Das Hauptziel dieses Experiments ist es, ein laparoskopisches Embryotransferverfahren bei Kaninchen als Modell zu beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass diese arbeitet, um Embryonen mit einer einfachen, minimal-invasiven Technik zu übertragen. Darüber hinaus funktioniert das hier beschriebene effektive Embryo-Kryokonservierungsprotokoll auch für die langfristige Lagerung der Kaninchenembryonen und bietet zeitflexible logistische Kapazitäten und die Fähigkeit, die Probe zu transportieren.
Wie wir wissen, werden unterstützte Reproduktionstechnologien kontinuierlich bewertet, um die Ergebnisse zu verbessern und die damit verbundenen Risiken zu verringern. Daher kann Kaninchen mit beiden Techniken als ideales Tiermodell der menschlichen Fortpflanzung verwendet werden, um wichtige Fragen in diesem Bereich zu beantworten, wie die Auswirkungen der In-vitro-Embryomanipulation auf Nachkommen. Die visuelle Demonstration dieser Dinge ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte des Embryotransfers schwer zu erlernen sind, da sie mit großer Präzision durchgeführt werden müssen, um den Erfolg der Technik sicherzustellen.
Für die embryonale Vitrifikation tauchen Sie die Embryonen zwei Minuten lang in eine Gleichgewichtslösung ein, gefolgt von einer einminütigen Inkubation in der Verglasungslösung. Am Ende der Inkubation die Embryonen in einen 125 Mikroliter-Mikroliter-Ministrohwagen aus Kunststoff laden und das geschlossene Ende des Ministrohs mit einem entsprechenden Milliliter-Mikrospender koppeln. Aspirieren Basismedium bis zu einem Drittel der Strohlänge, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
Als nächstes verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Embryonen in 40 Mikroliter Glasverglasungslösung zu saugen, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase und genügend Basismedium, um die erste flüssige Fraktion bis zur Baumwolle des Mini-Strohs zu bewegen. Dann schließen Sie das geöffnete Ende des Mini-Strohs mit einem Strohstopfen, tauchen Sie den Mini-Stroh direkt in flüssigen Stickstoff, um die Verglasung zu erreichen, und lagern Sie den Mini-Strohhalm in einem flüssigen Stickstoff-Dewar. Um die Embryonen für einen Transfer aufzutauen, legen Sie den Mini-Strohhalm horizontal 10 Zentimeter aus dem flüssigen Stickstoffdampf für 20 bis 30 Sekunden.
Wenn der Kristallisationsprozess im Mini-Stroh beginnt, tauchen Sie den Mini-Strohhalm 10 bis 15 Sekunden lang in das 25 Grad Celsius Wasserbad ein. Entfernen Sie sofort die Mini-Stroh- und Baumwollstecker und verwenden Sie einen gekoppelten Mikrospender, um den Mini-Strohinhalt in eine Platte mit 25 Grad Celsius Basismedium zu vertreiben, ergänzt mit 0,33 Molaren-Saccharoselösung, in der Embryonen fünf Minuten bleiben müssen. Dann übertragen Sie die Embryonen auf eine Platte mit frischem Basismedium für weitere fünf Minuten Inkubation.
Beobachten Sie schon viele Tage zuvor wie das Alter der zu übertragenden Embryonen die Turgidität und Farbe der Vulvas der verfügbaren geschlechtsreifen 4,5 Monate alten weiblichen Kaninchen und induzieren Sie den Eisprung bei den empfänglichen Tieren mit einer einzigen intramuskulären Injektion eines Mikrogramms Buserelinacetat unabhängig vom Körpergewicht. Am Tag der Übertragung die frischen oder aufgetauten Embryonen in einem 37 Grad Celsius Basismedium unter einem Stereomikroskop abspülen und einen entsprechend konfigurierten 17-Spur-Epiduralkatheter an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigen. Einen Zentimeter Basismedium in den Katheter aspirieren, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
Dann aspirieren fünf bis sieben Embryonen und 10 Mikroliter Basismedium, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase und einem letzten Zentimeter Basismedium. Sobald die Embryonen geladen sind, legen Sie das anästhesierte Empfängerkaninchen in einen Käfig auf einer wärmenden Stufe und tragen Salbe auf die Augen des Tieres auf. Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Pedalreflex, rasieren Sie das Fell aus dem ventralen Bauch, reinigen Sie den chirurgischen Bereich mit Chlorhexidin Gluconat Seife, und entfernen Sie alle verbleibenden Haare.
Bedecken Sie den Bereich mit einem sterilen Vorhang mit einem Loch für den chirurgischen Bereich, und legen Sie einen endoskopischen Trokar fünf Zentimeter in die Bauchhöhle, zwei Zentimeter kaudal zum zyphoiden Prozess, und verwenden Sie einen druckregulierenden mechanischen Insufflator, um die Peritonealhöhle aufzublasen. Setzen Sie die Endoskopkamera durch den endoskopischen Trokar ein, und setzen Sie die 17-Spur-Epiduralnadel in den Leistenbereich ein, zwei bis drei Zentimeter vom Infundibulum entfernt. Setzen Sie den geladenen Katheter durch die Epiduralnadel in den Bauch ein und legen Sie ein bis zwei Zentimeter des Epiduralkatheters durch das Infundibulum in die Ampulla ein.
Drücken Sie den Katheterkolben vorsichtig, um die Embryonen in das Eileiterzusettier freizusetzen. Beide Luftblasen müssen aus dem Katheter austreten. Entfernen Sie den Katheter kurz nach der Freisetzung der Embryonen, und aspirieren und lassen Sie das verbleibende Medium, um das Fehlen der Embryonen zu bestätigen.
Nach Bestätigung einer erfolgreichen Übertragung der Embryonen entfernen Sie die Epiduralnadel und die Endoskopkamera und geben Sie das abdominale Kohlendioxid durch den endoskopischen Trokar frei. Reinigen Sie den Tromonschnitt mit Chlorhexidinlösung und schließen Sie die Wunde mit einem mikronisierten Aluminium und einem Kunststoffverband. Behandeln Sie das Tier dann mit den entsprechenden Antibiotika und Schmerzmitteln und überwachen Sie das Tier bis zur vollständigen Genesung.
Minimalinvasive laparoskopische Embryoübertragung enden das Kaninchen zu den besten Tiermodellen für Reproduktionsstudien, mit einem hohen Prozentsatz an übertragenen frischen Embryonen, was zu einem Welpen führt. Insbesondere werden höhere Werte erreicht, wenn der Frischembryontransfer mit Embryonen im frühen oder kompakten Morulaestadium durchgeführt wird. Ähnliche Ergebnisse werden nach dem frühen und verdichteten verglasten Kaninchenmorulatransfer beobachtet, insbesondere bei kompakten Morulan, die die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit dieser Technik für die Übertragung frischer verglaster Embryonen bei Kaninchen bestätigen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie bedingte Assistive Reproductive Technologies durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Zugabe von Dichten später im Leben eine schmerzstillende Wirkung haben kann. Nach der jüngsten Entwicklung ebnet diese Technik wissenschaftlern auf dem Gebiet der Fortpflanzung den Weg, diesen Effekt beim Menschen auf der Grundlage der engen phylogenetischen Distanz zwischen Kaninchen und Menschen zu erforschen. So kann diese Technik Ergebnisse liefern, die leicht auf die klinische Medizin des Menschen übertragen werden können, sowie auf andere Säugetierarten.
Vergessen Sie nicht, dass unsere Methode einige hygienische und wirtschaftliche Vorteile bietet, die dem Konzept von drei R von Tierschutz, Ersatz, Reduktion und Verfeinerung entsprechen, indem sie das Ziel verfolgt, die menschliche Behandlung von Versuchstieren zu verbessern.
