Diese Arbeit wird von einer Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) Discovery-Grant-# 40352, Campus Alberta für Innovation Program Chair, Alberta Alzheimer-Forschungsprogramm zu MHM und NSERC CREATE in BIF Promotionsstipendium und Abchasisches Forschungsinstitut postgraduale Gemeinschaft zu MK unterstützt wurde. Wir danken Pu Min Wang für die Entwicklung dieses Protokolls und für die chirurgische Ausbildung und Behroo Mirza Agha und Di Shao für Haltung.

<html> Das folgende Protokoll folgt der University of Lethbridge Animal Care Committee (ACC) Richtlinien und wird in Übereinstimmung mit den Standards des Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Für eine längere Studienzeiten, Autoklaven alle chirurgische Versorgung geöffnet und dafür sorgen, dass die Sterilität während der Operation aufrechterhalten wird. Wenn mehrere Operationen erforderlich sind, Autoklaven zwischen Operationen. </li><li> Stellen Sie sicher, es gibt viele Gehirnpuffer auf der Hand (mindestens 50 ml) ist. Die Lösung wird aus 134 mM Natriumchlorid besteht, 5,4 mM Kalium, 1 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 1,8 mM Calciumchlorid-dihydrat und 5 mM HEPES-Natrium, pH-neutral auf 7,4 mit 5 M Chlorwasserstoff. </li><li> Platzieren Sie die Maus in eine Ansaugkammer und anästhesieren mit 3 bis 4% Isofluran. Folgen Sie mit 1,0-2,0% Isofluran für die Wartung während der Operation. weiter reduzieren zu so niedrig wie 0,4 bis 0,8% während des AbbildensS = &quot;xref&quot;&gt; 5 , 13 , 14 , 15 , sofern eine ordnungsgemäße Anästhesie aufrechterhalten wird. Diese niedrigen Anästhesieanforderungen erfordern eine wachsame und häufige Überwachung der Maus (etwa alle 5 min), um sicherzustellen, dass sie für schmerzhafte Reize unflexibel bleibt. HINWEIS: Die Dehydratation kann aufgrund des hohen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnisses der Maus problematisch werden und durch eine verlängerte Verwendung von Isofluran verschärft werden. <ol><li> Verwenden Sie subkutane Injektionen von Kochsalzlösung, 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht, alle 1 - 2 h. Wenn adäquat hydratisiert wird, wird die Maus einmal alle 1 - 2 h urinieren. </li></ol></li><li> Die Maus sorgfältig überwachen, um eine konsistente Anästhesie während der Operation und Imaging zu gewährleisten. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt und achten Sie darauf, dass sie niemals das Bewusstsein wiedererlangt. </li><li> Übertragen Sie die anästhesierte Maus auf die Kopfhalterung und legen Sie sie auf einen thermo-regulierenden Heizkissen auf 37 ° C. Sichern Sie den oberen Teeth in einem Zahnhalter. </li><li> Drehen , um die Kopf der Maus nach links in etwa 30 ° die rechte seitliche Seite des Kopfes zu , und die Maus des Kopf mit dem stumpfen Ende der Ohrstäbe (1A) zu sichern. </li><li> Bewerben Augensalbe Hornhaut Austrocknen zu verhindern. </li><li> Zu reduzieren, Hirnödem, intramuskulär Dexamethason (4 mg / kg) injizieren. </li><li> Wischen, die Haut über das Operationsgebiet mit Baumwolle in 4% Chlorhexidin getaucht Tupfer (3-mal) und 70% Ethanol (3 mal). Verwenden Sie nur einmal pro Wattestäbchen. </li><li> Don chirurgische Handschuhe und deckt das Tier mit klebender Kunststofffolie. Für örtliche Betäubung durch Einspritzen von Lidocain (8 - 10 mg / kg; 2% Epinephrin) subkutan über die Kraniotomiestelle. Warte 3 bis 5 min für das Medikament in das Gewebe absorbiert werden. </li></ol> 2. Entfernen der Haut und einfahren Muskel aus dem Schädel <ol><li> Führen Sie fast alle diese Verfahren während der Schädel unter einem BetrachtungsBinokular (zB 0,7 - 4,5 - fachen Leistung, abhängig von der Situation). </li><li> Heben Sie die Haut 1 mm von der Mittellinie nach links (direkt hinter dem Ohr) mit einer Pinzette und macht einen kleinen horizontalen Schnitt mit chirurgischen Scheren. </li><li> Machen Sie einen 5 - 6 mm Seitenschnitt auf dem rechten Ohr, und dann in Richtung des rostralen Ende des Kopfes geschnitten. </li><li> Bei dem Anfangspunkt Inzision, die Scheren einzusetzen und zu 10 mm rostral schneiden. </li><li> Schneiden Sie die Haut um das rechte Ohr und in der Nähe des rechten Auges auf die rechte Seite des Schädels und der Schläfenmuskel zu belichten. Sicherstellen, dass der breiteste Teil der belichteten Fläche mindestens 7 mm beträgt. Schneiden Sie die Haut weiter, wenn der OP-Bereich erweitert werden muss. </li><li> Befestigen Sie die Haut um den Schnitt durch ein paar Tropfen Butylcyanoacrylat Klebstoff zwischen dem Schädel und der Haut. Sicherstellen, dass das Gewebe wurde mit Baumwollspitze Applikatoren oder gerollte Gewebe zu erhöhen, um die Wirksamkeit des Klebstoffes zuvor getrocknet. </li><li> Mit einem Wattestäbchen, reiben Sie die Oberflächedes Schädels in einer kreisförmigen Bewegung des Periosts aus dem Schädel zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass keiner bleibt durch den Schädel vollständig trocknet. </li><li> Mit Feder Schere und Pinzette, trennt den Schläfenmuskel aus dem Schädel; geschnitten und einfahren , bis der Muskel seitlich Schuppenbein (1C) erreicht. Größte Vorsicht walten lassen nicht die oberflächliche zeitliche Vene zu beschädigen, die in der Nähe des Auges entlang der Ebene des Squamosum Knochen läuft, sonst Blutungen auftreten können. </li><li> Kontrolle Blutungen mit Gel-Schaum in Gehirn Puffer vorgetränkt. Für ernsthaften hemorrhaging einen Wärme Ausbrenner verwenden. Drop Butylcyanoacrylat Leim auf die Blutungsstellen nach der Behandlung mit dem Wärme Ausbrenner. Sicherstellen, dass der Bereich getrocknet wird zuvor durch Baumwollspitze Applikatoren oder gerollte Gewebe mit der Wirksamkeit des Klebers zu erhöhen. </li></ol> 3. Craniotomy HINWEIS: Der Chirurg muss während der Entfernung des Schädels fleißig bleiben unddura, um unnötige Komplikationen zu vermeiden. Schritte zur Fehlerbehebung sind enthalten sollten Komplikationen auftreten. <ol><li> Mark der Ort des Bregma entweder mit einem feinen Spitze Marker oder geschnitten , um eine kleine dreieckiges Stück Band und zeigt eine Ecke am Bregma (2A) , um die darunterliegenden Hirnregionen zu orientieren. </li><li> Vor der Kopfplatte Befestigung gewährleistet der Schädel vollständig trocken ist. Der Schädel wird schnell Luft trocknen nach dem Auftragen des Gels Schaum in brain Puffer getränkt, wenn mehr Trocknen benötigt wird, Baumwollspitze Tupfer verwenden. Dieser Schritt ist entscheidend für die Kopfplatte Fixation (1B). HINWEIS: Wenn es Periost links auf dem Schädel, oder wenn der Schädel vor dem Verkleben auf der Kopfplatte nicht trocken ist, wird es wahrscheinlich abnehmen. Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie die Kopfplatte und von vorn beginnen. Blutungen während dieses Prozesses auftreten können; erlaubt ein paar Minuten, es gerinnen zu lassen, und dann sanft entfernen. Dieser Prozess wird empfohlen, nicht mehr als zweimal wiederholt werden. </li> &lt;li&gt; Ethylcyanoacrylat Kleber um den unteren Rand der Kopfplatte 16, Übernehmen und die Kopfplatte über den Kraniotomie Bereich (1D &amp; 2A) kleben. </li><li> Füllen Sie den Öffnungsraum zwischen dem Schädel und Kopfplatte mit Zahnzement ausgesetzt nur der Kraniotomie Bereich zu verlassen. Warten , bis der Zahnzement zu trocknen und zu härten, typischerweise von 5 bis 10 min (2B). <ol><li> Sobald der Zement gesetzt ist, kurz die gut mit Gehirn-Puffer füllen und ermöglichen 3 einweichen - 5 min. Verwenden eines aufgerollten Gewebe Gehirn Puffer zu entfernen , bevor das Bohren (2C). </li></ol></li><li> Skizzieren Sie den OP-Bereich durch leicht auf die Oberfläche des Schädels mit einem Zahnbohrer Scoring. Verwenden eines pneumatischen Bohrers (auf maximal 20 psi), mit einem FG ¼ Grates und mit einer variablen Geschwindigkeit Fußpedal gesteuert. </li><li> Sanft die Bohrer verfolgen entlang des ursprünglichen Scoring es zu vertiefen, eHat der Bohrer nsuring nicht durch den Schädel in das Gehirn (2D) durchdringen. Wechseln sich alle paar Minuten zwischen Bohr- und Abtupfen der Schädeloberfläche mit angefeuchteten gewalzten Geweben. Dies wird Erhitzen und Trocknen des Schädels von mechanischer Reibung und längerer Exposition reduzieren. HINWEIS: Der Schädel wird schnell Luft trocknen nach dem Auftragen des nassen Gels Schaum. Wenn mehr Trocknung erforderlich ist, verwenden Wattestäbchen Abstriche. Achtung: Der Schädel ist ungleichmäßig dick. Zum Beispiel ist der parietale zeitliche Grat der dickste Bereich, während Schädel Regionen in der Nähe der Mittellinie und Squamosum Sehenswürdigkeiten relativ dünn sind. </li><li> Während des Bohrens periodisch überprüfen, um mit einer Pinzette durch leichten Druck auf sich den Schädels Knick oder den nicht bewegenden Bohrer. Wenn der Knochen sich zu wölben beginnt, zu stoppen Bohren und das gesamte Fenster in brain Puffer eintauchen. HINWEIS: Wenn Blut aus einer Gegend rast, kann es lassen vermuten, dass die Dura beschädigt wurde. Wenn dies der Fall ist, setzen Sie ein semi-Nass-Gel-Schaum über den Bereich und versuchen, das Blut aufzusaugen, während sanft Druck auf das Gel-Schaum mit einem Wattestäbchen Tupfer Anwendung. </li><li> Warten für mindestens 5 min vor dem Schädel Entfernen die Knochen zu erweichen und die Möglichkeit der Dura zu reduzieren, um die Knochen haftet, so dass der Schädelentfernungsprozess einfacher. </li><li> Führen Sie den Schädelentfernungsprozess, während der Schädel im Gehirn Puffer eingetaucht ist. HINWEIS: Wenn ein Teil des Schädels hartnäckig haften bleibt, kann ein # 11 Skalpell verwendet wird sanft den Schädel punkten. Größte Vorsicht walten lassen die Klinge durch den Schädel nicht durchstoßen und in das Gehirn. </li><li> Ausgehend von der vorderen Kante, hebel sanft den losen Schädel von der Dura mit einer Pinzette. HINWEIS: Wenn eine geringe Menge der Blutung während des Schädels Entfernungsprozesses auftritt, entfernen Sie den Puffer mit einer Transferpipette oder einer Spritze und dann mit neuen Puffer ersetzen. </li><li> Sobald die Knochen lose sind und „schwimmend“ auf der Dura, fest greift mit einer Pinzette die Knochen und heben Sie die Knochen ausdie Dura. Sicherstellen, dass die Knochen nicht in das Gehirn eindringt. </li><li> Um zu steuern, Blutungen, rollen die Ecke eines Gewebes in einem Punkt und entfernen die meisten der Puffer aus der kranialen gut. Schnell Gelschaum, vorgetränkt in Puffern, auf die blutende Fläche aufzubringen, während sehr leichten Druck mit einer Baumwolltupfer Spitze hinzugefügt wird. HINWEIS: Die Blutung kommt in der Regel von dem Rand des Knochens oder der Oberfläche der Dura; In beiden Fällen sind normal und Blutungen schnell stoppen, wenn keine größeren Blutgefäße beschädigt werden. Wenn die Blutung fortsetzt, kann Blut in das gesamte Fenster füllen, ein Gerinnsel Blatt über den Abbildungsbereich zu bilden. <ol><li> Um das Gerinnsel Blatt zu entfernen, Pick up sorgfältig Stücke geronnenes Blut aus dem Bereich Bildgebung, während die intakte Blut gerinnen lassen um die Quelle des geplatzten Blutgefäßes. Achten Sie darauf, nicht das Blutgerinnsel aus der Entlüftungs Quelle zu entfernen, da dies noch mehr Blutverlust verursachen kann. Bewässern die Oberfläche des Hirns mit Hirnpuffer kein Blut abzuwaschen. </li><li> Achten Sie darauf, zu vermeiden, die zu berührenempfindliche Gehirngewebe oder das Hinzufügen von Fremdmaterial an das Gehirn; wiederholen , bis die Blutung zum Stillstand gekommen ist, für etwa 2 bis 5 min (Figur 2E). HINWEIS: An diesem Punkt die Kraniotomie bereit sind, die Schädel Fenster zur Herstellung von (siehe Schritt 5). Falls erforderlich, Entfernen des Dura vor dem kraniale Fenster Implantieren (siehe Schritt 4). </li></ol></li></ol> 4. Dura Removal HINWEIS: Dura Entfernung erfordert äußerste Sorgfalt und kann mehr als 15 Minuten dauern. <ol><li> Zeichnen Sie überschüssige Puffer aus der Kraniotomie entfernt. Während eine feuchte Oberfläche gehalten wird, ein kleines Stück mit einer Pinzette dura greifen und sanft die Dura reißen. </li><li> Verwenden einer Pinzette und Schere Feder sanft reißen und die Dura wegschneiden. </li><li> Drop mehr Gehirn-Puffer auf der Hirnoberfläche die Dura zu schweben und helfen, sie aus dem Gehirn zu trennen. Fortfahren, bis alle Dura aus dem Schädel Fenstern Website entfernt wird. Wann wird korrekt das Gehirn durchgeführt erscheint sehr sauber zu sein mit unterschiedlichen blOOD Gefäße und keine Flecken (vergleiche Abbildung 2E mit 2F). Achtung: Einige Bereiche der Dura sind an kleinen Arteriolen auf der Oberfläche des Gehirns (zB in der Nähe der Mittellinie proximal des parietalen Assoziationsbereich) und Entfernung solcher kann den Arteriolen Bruch. In solchen Fällen kann es besser sein, ein kleines Stück dura über Oberseite des arteriole intakt zu lassen. Die FU kann nicht diesen kleinen Bereich eindringen, aber dies mit schweren Blutungen bevorzugt. </li><li> Befestigen Sie die Hirnoberfläche in Agarose so schnell wie möglich Bewegung von Pulsieren zu minimieren und zu verhindern, dass weitere Quellen (siehe Schritt 5). </li></ol> 5. Vorbereitung Cranial Fenster <ol><li> Spray das Deckglas mit 70% Ethanol und verwenden einen Luftbehälter vorsichtig trocken. Achten Sie darauf, das Glas ohne Flecken oder Staub vorhanden ist absolut sauber. </li><li> Bereiten 1,3% Agarose durch Erhitzen von 200 mg Agarose-Pulver, gelöst in 15 ml Hirn-Puffer. Stellen Sie den microwave hoch und Wärme für 10 bis 15 s in einer Zeit unter Rühren sanft dazwischen, bis alle Agar gelöst sind. Hinweis: Sicherstellen, keine Blasen oder Partikel vorhanden sind, da diese mit einer Abbildungs ​​stören. </li><li> Platzieren ein Thermometer in der heißen Agarose und kühlt die Agarose nach unten bis kurz über Erstarrungstemperatur (~ 40 ° C). ANMERKUNG: Die Ausführung kühles Wasser über die Außenseite des Agarose-Behälters kann der Kühlprozess beschleunigen. Rühren Sie leicht kontinuierlich keine Blasen oder Partikel vorhanden sind, zu gewährleisten. </li><li> Unmittelbar vor der Agar-Anwendung, die das Gehirn Puffer aus dem Schädel gut entfernen. Zeichnen Sie die Agarose mit einer Transferpipette und bringt die Agarose direkt auf das Gehirn. Schnell den Deckel Schlupf über die Oberfläche und befestigen der Abdecküberzug mit Agarose an den Ecken abfällt. </li></ol> 6. Euthanasie HINWEIS: Nach unserer Erfahrung dieses Verfahren erfahrene Chirurgen dauert mindestens 3 bis 4 Praxis Operationen zu erreichen mehr als 90%Erfolgsrate. Weniger erfahrene Chirurgen können noch mehr Praxis erfordern. Während der Kraniotomie oder durotomy kann die Hirnschäden, wie zum Beispiel, wenn der Bohrer Schläge durch den Knochen in das Gehirn aufrecht zu erhalten. Einige kleinere Schäden am Rande des Craniotomie zulässig sein. Wenn jedoch das Gehirn „sauber“ mit leuchtend roten unbeschädigten Blutgefäßen und weißer Rinde sieht nicht, kann das Experiment muß beendet werden. Beispiele für schlechte Präparate schließen diejenigen mit toten Blutgefäßen, oder wenn die Rinde mit zerrissenen oder beschädigten Blutgefäßen gekennzeichnet ist. Wenn eines dieser Anzeichen vorhanden sind, wird das Experiment unwahrscheinlich hohe Qualitätsdaten liefern. Ob die Operation / Experiment erfolgreich war oder nicht, artgerecht mit der Maus auf der Beendigung des Experiments einschläfern. <ol><li> Tief mit mindestens 3,5% Isofluran betäubt. Dann gibt eine intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital bei 300 mg / kg. Im Idealfall, wenn die Nadel in die Leber eingeführt wird, wird der Tod sehr schnell sein (&lt;1 min). </li><li> Wenn Perfusion erforderlich ist, stellen Sie sicher, dass das Tier tief narkotisierten ist, bevor Sie fortfahren (siehe Schritt 1.3). </li><li> Alternativ kann, wenn die Perfusion nicht erforderlich ist, für mindestens 5 Minuten warten und dann überprüfen, ob die Maus tot ist. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Atmung, Herzschlag, sowie einen Mangel an Schmerz Rückzug und Corneareflexe. Auch für hellblaue / weiße Färbung von Extremitäten und Verdunkelung der Blutgefäße über die Kortex beobachten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses innovative Protokoll für ein großes Schädelfenster ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung über die zeitlichen und parietalen Bereiche der Hirnrinde. Kombiniert mit der optischen Bildgebung kann es helfen, die neuronale Dynamik innerhalb kortikaler Bereiche während der spontanen und stimulusinduzierten Aktivität aufzudecken. Diese expansive Craniotomie macht auch eine große Ausdehnung des kortikalen Gefäßnetzes aus, einschließlich des proximalen Endes der mittleren zerebralen Arterie (MCA), was eine <e...

Die Kraniotomie ist ein Standardverfahren von Neurowissenschaftlern verwendet, um einen Teil des Gehirns zu zeigen. Seit Anbeginn der Elektrophysiologie hat die Kraniotomie beispiellos Durchbrüche auf dem Gebiet der Neurowissenschaften erlaubt. Dichte Abbildung der Hirnrinde mit Elektroden führte zu Experimenten Überprüfung von Hypothesen und Theorien auf der Grundlage dieser Karten. Wir haben vor kurzem in eine neue Ära , in der die Kraniotomie für in vivo Bildgebung von kortikalem Blutfluß 1, 2, 4, 3 und Gefäß - Nerven - Architektur ermöglichte die Visualisierung der kortikalen Aktivität in Echtzeit in den belichteten Bereichen 5, 6, 7 verwendet wird. Obwohl viele Studien verwenden Kraniotomien mit in vivo optischen Bildgebungstechniken kombiniert , um die Struktur und Funktion von kortikalen Neuronen zu untersuchen, Glia und cortische Vaskulatur 8, 9, werden weitere Untersuchungen von kleinen Bereichen des exponierten cortex begrenzt (siehe aber 10). Der Zweck dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zum Erzeugen einer große seitliche Kraniotomie zu schaffen, die Hirnrinde von der Mittellinie auf das Schuppenbein aussetzt und darüber hinaus Bregma und Lambda erstreckt. Diese große Kraniotomie ermöglicht die gleichzeitige Betrachtung der Assoziationskortizes (retrosplenialen, cingulären und parietale), primären und sekundären Motor, somatosensorischen, visuelle und auditorischen Cortex. Dieses Verfahren wurde mit spannungsempfindliche Farbstoff imaging (VSDI) zu untersuchen , die zuvor gekoppelt , wie mehrere kortikalen Bereichen miteinander während der spontanen und Stimulus-induzierten kortikaler Aktivität 5, 11, 12 in Wechselwirkung treten. Die schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens umfassen Positionierung des Kopfesdes Tieres, Fixieren der Kopfplatte, und die Vermeidung von Blutung während des Schläfenmuskel von dem parietalen Knochen trennt. Es muss auch während der Bohr- und Schädel-Entfernungsverfahren, wie die Schädel Kurven in einem schrägen Winkel aufgenommen werden.

<table><tbody><tr><td>Heating Pad</td><td>FHC</td><td>40-90-2</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2 or more pairs are recommended</td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00, 15000-10</td><td>1 pair should be designated for dura removal&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Jet tooth shade powder</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Powder</td><td>to be mixed with the Jet Liquid</td></tr><tr><td>Jet tooth shade liquid</td><td>LANG Dental</td><td>Jet Tooth Shade Liquid</td><td>to be mixed wihth the Jet Powder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389</td><td>Midwest Dental</td><td>385201</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Sinclair Dental Canada</td><td>Pfizer Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>124125</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine 2% Epinephrine</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125299</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethazone 5&amp;nbsp;mg/mL</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>125231</td><td></td></tr><tr><td>Butyl cyanoacrylate glue (VetBond)</td><td>Western Drug Distribution Centre Ltd</td><td>12612</td><td></td></tr></tbody></table>

a large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity

Die Kraniotomie ist ein häufig durchgeführtes Verfahren , das Gehirn für in - vivo - Experimente zu belichten. In Maus-Forschung verwenden die meisten Labors eine kleine Kraniotomie, typischerweise 3 mm x 3 mm. Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Herstellung eines wesentlich größeren 7 mm x 6 mm kranialen Fenster zu schaffen meist eine zerebralen Hemisphäre über die Maus temporale und parietale Kortex aussetzt (zB Bregma 2,5 bis 4,5 mm, lateral 0-6 mm). Um diese Operation auszuführen, muss der Kopf gekippt werden etwa 30 ° und ein großer Teil der Schläfenmuskel muss zurückgezogen werden. Aufgrund der großen Menge an Knochenentfernung wird dieses Verfahren für die akute Experimente mit dem Tier während der Operation und Experiment betäubt nur gedacht. Der Hauptvorteil dieses innovativen großen seitlichen Schädelfenster gleichzeitigen Zugang zu den beiden medialen und lateralen Bereichen der Hirnrinde zu liefern. Dieses große einseitige Schädelfenster kann verwendet werden, um die neuronale Dynamik zwischen Zellen zu untersuchen,sowie zwischen verschiedenen kortikalen Bereichen von Multi-Elektroden - elektrophysiologische Aufzeichnungen, Bildgebung neuronaler Aktivität (zB intrinsische oder extrinsische imaging) und optogenetische Stimulation kombiniert. Zusätzlich bietet diese große Craniotomie macht auch einen großen Bereich der kortikalen Blutgefäße, für die direkte Manipulation der lateralen kortikalen Gefäße ermöglicht.

<html> Um die Wechselwirkungen zwischen kortikalen Bereichen innerhalb einer einzigen Hemisphäre zu untersuchen, benutzten wir eine große Kraniotomie, die sich über den Sagittal Sinus und 5 - 6 mm lateral erstreckt. Dieses kraniale Fenster umfasste primäre (motorische, somatosensorische, visuelle, auditive), sekundäre (motorische, visuelle) und Assoziation (retrosplenial, cingulate, parietal association) Cortices der rechten Gehirnhemisphären (Abbildung 3A</stro...

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A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Schaffung einer großen einseitigen Kraniotomie über die zeitlichen und parietalen Regionen der Maus Hirnrinde. Dies ist besonders nützlich für die Echtzeit-Bildgebung über einen expansiven Bereich einer kortikalen Hemisphäre.

Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

a-large-lateral-craniotomy-procedure-for-mesoscale-wide-field-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Aufrufe.  University of Lethbridge.  Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Schaffung einer großen einseitigen Kraniotomie über die zeitlichen und parietalen Regionen der Maus Hirnrinde. Dies ist besonders nützlich für die Echtzeit-Bildgebung über einen expansiven Bereich einer kortikalen Hemisphäre. 

Serie: A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Ein Kraniotomie Chirurgie Verfahren für chronische Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

Forschung

Biologie

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Krebsforschung

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Neurowissenschaften

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Medizin

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Lateral Chronic Cranial Fenster Vorbereitung Ermöglicht<em&gt; In Vivo</em&gt; Beobachtung Nach Artery Occlusion Distal cerebri bei Mäusen

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Translational Brain Mapping at the University of Rochester Medical Center: Preserving the Mind Through Personalized Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, neuroanesthesia, and neurosurgery. Patients who have tumors or epileptogenic tissue in eloquent brain areas are studied preoperatively with functional and structural MRI, and intraoperatively with direct electrical stimulation mapping. Post-operative neural and cognitive outcome measures fuel basic science studies about the factors that mediate good versus poor outcome after surgery, and how brain mapping can be further optimized to ensure the best outcome for future patients. In this article, we describe the interdisciplinary workflow that allows our team to meet the synergistic goals of optimizing patient outcome and advancing scientific understanding of the human brain.

This article provides an overview of a multi-modal brain mapping program designed to identify regions of the brain that support critical cognitive functions in individual neurosurgery patients.

Translational Brain Mapping am University of Rochester Medical Center: Erhaltung des Geistes durch personalisierte Brain Mapping

The Translational Brain Mapping Program at the University of Rochester is an interdisciplinary effort that integrates cognitive science, neurophysiology, ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application to elucidate capillary blood flow effects during seizures, driven by mural cells. In vitro and in vivo cortical imaging have shown that capillary constrictions driven by pericytes can result from functional local neural activity, as well as from drug application, in healthy animals. Here, a protocol is presented on how to use pCLE to determine the role of microvascular dynamics in neural degeneration in epilepsy, at any tissue depth (specifically in the hippocampus). We describe a head restraint technique that has been adapted to record pCLE in awake animals, to address potential side-effects of anesthetics on neural activity. Using these methods, electrophysiological and imaging recordings can be conducted over several hours in deep neural structures of the brain.

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Whereas multiphoton imaging is only effective at limited depths from the tissue&#8217;s surface, it is possible to achieve 3 &#181;m resolution imaging at any depth via pCLE. Here, we present a protocol to conduct pCLE imaging to measure microvascular dynamics in the hippocampus of ictal and wild-type mice.

In vivo fasergekoppelte präklinische konfokale Laser-Scanning-Endomikroskopie (pCLE) von Hippocampus-Kapillaren bei wachen Mäusen

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

Zusammenfassung

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