Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, rotes Fettgewebe, getrocknete mesenchymale Stammzellen zu isolieren und zu charakterisieren und sie mit einfachen Methoden in Richtung insulinproduzierender Zellen zu differenzieren. Mesenchymale Stammzellen haben die Wege in der Genetik gefunden. Sie können aus verschiedenen Quellen wie Knochenmark, Fettgewebe und perinatalem Gewebe isoliert werden.
Sie akzeptieren ausgezeichnete kulturelle Eigenschaften. Sie sind multipotent und können potenziell verschiedene Krankheiten behandeln. Fettgewebe bietet eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen.
Diese Fett-MSCs können leicht aus Lipo-Aspiraten mit hoher Ausbeute im Vergleich zu anderen Quellen wie Knochenmark isoliert werden. Und sie können eine gute Quelle sowohl für autologe als auch für allogene Transplantationen sein. In diesem Video stellen wir ein einfaches Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen aus Fett von Ratten-Nebenhoden vor.
Dieses Verfahren ist eine einfache, hocheffiziente Methode zur Isolierung. Nach der Isolierung werden wir die Differenzierung dieser adipösen mesenchymalen Stammzellen in insulinproduzierende Zellen mit einem einfachen, relativ kurzen Protokoll ertragen. Wir beginnen mit der Isolierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen durch kollagene Verdauung von Nebenhodenfett, um eine stärkere vaskuläre Fraktion zu erhalten.
Dann werden mesenchymale Stammzellen durch ihre plastische Adhärenz sowie die Expression von CD-Markern und die Differenzierung in mehrere mesodermale Linien charakterisiert. Anästhisieren Sie das Tier und euthanasieren Sie es dann mit Zervixdislokation. Sprühen Sie den ganzen Körper mit 70% Ethanol und beginnen Sie mit der Exzision der Haut und der Muskeln im unteren Teil des Bauches.
Dann legen Sie die Hoden mit dem Nebenhodenfett frei. Schneiden Sie das Nebenhodenfett vorsichtig ab. Achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht mit den Fetten zu schneiden.
Schneiden Sie in einer Biosicherheitskabine das Fettgewebe mit Pinzette und Skalpell in kleine Stücke. Das Fettgewebe in ein Zentrifugenröhrchen mit 10 Milliliter sterilem PBS überführen. Beginnen Sie mit dem Waschen, indem Sie das Falcon-Rohr 45 Sekunden lang kippen.
Lassen Sie dann die Röhre fünf Minuten stehen, um sie in zwei Schichten zu trennen. Entfernen Sie das infranierte PBS mit einer 10-Milliliter-Spritze. Wiederholen Sie diese Waschschritte vier- bis fünfmal, bis PBS klar ist.
Nach dem Waschen das Fettgewebe in kollagener Lösung wieder suspendieren und dann im Schüttelwasserbad inkubieren, bis das Gewebe fast homogen ist. Danach wirbeln Sie die kollagene Mischung des Gewebes für 15 Sekunden ein und zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation haben Sie drei Schichten.
Verwerfen Sie vorsichtig den Überstand über der stromalen Gefäßfraktion. Zuerst die Ölschicht oben vorsichtig entsorgen, gefolgt von der Echoschicht, ohne das stromale Gefäßfraktionspellet zu stören. Die Stromal-Gefäßfraktion wird in steriler BSA wieder suspendiert und fünf Minuten lang rezentrifugiert.
Gesamte Zentrifugation, legen Sie komplette DMEM F-12-Medien in einen 25 Zentimeter großen quadratischen Kolben. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das stromale Gefäßpellet in vollständigen DMEM F-12-Medien wieder suspendieren. Und Transfer in die Kulturflasche.
In 37 Grad 5% Kohlendioxid-Inkubator legen. Entfernen Sie am nächsten Tag nicht angehängte Zellen und ersetzen Sie die Medien durch frische Medien. Ab dem nächsten Tag der Isolation werden die fibroblastenähnlichen Zellen erscheinen.
Dann werden sie im Laufe der Zeit allmählich an Anzahl und Größe zunehmen. Durch das Passieren werden die Zellen homogener. Diese Zellen weisen alle Charakterisierungskriterien für mesenchymale Stammzellen auf.
Diese Zellen wurden mit Hilfe dieses einfachen Protokolls, das Nicotinamid-Beta-Mercaptoethanol und Exendin-4 enthält, in Richtung insulinproduzierender Zellen differenziert. Während der Differenzierungsschritte beginnen die Zellen, ihre fibroblastische Form zu verlieren und ich denke, clusterartige Morphologie. Bei Verwendung von insulinproduzierenden Zellen zeigen sie eine positive karminrote Disithon-Färbung, dann exprimieren verwendete insulinproduzierende Zellen verschiedene Beta-Zellmarker wie Pdx-1, mafA und Insulin.
Darüber hinaus sezernieren induzierte insulinproduzierende Zellen höhere Insulinspiegel im Überstand, wenn sie mit einer höheren Glukosekonzentration konfrontiert werden. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen zur Verfügung gestellt. Wir stellen hier auch ein relativ kurzes, einfaches und effizientes Protokoll zur Differenzierung von adipösen mesenchymalen Stammzellen in insulinproduzierende Zellen zur Verfügung.
Dies bietet Forschern ein Einfallstor, um in das Gebiet der mesenchymalen Stammzellen einzusteigen und ihre Differenzierung in insulinproduzierende Zellen zu untersuchen.
