We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission&#8217;s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the &#8220;Stem Cells Call for Proposals.&#8221; This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by &#8220;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&#8221;.

1. Axonal Labeling <ol><li> Kletterfasern können durch Injektion, entweder organische Farbstoffe mit hohem Molekulargewicht Dextran oder ein Plasmid / Viren, die die Expression von fluoreszierenden Proteinen induzieren 26-29 konjugiert bezeichnet werden. In diesem Protokoll wird der organische Farbstoff Dextran Alexa Fluor 488 in den unteren Olive injiziert Kletter Fasern kennzeichnen und zu visualisieren in der Kleinhirnrinde (Abbildung 1). Alle hier beschriebenen Verfahren von der italienischen Gesundheitsministerium genehmigt worden. </li><li> Bereiten Sie die Glaskapillare, indem Sie es auf eine Mikropipette Puller. Schneiden Sie die Spitze der Glaskapillare mit der Schere bis der Außendurchmesser beträgt etwa 30 um. </li><li> Laden Sie die Kapillare mit 1-2 ul der Dextran-konjugierten Farbstoff. </li><li> Bevor Sie beginnen, sterilisieren alle chirurgischen Instrumente im Autoklaven. Während des Verfahrens reduzieren Risiken der Kontamination durch die Verwendung eines Glasperlen Sterilisator. </li><li> Anesthetize der Maus (9-12Wochen) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (9 mg / kg). Stellen Sie sicher, das Tier ist komplett mit Schwanz und / oder Zehen drückt sediert. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Rasieren Sie die Haare über dem Nacken entweder mit einer Rasierklinge oder Enthaarungscreme. Wischen Sie die Operationsstelle zweimal mit betadine, mit Ethanol 70% wechselten. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Halter. Halten Sie das Tier warm mit einem Heizkissen. </li><li> Drücken Sie vorsichtig die earbars auf den Knochen neben den Ohren, so dass der Kopf fest gehalten. Drehen Sie den Kopf, um eine 140 °-Winkel mit dem Körper zu bilden. Die gewünschte Orientierung kann durch leichtes Verändern der Höhe der Nase Haltestange auf der stereotaktischen Halter erhalten werden. </li><li> Einige Tropfen von Lidocain auf die Haut zwischen den Ohren. Verwenden einer Pinzette oder einer Rasierklinge, um einen vertikalen Schnitt von etwa 1 cm auf der Haut unter dem Hinterhauptbein durchzuführen. </li><li> Trennen Sie vorsichtig das subkutane Gewebe und Muskeln durch stumpfe Pinzettes unter der Dissektionsmikroskop. Drücken Sie den horizontalen Muskelbündel und halten neben den beiden vertikalen Muskeln Faszikel um die Dura über das Foramen magnum aus. </li><li> Mit äußerster Vorsicht, sezieren die Dura mit einer Spritze oder Nadel sehr scharfe Zange, um den Hirnstamm aus. Eine kleine Menge von Rückenmarksflüssigkeit kann austreten, wenn die Dura geschnitten wurde. </li><li> Auf der stereotaktischen Mikromanipulator, drehen Sie den Halter der Kapillare 45 ° aus der Senkrechten. Platzieren Sie die Kapillare an der Mittellinie in der Mitte zwischen der kaudalen Rand der Kleinhirnrinde und dem ersten Halswirbel. Legen Sie die Pipette in einer Tiefe von 2 mm von der Oberfläche. </li><li> Liefern Sie eine 0,5-1,5 ul Volumen der Farbstoff über 10-15 min. Eine Mikroinjektion Abgabesystem ermöglicht gesteuerte Druck Abgabe der Flüssigkeit in der Kapillare (Pulsdruck = 20 psi; Impulsdauer = 3-4 ms, Frequenz der Impulsabgabe = 12 Hz). </li><li> Verlassen Sie die Kapillare in Platz für 15 min, dann slowly (2-3 min) entfernen. Zart neu ausrichten, die Muskeln und die Haut zu nähen oben. Halten Sie die Muskeln und durch die Anwendung einiger Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens mit Feuchtigkeit versorgt. </li><li> Um Austrocknung zu vermeiden, subkutan injizieren 0,5 ml 0,9% NaCl. Halten Sie das Tier in einem Käfig erhitzt bis zur vollständigen Erholung von der Narkose. </li><li> Subkutan zu verabreichen Carprofen (5 mg / kg) täglich für 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol> 2. Optische Fenster auf der Kleinhirnrinde HINWEIS: Der Farbstoff wird in 2 Wochen von der unteren olivary Kern bis zu der Kleinhirnrinde zu den CF-Terminals transportiert (siehe Abbildung 1). Die spärlich beschriftet CF kann unter der ständigen Schädelfenster, das wie folgt durchgeführt werden kann visualisiert werden: <ol><li> Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumenten. </li><li> Betäuben die Maus wie oben beschrieben. Verwenden Zeh drückt, um das Tier zu überprüfen ist komplett sediert. </li><li> Rasieren Sie die Haare über den Kopf, wischen Sie die skMit alternierenden Seitenhiebe von 70% Alkohol und betadine und Augensalbe anwenden. Legen Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen und die Position der Ohr Bars, um fest zu halten den Kopf. </li><li> Subkutan verabreichen Dexamethason (0,2 mg / kg) und Carprofen (5 mg / kg), um das Quellen des Gehirns und mögliche Entzündungen am kranialen Fenster Stelle zu verhindern. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von Lidocain auf die Haut über dem Schädel und schneiden eine Klappe, zwischen den Ohren über den Augen. Bewerben Lidocain-Lösung wieder auf die Knochenhaut vor Kratzen mit einem Skalpell. </li><li> Verwenden Sie den Zahnbohrer dünne einem halbkreisförmigen Bereich von Schädel über dem Kleinhirn. Das Fenster ist in der Regel zentral angeordnet und in Richtung der Rückseite Naht, so daß die Schädel Tiefe über den Umfang des Halbkreises fast konstant ist. Positionieren des Fensters, zu nahe an der Lambdanaht und Serienbohrungen über diese sehr dick Region kann zu einer Überhitzung des Gehirns und Bildung von Ödemen führen. </li><li> Bewerben blutstillSchwamm auf den Schädel im Falle von Blutungen. </li><li> Schnitt ein Deckglas in zwei Hälften mit Hilfe einer Rasierklinge und einer Pinzette. Überprüfen Sie, dass die Deckglas ist etwas größer als die Insel von Knochen und hat eine ähnliche Form, bevor Sie die Klappe der Knochen mit der Pinzette; wenn nicht, Umgestaltung der Deckglas oder wählen Sie einen anderen. Die Dura mater Berühren Sie nicht mit der Pinzette beim Zeichnen der Knochen. Vorsichtig legen die Deckglas auf die Dura. HINWEIS: Die Haftung der gesamten Oberfläche des Glases auf der Dura foretelling langlebige cranial Fenster. </li><li> Luftblasen unter dem Glas durch mehrmaliges Spülen mit Kochsalzlösung und Trocknen mit Wattestäbchen. Dies wird auch dazu beitragen, das Entfernen einige restliche Blut, das aus kleinen Kapillaren nach der Positionierung der Glas verschüttet werden könnte. Verschließen Sie die Fenster mit einer Mischung aus Acrylkleber und Zahnzement 30. </li><li> Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen in einer Rückgewinnungskammer, bis es vollständig von der Narkose erholt. Nicht wiederdrehen Mäuse im Käfig, bis vollständig erholt; Lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichende Brustlage zu halten. </li><li> Subkutan zu verabreichen Carprofen (5 mg / kg) täglich für 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol> 3. In Vivo Multi-Photonen-Laser-Axotomie <ol><li> Warten Sie 2-7 Tage von der Operation vor der Durchführung der ersten Bildgebungssitzung. Saphir-Laserquelle (120 fs Breite Impulse, 90 MHz Repetitionsrate), die durch ein Paar von Galvanometerspiegel zuerst gescannt und fokussiert auf die Probe durch ein Eintauchen in Wasser 20X dann: Die speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop verwendet, hier wird mit einem Ti bereitgestellt Ziel (NA 0,95, WD 2 mm). Ein Closed-Loop-Piezotisch führt axialen Verschiebungen bis zu 400 um von dem Ziel. Photomultiplier sammeln das Fluoreszenzsignal. </li><li> Anesthetize das Tier, dann positionieren Sie den Kopf in den stereotaktischen Halter, dass die Schädelfenster legt parallel zur Objektivierungve Brennebene. </li><li> Erkunden Sie mit TPF Abbildung der Hirnrinde unter der Schädelfenster. Wählen Sie das Axon bis zu den hellsten beschädigt werden. </li><li> Erwerben eine Z-Stapel (in der Regel das Sichtfeld 100 × 100 &amp;mgr; m 2 bei 512 x 512 Pixel, 2 um z-Achse Schritt), um eine 3D-Rekonstruktion der Ziel Axon erhalten. Innerhalb des abgebildeten Volumens, wählen die Läsion auf einem Zweig, der axonalen meist parallel zu der Brennebene liegt. Diese Ausrichtung ermöglicht es, schnell punkten morphologische Veränderungen, die prädiktiv für eine erfolgreiche Präparation sind. </li><li> Bestrahlung mit einer hohen Energiedosis ausgewählten Punkt auf einem distalen Abschnitt einer CF. Dies wird durch die Labview-Software durchgeführt: Erhöhung der Laserleistung 5-10x mehr als die Leistung für die Bildgebung (≈ 300 mW, nach dem Objektiv gemessen wird) verwendet wird, stellen Sie die Position der galvanometrische Spiegel, eine Zeilen tun (~ 4 - 10 um) am Ort der Läsion, und öffnen Sie den Laser Shutter für 400 bis 600 ms. Richten Sie die Zeilensenkrecht auf der CF-Ebene komplett durchschneiden das Axon. Bestrahlung heller Flecken (z. B.., Krampfadern) hilft in der Regel zerlegt das Axon. Die Wellenlänge der Laser Axotomie ist der gleiche für die Bildgebung (920 nm) verwendet. </li><li> Gewöhnlich vorübergehend die Fluoreszenz des Axons im bestrahlten Bereich nimmt aufgrund Bleichen. Erwerben einen Stapel der Region paar Minuten nach der Bestrahlung, um sicherzustellen, dass die Ablation erfolgreich durchgeführt worden. Wenn die Region begonnen Schwellung und das Axon gebildet wulstartige Strukturen hat die Neuronen erfolgreich seziert. In diesem Fall wird in einigen Stunden (von einigen zehn Minuten bis 24 h), der distale Abschnitt des Axon degeneriert und verschwinden vollständig. </li><li> Leider ist die Energiedosis erforderlich, um eine vollständige Axotomie zu produzieren, ist nicht immer vorhersehbar. Wenn das einzige Ergebnis der Bestrahlung Photobleichen, sollte die Fluoreszenz schnell durch Diffusion Farbstoff gewonnen werden, und die Bestrahlung soll nochmals wiederholt werden, um wirksamely sezieren die Axon. Auch in dem Fall Anzeichen von Schwellung nicht innerhalb von 5 erscheinen - 20 min, oder die Schwellung wird durch Erholung folgt (. Analog zu dem, was für die Laser dendrotomy beschrieben, siehe Allegra Mascaro et al 23), versuchen Sie es mit neuen Scans die Erhöhung der Verweilzeit und / oder der Laserleistung. </li><li> Überwachen Sie den eventuellen Umbau des Axons in den Laser-Axotomie, die die mit Zwei-Photonen-in-vivo-Bildgebung folgenden Tagen (Abbildungen 2 und 3). Das Gefäßmuster als Referenzmuster verwendet, um die seziert Axon in den folgenden Tagen abzurufen. </li><li> Subkutan zu verabreichen Carprofen (5 mg / kg) jeder Bildgebungssitzung für die gesamte Dauer des Experiments. </li></ol>

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(12), (2008).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Dieses Protokoll zeigt, wie Neuronen der unteren Olive mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Anschließend wird das Verfahren zur Herstellung eines Schädel Fenster auf der Kleinhirnrinde zuführen beschrieben. Diese Technik stellt einen optischen Zugang zu dem Anschlussabschnitt der olivocerebellar Neuronen, die Kletterfasern. Leider ist das Ergebnis sowohl der Kennzeichnung und Schädelchirurgie auch in den Händen von Facharbeitern recht niedrig (in der Regel 1 von 3 Mäusen markiert ist, und 1 von 3 Schädelf...

Axonalen Durchtrennung von mechanischen Verletzungen toxischen Insult oder neurodegenerativen Erkrankungen resultiert, wird gewöhnlich durch die Degeneration des distalen Teils des Axons, die von dem Zellkörper 10-13 gelöst wird, gefolgt. Mit wenigen Ausnahmen 2,7,14,15 sind getrennt Axone im ZNS von erwachsenen Tieren in der Regel nicht in der Lage, ein Nachwachsen Programm 16 zu aktivieren. Wenig ist über die Echtzeit-Dynamik von degenerativen Ereignisse auf zellulärer und subzellulärer Ebene bekannt. Die Entwicklung neuer Strategien zur Begrenzung neuronalen Schäden und Förderung der neuronalen Nachwachsen erfordert, als einen ersten Schritt, die Klärung der Mechanismus, mit dem einzigartig verletzten Nervenzellen degenerieren und zu regenerieren. Diese Studie wird am direktesten durch die Überwachung der Dynamik eines einzelnen Neurons in vivo gerichtet. Beim Ein-Photonen-Fluoreszenz-Imaging-Techniken durch intensive Streuung des sichtbaren Lichts beschränkt, tief kortikalen Schichten in li erreicht Zweiphotonenanregungve Mäuse mit subzellulärer Auflösung 3,4,17. Unter Ausnutzung von transgenen Mäusen, bei denen fluoreszierende Proteine ​​werden selektiv in Subpopulationen von Neuronen 18-20 ausgedrückt hat TPF-Mikroskopie zur Erforschung der synaptischen Plastizität und axonalen Dehnung während der Entwicklung in vivo 21,22 angewandt. T er Fähigkeit der geschädigten Neuronen einzeln zu nachwachsen nach Verletzung kann durch Kopplung in-vivo-Überwachung von Zwei-Photonen-Bildgebung mit einem Modell der Schädigung spezifisch an das Axon von Interesse gezielt untersucht werden. Multi-Photonen-Absorption von Femtosekundenpulsen verwendet wurde, um einzelne Dendriten oder auch Einzel Stacheln 5,23 stören. Darüber hinaus ermöglicht diese Verletzung Paradigma Schneiden Einzel axonalen Verzweigungen, ohne dass der Kontakt mit Dendriten-6. Im Rahmen der sezieren die Funktionen, die spezifischen neuronalen Population zu ermöglichen, ihre Axone zu regenerieren einmal beschädigt, Kleinhirnkletterfasern (CF) sind ein nützliches Modell since sie bemerkenswerte Kunststoffeigenschaften nach der Verletzung auch bei erwachsenen Tieren 24,25 zu behalten. Kürzlich, langfristige Darstellung von CF zeigten, dass diese Axone sind in der Lage, die in den nachwachsenden Laser-Axotomie 6 Tagen folgen. Dieses Protokoll beschreibt, wie olivocerebellar Neuronen und ihre axonalen Dehnung durch anterograde Tracing zu beschriften. Sobald die Neuronen von Interesse fluoreszierend markiert sind, können sie wiederholt an beliebigen Zeitpunkten für Wochen oder Monate nach einer Schädelfenster überwacht werden. Das Verfahren, um einzelne axonalen Verzweigungen durch Laser-Axotomie in vivo sezieren wird dann dargestellt werden. Die hier vorgestellten Techniken bieten neue Einblicke in den Mechanismus der axonalen Umbau in vivo und können die Entwicklung von therapeutischen Strategien helfen, neuronale Degeneration zu begrenzen und zu fördern axonale Nachwachsen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting&#160;</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 (Glass bead sterilizer)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection dispense system</td>
			<td>Picospritzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>64-0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses,&#160; 90 MHz repetition rate</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spongostan, haemostatic sponge&#160;</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirrors&#160;</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier modules&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H7710-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW System Design Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate)</td>
			<td>Boheringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rymadil (carprofen)&#160;</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine clorohydrate 2%</td>
			<td>ATI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 dextran</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser nanosurgery of cerebellar axons in vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Dieses Protokoll beschrieben, wie axonalen Etikettierung, in-vivo-Imaging und Laser-Axotomie an einzelnen Nervenzellen durchzuführen. Die Zeitachse des Experiments ist in Fig. 1 gezeigt. Ein Beispiel für CF mit Alexa Fluor 488 Dextran markiert und unter der Schädelfenster in vivo Zweiphotonenmikroskopie sichtbar ist in Abbildung 2 dargestellt. Wie bereits berichtet 6,27, zeigen die aufsteigenden Äste eine hohe Stabilität in ...

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Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Zwei-Photonen-Imaging, Laser Nanodissektions gekoppelt ist, sind nützliche Tools, degenerativen und regenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem mit subzellulärer Auflösung zu studieren. Dieses Protokoll zeigt, wie beschriften, Bild-und sezieren einzigen Kletterfasern in der Kleinhirnrinde in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

laser-nanosurgery-of-cerebellar-axons-in-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

8.1K Aufrufe.  University of Florence.  Zwei-Photonen-Imaging, Laser Nanodissektions gekoppelt ist, sind nützliche Tools, degenerativen und regenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem mit subzellulärer Auflösung zu studieren. Dieses Protokoll zeigt, wie beschriften, Bild-und sezieren einzigen Kletterfasern in der Kleinhirnrinde in vivo. 

Serie: Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Spektrale Reflectometric Mikroskopie auf Markhaltige Axone In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...