewärmten agsNSC Basal Medium + 5% FBS durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 2X mit einer 10 ml Pipette. Führen Sie eine Zellzahl wie unten beschrieben. </li></ol> 4. Standard-Berechnung für Beschichtung von Zellen <ol><li> Unter aseptischen Bedingungen, wirbeln die Zellsuspension und Transfer 15 ul der Zellsuspension zu einem Reaktionsgefäß. Add 15 ul von 0,4% Trypanblau. Vorsichtig mischen und Last 10 ul Zellsuspension zu jedem der beiden Kammern in einem sauberen Hämazytometer wie eine helle Linie Zählkammer (Katalog # 1490: Hausser Scientific, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> Graf ein Minimum von 4 Quadranten auf der Hämazytometer. Die blauen Zellen, die positiv für Trypanblau sind tot und sollte nicht gezählt werden. Für eine genaue Zellzahl, sollte die optimale Anzahl von Zellen pro Quadrant 25-75 Zellen. </li><li> Nach Auszählung der Zellen, berechnen den Mittelwert der 4-Quadranten. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Zellzahl von 10.000 und mit dem Verdünnungsfaktor (2, wenn mit den empfohlenen Mengen), die Anzahl der Zellen pro ml zu bestimmen. Beachten Sie, dass, wenn Gesamtanteil Lebensfähigkeit weniger als 92% kann es zu einer Reihe von Ursachen haben. Ein Grund für die niedrige Rentabilität kann über Trypsinierung werden, vor der Neutralisation mit FBS Trypsin. Ein weiterer Grund kann sein, dass die Konzentration von Serum (FBS), um Trypsin zu niedrig ist und die Zellen weiterhin trypsiniert werden. Drittens kann die Zellen zu konfluenten haben, was Stammzellen zur Differenzierung durch Zell-Zell-Kontakt, was zu Verletzungen während Trypsinierung. Wenn diese Methode aufmerksam verfolgt eine Ausbeute von 3 oder mehr Verdoppelungen erwartet werden, was einer Bevölkerung von&gt; 4.000.000 Zellen aus einer anfänglichen Anzahl von ~ 500.000. </li></ol> 5. Inokulation von weiterer Expansion Flask <ol><li> Zur Ermittlung der Gesamtzahl der Zellen erforderlich, um ein Schiff zu impfen, multiplizieren Sie den gewünschten Aussaatdichte (6.600 Zellen pro cm 2 oder 500.000 Zellen pro T-75 Kolben) durch die Fläche (in cm 2) des Schiffes, geimpft werden. Wenn Impfung mehr als ein Schiff multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen pro Schiff durch die Gesamtzahl der Schiffe. Zur Ermittlung des Volumens (ml) der Zellsuspension benötigt, um jedes Schiff zu impfen, teilen Sie die Anzahl der Zellen erforderlich, um ein Schiff durch die Anzahl der lebensfähigen Zellen / ml in der Zellsuspension zu impfen. Wenn Impfung mehr als ein Schiff berechnet das Gesamtvolumen der Zellsuspension durch Multiplikation des Volumens für ein Schiff durch die Gesamtzahl von Schiffen geimpft werden mussten benötigt. </li><li> Zentrifugieren Sie die gewünschte Lautstärke von Zellen in agsNSC Basal Medium + 5% FBS, so dass eine lose Pellets. Normalerweise 500.000 Zellen sind auf ein Gesamtvolumen von 25 mL in agsNSC Basal Medium +5% FBS, wie vorher beschrieben hat. Flüssigkeitsaufnahme und Re-suspendieren die losen Pellets in 10 ml agsNSC Expansion Medium Diese zusätzliche Zentrifugationsschritt erforderlich FBS vor der Inokulation zu entfernen. Fügen Sie 10 ml vorgewärmten agsNSC Expansion Medium, um die T-75 Kolben. Fügen Sie die 10 ml des resuspendierten Zellsuspension auf die T-75 Kolben fügen Sie dann 40 ul rh FGF-basic in den Kolben. Bedenken Sie, dass die Trypsinierung und Impfung sollte nicht länger als 1,5 Stunden bei der Entscheidung die maximale Anzahl von Flaschen mit einem beliebigen Zeitpunkt zu arbeiten. Man sollte auch genügend Medien für komplette Medien ändert sich, wenn mit zahlreichen Flaschen. </li><li> Schütteln Sie die Flasche von einer Seite zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen und Ort der Kultur Schiffe in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, wie zuvor beschrieben. </li></ol> 6. Verdünnung der Zellen für die Beimpfung des Well Platten für Differenzierung <ol><li> Jeder Multi-Well-Format kann verwendet werden, aber Inokulation in BD Biocoat Poly-L-Lysin-beschichtete 96-Well-Platten described hier. Bestimmen Sie das Volumen der Zellsuspension für Ihr Experiment durch Multiplikation der Anzahl von Brunnen, die von 0,2 ml pro Vertiefung für eine 96-Multi-Well-Platte geimpft werden benötigt, und fügen Sie ca. 10% zu einem Verlust an Volumen während der Impfung zu decken. Berechnen Sie die Verdünnung auf eine Zelldichte von 75.000 Zellen / ml. Bestimmen Sie die Höhe der FBS auf die Differenzierung Medium hinzugefügt werden, um eine Endkonzentration von 2% FBS (Tabelle 1) zu erreichen. Mix der FBS und Differenzierung Medium. Vorsichtig die Zellen mit den berechneten Umfang der Differenzierung Medium mit FBS. (Anmerkung: Während des Laufs werden die Zellen in agsNSC Basal Medium + 5% FBS Während FBS Zellen schützt während der Zentrifugation und erleichtert die Zelladhäsion FBS hemmt differention Verdünnung FBS bis 2% wird die Haftung der Zellen an die Multi-Well-Oberfläche zu ermöglichen... Die 2% FBS wird dann weiter die Differenzierung fördern verdünnt. Insulin-Transferrin-Selen (ITS-e) ist auch in der Differenzierung Medium zur Differenzierung zu fördern enthalten. </li><li> In einem Biosicherheitswerkbank, verzichten 200 ul verdünnt Zellsuspension aus einer sterilen Combitip Reservoir in jede Vertiefung einer Poly-L-Lysin-beschichtete 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette und große Öffnung Tipps. Die Inkubation für 1,5-2 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. Nachdem die Zellen angeschlossen haben, nach etwa 90 bis 120 Minuten, entfernen Sie vorsichtig 50% (100 ul für 96-Well-Platten) des Mediums aus jedem Well mit großer Öffnung Pipettenspitzen. Vorsichtig wieder die Lautstärke mit warmem agsNSC Differenzierung Medium entfernt, erneut mit großer Öffnung Pipettenspitzen. (Verwendung von Standard-Öffnung Tipps können die Zellen schädigen). </li><li> Zwei Tage nach der Impfung (~ 48 Stunden), führen Sie einen 50% mittlere Veränderung mit agsNSC Differenzierung Mittlere und große Öffnung Pipettenspitzen. </li></ol> 7. Wartung von Neuronen <ol><li> Bereiten Neuronale Wartung Medium mit NeuraLife, Glutamin und B27 nach den Anweisungen. Neuronale Wartung Medium sollte wöchentlich vorbereitet werden. </li><li> Zwei Tage nach der letzten agsNSC Differenzierung Medium ändern, in der Regel Tag 4 nach der Inokulation, führen Sie einen 50% mittel-Ersatz Verwendung neuronaler Wartung Medium. </li><li> Weiter zu 50% mittel-Ersatz Verwendung neuronaler Wartung Medium alle 2 bis 3 Tage durchführen. Neuronale Prozesse sollten innerhalb weniger Tage zu ändern, um neuronale Wartung Medium erscheinen. Die Zellen sollten innerhalb von 3 Wochen nach der neuronalen Wartung Medium übertragen werden. Neuronen können unter Verwendung einer Reihe von im Handel erhältlichen neuronalen Marker werden. Astrozyten wird auch immer beachtet werden. </li><li> Kultur der Bevölkerung in der Regel Ausdruck einer mehr als 40%-Verhältnis von Neuronen insgesamt Zellzahl. Die Verwendung von Neuron Wartung andere Medien als NeuraLife können vorsehen, minderwertige Zellen, die nicht aussehen, morphologisch reif und kann nicht so lange in Kultur überleben. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Die Arctic Ziesel adulten neuralen Stammzellen wird auch weiterhin alle 24 Stunden für 3 bis 5 Tage für mindestens zwei Passagen verdoppeln, wenn bei 500.000-600.000 cells/75mm ausgesät. Diese Zellen werden leicht mit der Entfernung von basicFGF und B27 und das Vorhandensein von 1-2% FBS und 1% Insulin / Transferrin / Selen zu differenzieren, und wird TUJ1 (Covance) positive Neurone in 14-21 Tagen (siehe Abbildung 2) werden. Das Verhältnis von Neuronen insgesamt Zellen zwischen 40-60%, abhängig vom Alter der Kultur (Abbildung 3) Bereich. Neuronen können für Experimente von 12 Tagen nach der Aussaat über mindestens 21 Tage nach der Aussaat genutzt werden. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Mikrophotographie von AGS erwachsenen Hippocampus neuronale Stammzellen. Phase Mikrophotographie AGS erwachsenen Hippocampus neuronale Stammzellen folgenden 3 Tagen Wachstum in agsNSC Basalmedien in Poly-L-Ornithin beschichteten Kolben. Die Verdoppelung tritt etwa alle 24 Stunden. Foto bei 100-facher Vergrößerung. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Fluorescent Aufnahme von differenzierten AGS erwachsenen Hippocampus neuronale Stammzellen AGS neuralen Stammzellen wurden Differenzierung Medien für 4 Tage, dann in Neuralife für 17 Tage vor dem Fixieren erhalten unterzogen. Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd und Neuronen identifiziert mit TUJ1 Primärantikörper (Covance) und Alexa Fluor 568 Sekundärantikörper (grün) von Invitrogen fixiert. Hoechst-Farbstoff 33343 wurde hinzugefügt, um alle Kerne (blau) gefärbt. Zellzahl, Neuron-Nummer und Neuron-Verhältnis wurden anhand von Neuritenwachstum Software und die ArrayScan Instrument aus Cellomics. Dieses Foto entspricht etwa 57% Neuronen. 10-facher Vergrößerung <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Neuron Zahlen und Neuron Verhältnis Differenzierte AGS neuralen Stammzellen an dreiKultur im Alter AGS neuralen Stammzellen wurden Differenzierung Medien für 4 Tage ausgesetzt, dann erhalten in Neuralife für 12, 15 und 17 Tage vor der Fixierung. Die Zellen wurden fixiert und Neuronen mit TUJ1 Primärantikörper (Covance) identifiziert. Hoechst-Farbstoff zugegeben, um alle Keime für insgesamt Zellidentifizierung Fleck. Zellzahl, Neuron Anzahl und Prozent Neuron-Verhältnis wurden anhand von Neuritenwachstum Software und die ArrayScan Instrument aus Cellomics. Die Werte stellen Mittelwerte von 15 Wells pro Bedingung + SD. Tabelle 1. Beispielrechnungen in die Passage und Aussaat verwendet <ol><li> Mit 700.000 Zellen / ml Zellsuspension </li><li> Mit einer Zelldichte von 75.000 Zellen / ml bzw. 15.000 Zellen pro Vertiefung von 0,2 ml Volumen in jede Vertiefung. </li><li> Impfen 96 Vertiefungen mit 0,2 ml pro Well = 19,2 ml oder gewünschte Endvolumen 21 mL. </li><li> (Endkonzentration x Endvolumen) ÷ anfängliche Konzentration = Initial Volume (21 mL x 75.000 Zellen / ml) ÷ 700.000 = 2,25 mL </li><li> Volumen der FBS in Zellsuspension. 2,25 ml = 2,25 ml x 0,05 = 0,1125 mL </li><li> Volumen der FBS benötigt in 21 mL = 21 mL x 0,02 = 0,42 mL </li><li> Volumen der FBS auf Differenzierung Medium hinzufügen = 0,42 mL - 0,1125 ml = 0,3075 mL </li><li> Volumen der Differenzierung Medium = 21 ml - 2,25 ml Zellsuspension - 0,3075 mL 5% FBS = 18,44 mL. </li><li> Kombinieren 18,44 ml Differenzierungsmedium mit 0,308 mL FBS und fügen 2,25 ml Zellsuspension. </li></ol>

<ol>
	<li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+avoidance+in+a+mammal:+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator.">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li><li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia.">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li><li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel.">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li><li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel.">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li><li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arctic+ground+squirrel+(Spermophilus+parryii)+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1/2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss.">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li><li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+progenitor+cells:+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain.">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li><li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells.">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons.">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li><li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells.">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li></ol>

JA Kelleher-Andersson ist der Gründer der Neuronascent und ist der Erfinder auf die Arktis Ziesel Patentanmeldungen. Neuronascent erhält Lizenzgebühren auf den Verkauf von AGS Medien-und Stammzellen. RC McGee wird von Lifeline, Inc., die die Medien und die AGS neuralen Stammzellen verteilt eingesetzt werden.

AGS adulten neuralen Stammzellen sind robust und können für eine Vielzahl von Passagen macht sie eine ausgezeichnete Quelle von neuralen Stammzellen für das Studium der grundlegenden neuronalen Stammzell-Eigenschaften erweitert werden. Die Erweiterung liegt bei etwa einer Verdoppelung alle 24 Stunden, aber diese Zellen müssen vor dem Erreichen der Konfluenz passagiert werden, weil der Kontakt zwischen den Zellen wird die Differenzierung zu Astrozyten zu begünstigen. Kontakt-vermittelte Differenzierung wird dazu bei...

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>agsNSC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>FC-0004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>agsNSC Expansion kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0008</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>agsNSC differentiation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0009</td>
<td>Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuraLife maintenance media kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline</td>
<td>LL-0012</td>
<td>Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (<a href="http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com</a>)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td><a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDBioscience</td>
<td>356516</td>
<td><a href="http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-707-141</td>
<td>Avoids neuronal cell damage when pippetting. <a href="http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

growth and differentiation of adult hippocampal arctic ground squirrel neural stem cells

Arctic Erdhörnchen (Urocitellus parryii, AGS) sind einzigartig in ihrer Fähigkeit, mit einer Körpertemperatur in der Nähe oder unter dem Gefrierpunkt 1 überwintern. Diese Tiere auch gegen ischämischen Schädigung des Gehirns in vivo 2,3 und Sauerstoff-Glukose-Entzug in vitro 4,5. Diese einzigartigen Eigenschaften gaben den Anstoß zu AGS Neuronen zu isolieren, um inhärente neuronalen Eigenschaften, die für die Kapazität des AGS Neuronen zu Verletzungen und zum Zelltod durch Ischämie verursacht und extrem kalten Temperaturen widerstehen Konto konnte zu untersuchen. Identifizieren Proteine ​​oder Gen-Targets, die für die besonderen Eigenschaften dieser Zellen ermöglichen könnte, in der Entdeckung von wirksamen Therapien für eine Reihe von ischämischen Indikationen und für das Studium der Kältetoleranz Hilfe. Adult AGS Hippocampus enthält neurale Stammzellen, die sich zu vermehren weiter und ermöglicht den problemlosen Ausbau dieser Stammzellen in Kultur. Wir beschreiben hier Methoden, mit denen Forscher die Stammzellen und differenzierten Neuronen für eine beliebige Anzahl von Zwecken nutzen kann. Durch die enge folgenden Schritte der AGS neuralen Stammzellen können durch zwei Passagen oder mehr erweitert werden und dann differenziert, um eine Kultur mit hohem TUJ1-positive Neuronen (~ 50%) ohne den Einsatz von giftigen Chemikalien, die Zahl der sich teilenden Zellen zu minimieren. Ischämie induziert Neurogenese 6 und Neurogenese, die über MEK / ERK-und PI3K/Akt Überleben Signalwege trägt zur Ischämie Widerstand in vivo 7 und in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., In Vorbereitung) verläuft. Die weitere Charakterisierung dieser einzigartigen neuronalen Zellen können an vielen Fronten voraus, mit einigen oder allen dieser Methoden.

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Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Neurale Stammzellen wurden aus dem Hippocampus von erwachsenen, nicht überwinternde einjährige Arctic Erdhörnchen (AGS) aufgestellt. Diese neuralen Stammzellen können durch zahlreiche Passagen erweitert werden, differenziert und gepflegt wie ein fast 50:50 Neuron zu Gliazellen Kultur.

Wachstum und Differenzierung von adulten Hippocampus Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

growth-differentiation-adult-hippocampal-arctic-ground-squirrel

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Aufrufe.  University of Alaska at Fairbanks. Neurale Stammzellen wurden aus dem Hippocampus von erwachsenen, nicht überwinternde einjährige Arctic Erdhörnchen (AGS) aufgestellt. Diese neuralen Stammzellen können durch zahlreiche Passagen erweitert werden, differenziert und gepflegt wie ein fast 50:50 Neuron zu Gliazellen Kultur.

Serie: Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord injury (SCI), and can form functional relays to re-connect spinal cord segments above and below a lesion. Previous studies grafting neural stem cells have been limited by incomplete graft survival within the spinal cord lesion cavity. Further, tracking of graft cell survival, differentiation, and process extension had not been optimized. Finally, in previous studies, cultured rat NSCs were typically reported to differentiate into glia when grafted to the injured spinal cord, rather than neurons, unless fate was driven to a specific cell type. To address these issues, we developed new methods to improve the survival, integration and differentiation of NSCs to sites of even severe SCI. NSCs were freshly isolated from embryonic day 14 spinal cord (E14) from a stable transgenic Fischer 344 rat line expressing green fluorescent protein (GFP) and were embedded into a fibrin matrix containing growth factors; this formulation aimed to retain grafted cells in the lesion cavity and support cell survival. NSCs in the fibrin/growth factor cocktail were implanted two weeks after thoracic level-3 (T3) complete spinal cord transections, thereby avoiding peak periods of inflammation. Resulting grafts completely filled the lesion cavity and differentiated into both neurons, which extended axons into the host spinal cord over remarkably long distances, and glia. Grafts of cultured human NSCs expressing GFP resulted in similar findings. Thus, methods are defined for improving neural stem cell grafting, survival and analysis of in vivo findings.

Fibrin matrices containing growth factors were used to retain grafted neural stem cells into sites of complete spinal cord transection. Grafted cells completely filled the lesion cavity and differentiated into multiple neural cell types, including neurons that extended axons into host spinal cord over long distances.

Förderung von Überleben und die Differenzierung neuraler Stammzellen mit Fibrin und Growth Factor Cocktails nach schweren Rückenmarksverletzungen

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...