Wir danken Prof. emeritus Jean-Claude Perriard und Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) für die Einführung in die Isolation Techniken zur neonatalen Ratten-und Maus-Kardiomyozyten. Wir möchten Prof. Ju Chen und Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) für ihre Unterstützung danken. Arbeit im Labor von EE wurde von einem MRC Karriere Gründung Zuschuss finanziert. SL wird von einem K99/R00 Weg in die Unabhängigkeit Auszeichnung von der NIH / NHLBI (HL107744) unterstützt. TMM wurde durch ein Postdoc-Stipendium der American Heart Association (11POST7310066) unterstützt.

Das folgende Verfahren beschreibt eine zweitägige Protokoll 16,17 für die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Alle Lösungen sind steril und steril filtriert. Alle Werkzeuge werden durch Oberflächensterilisation mit 75% Ethanol sterilisiert. Mit Ausnahme der anfänglichen Gewebeentnahme, werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömung Zellkulturhaube durchgeführt. Dieses Protokoll wird für die Isolierung von neonatalen Mäuseherzen 1-2 Wurf (s) bestimmt - etwa 5-14 Jungtieren, kann aber für größere Wurfgrößen und neonatalen Ratten-Kardiomyozyten angepasst werden. Skala media / Enzymeinsatz als angemessen. Für die Arbeit mit Neugeborenen Nagetiere, finden Sie in Ihrer örtlichen Universität Richtlinien und Regeln von der Legislative und / oder Tierpflege-Programme eingestellt, und sich an Ihren institutionell genehmigten Tier Protokoll. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden von der UC San Diego Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt wurde, und sich an federal und Vorschriften. 1. Tag. 1. Isolation von Herzgewebe von neugeborenen Mäusen <ol><li> Bereiten Sie 50 ml 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM 8.6 ergänzt und zerstreuen sich in zwei sterile Bakterien Gerichte auf Eis gestellt. </li><li> Bereiten Sie 10 ml Isolationsmedium in 50 ml sterile konische Falcon-Röhrchen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis. Sterilisieren Schere (eine gekrümmte, eine geradeaus) und Zange (gekrümmt, Dumont Nr. 7). </li><li> 1-3 Tage alten neugeborenen Mäusen werden schnell in 75% Ethanol-Lösung für die Oberflächensterilisation gespült. Jungtiere werden mit einer sterilen Schere (gerade) geköpft, und die Brust wird entlang dem Brustbein geöffnet werden, um Zugang zu der Brusthöhle und das Herz (1A, Supplemental Film S1) zu ermöglichen. Technische Anmerkung: Neugeborene Mäuse älter als 3 Tage verwendet werden können, aber zu weniger lebensfähigen Zellen 2. </li><li> Herzen sind aus extrahiertder Körper mit gekrümmten Scheren und sofort in die Bakterienschale mit 1x PBS mit 20 mM BDM übertragen (ohne Ca 2 +, Mg 2 +), auf Eis. Alle folgenden Schritte werden in dem sterilen Zellkulturhaube durchgeführt. </li><li> Lungengewebe zu entfernen, größere Gefäße (Vorhöfe und, falls gewünscht). Wash Herzen in der 1x PBS-Lösung (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM (auf Eis), um Blut zu entfernen. Über gewaschen Herzen aus der ersten in die zweite Schüssel Bakterienschale mit 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM (auf Eis) mit einer Pinzette oder einer gelochten Löffel (Abbildung 1B). </li><li> Über gereinigt / gewaschen Herzen in einem Tropfen Isolationsmedium (etwa 250 ul; 1C) in einem dritten Bakterienschale (auf Eis) und die Verwendung der gebogenen Schere, um die Herzen in kleine Stücke (ca. 0,5-1 mm 3, Hackfleisch oder kleiner; 1D, 1E). </li><li> Übertragen Hackfleisch Herzen in einer konischenRöhrchen mit 10 ml Isolationsmedium (auf Eis), und Inkubation unter leichtem Schütteln bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Tag. 2. Enzymatische Verdauung und Gewebeüberzug der Zellen <ol><li> Wiegen in 15 mg Collagenase / Dispase Mischung (Roche) und lösen die Enzymmischung in 10 ml Medium L15-5 mit 20 mM BDM (Digestionsmedium) ergänzt. Sterilfilter der Digestionsmedium in der Zellkultur Haube in eine neue sterile 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Bereiten Sie 30 ml L-15-Medium mit 20 mM BDM ergänzt und Plattierungsmedium. </li><li> Mantel Zellkulturplatten mit Collagen-Lösung (Sigma C-8919) für mindestens 1 Stunde. Entfernen Kollagenlösung (kann wiederverwendet werden) und trocken Kollagen beschichtete Zellkulturschalen in sterilen Laminar-Flow-Zellkultur-Kapuze. </li><li> Entfernen Sie die konischen Rohr, das die Herzen von vorverdaut 4 ° C Gewebefragmente sollten zusammengefasst werden (1G). Lassen Sie die Gewebefragmente sinkender Boden der Röhre und Überstand (stellen Sie sicher, dass keine Gewebefragmente zu verlieren;. normalerweise kann ca. 1 ml der Isolationsmedium in der Röhre bleiben). 5 ml Digestionsmedium und 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt, um Gewebefragmente und sauerstoffhaltige Suspension unter Verwendung von Sauerstoff oder Luft für 1 min. </li><li> Übertragen des versiegelten konischen Rohr die Herzgewebefragmente in Digestionsmedium, enthaltend bis 37 ° C Wasserbad für ungefähr 2 Minuten, um die Temperatur der Aufschlußlösung einzustellen. </li><li> Herzgewebefragmente Bei 37 ° C unter leichtem Schütteln für 20-30 min (zB Schüttler bei 37 ° C, nicht mehr als 60 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist). . Aufschlusszeiten können stark von Enzymmischung und Chargennummer Achtung ab: längere Inkubationszeiten oder höhere Enzymkonzentrationen kann die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren. </li></ol> Technische Anmerkung: Wir empfehlen Verwendung einer Collagenase / Dispase Mischung von Roche (Kat.-Nr.: 10269638001), die hat sehr wenig viel-zu-viel Variabilität. Die klassische Enzym für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten Trypsin und / oder Collagenase Typ II 3,16-20 verfügbar von Worthington (Cat No CLS-2). Jedoch kann die Leistung der Collagenase II im wesentlichen von Charge zu Charge variieren. Worthington können typischerweise für die Prüfung mehrerer Kollagenase Lose Aufschlusszeiten zu optimieren und Enzymverbrauch. Alternativ verkauft Worthington eine Kardiomyozyten Isolation Kit mit einer vorab getesteten Enzymgemisch enthalten, dass kann für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten 17 (Best.-Nr.: NCIS) angepasst werden. <ol start="7"><li> Zeigen sterilen Zell-Sieb (40-100 um Nylon-Mesh) in frischem sterilen 50 ml konischen Falcon-Röhrchen. Pre-Nasszelle Sieb mit 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt. Sanft verreiben Gewebefragmente mit einem vorbenetzten 10 ml Zellkultur-Pipette für etwa 10-20 mal. Die Gewebestücke sollten vor allem bei diesem Schritt zu zerstreuen, die Freigabe der Zellen in suspension (Fig. 1H). </li><li> Lassen Sie größere Gewebestücke sedimentieren und Transferüberstand, der suspendierten Zellen in frisches konischen Rohr durch Zell-Sieb (1I). </li><li> Die unverdaute Gewebefragmente Re-suspend in 5 ml Digestionsmedium und Inkubation für weitere 5-10 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Nach Fortsetzung der Verdauung der verbleibenden Gewebefragmente, sanft verreiben Gewebe 10-20 mal und in den konischen Röhrchen mit Zellen aus dem ersten bis Zellsieb verdauen. Spülen der Zelle-Sieb mit 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt um den Durchgang von allen verdaut Zellen zu ermöglichen. </li><li> Zentrifugat konischen Röhrchen suspendiert Kardiomyozyten für 5 Minuten bei 300 rpm (ca. 50-100 × g). Den Überstand (enthaltend hauptsächlich Fibroblasten und Endothelzellen) und resuspendieren Zellpellet in 10 ml Agarmedium. </li><li> Teller-Zellen in 10 cm Zellkulturschale (2A) und Inkubation für 1-3 H in Zellkulturbrutschrank. Diese Pre-Beschichtungsschritt entfernt Fibroblasten und Endothelzellen (Figur 2B), die auf den unbeschichteten Zellkulturschale (2C) haftet. </li><li> Nach der Inkubation, Waschen nicht haft Kardiomyozyten von 10 cm Kulturschale (resuspendieren Zellen durch wiederholtes Pipettieren der Plattenmedium über die Schale) und Transfer resuspendierten Zellen in ein steriles Falcon konische Zentrifugenröhrchen (15 ml oder 50 ml). Optional: Wiederholen Sie den Vor-Galvanisieren Schritt, um weitere Fibroblasten von Zell-Suspension zu entfernen. Falls gewünscht, können die anhaftenden Fibroblasten und Endothelzellen kultiviert werden. </li><li> Zählen von Zellen (zB durch Verwendung Neubauer Zählkammer, Trypanblau-Ausschluss-Färbung 21). </li><li> Teller Zellen in Kollagen-beschichteten Zellkulturschalen mit einer Dichte von etwa 1,5 x 10 5 Zellen pro cm 2 (2D, siehe auch Kommentare in Tabelle 1 auf Plattierungund Beschichtung). Setzen Gerichte in Zellkultur-Inkubator und lassen Sie ungestört für 12-18 h, für die Einhaltung und Verbreitung von Kardiomyozyten ermöglichen. </li></ol> Tag 3 - Kultur der neonatalen Kardiomyozyten <ol><li> Bereiten Erhaltungsmedium und vorgewärmte in 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 für die Zugabe von Proliferationshemmer oder chronotrope Mittel oder das Verfahren zur liposomalen Transfektion von neonatalen Maus Kardiomyozyten. </li><li> Einen Tag nach der Beschichtung, sollten Kardiomyozyten in die Zellkulturschale eingehalten haben und optimal spontan beginnen zu schrumpfen (2E, 2F, STADT Movie-S2, siehe Tabelle 2 für häufige Probleme bei der Isolierung / Kultur Verfahren). Ersetzen Plattierungsmedium mit Erhaltungsmedium und Kultur für weitere 1-5 Tage. Medium gegebenenfalls ändern. </li></ol>

Die Verwendung von Tiermodellen, um Herzerkrankungen zu untersuchen hat sich in der kardiovaskulären Forschung Standard. Closer biochemische Charakterisierung dieser Modelle (dh Studium direkte Antworten von Herzzellen zu biochemischen oder biomechanischen Reize) erfordert in der Regel die Isolierung von Herzgewebe oder Herzmuskelzellen. Studien, die physiologischen Reaktionen des Herzens ex vivo (z. B. Acetylcholin 40 oder in Ischämie-Reperfusion Szenarien 41) in der Regel nutz...

Die frühesten Berichte für die erfolgreiche Dissoziation und Kultur von Nagetier Herzzellen stammt aus dem 1960 1,2. Selbst dann Harary und Farley bemerkt, dass kultivierte Kardiomyozyten &quot;kann eine einzigartige System für die Untersuchung von den Anforderungen des Perioden Kontraktilität [und kann] ein Mittel zur Bestimmung des Beitrages der verschiedenen Stoffwechselwege für die [Schlagen] Prozess&quot;. Obwohl Harary und Farley isolierten und kultivierten Kardiomyozyten aus jungen Ratten, und der ursprüngliche Protokoll wurde angepasst, und über die Jahre von vielen Wissenschaftlern geändert, hat die allgemeine Isolation und Kultivierung Verfahren nicht wesentlich verändert. Allerdings hat bessere Enzyme 3, standardisierte Lösungen 4,5, und die Zugabe des reversiblen Kanal-und Myosin-ATPase-Inhibitor BDM Zellen während der Isolationsverfahren 9.6 Schutz deutlich verbessert Zell-Ertrag und Rentabilität. Erwachsene vs Neugeborenen-Kardiomyozytenzyten Kardiomyozyten isolierten und kultivierten neonatalen Mäusen oder Ratten haben mehrere Vorteile gegenüber Kulturen von adulten Kardiomyozyten. Vor allem ist das Isolierungsverfahren für neonatale Maus oder Rattenherzen einfacher und kostengünstiger im Vergleich zu der Isolierung von Kardiomyozyten aus adulten Maus oder Ratte 10. Neonatale Kardiomyozyten sind weit weniger empfindlich auf in eine Calcium-haltigem Medium nach der Dissoziation Wiedereinführung, Zellausbeute stark erhöht. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass neonatale Kardiomyozyten der Maus durchlaufen eine schnellere Entdifferenzierung - Redifferenzierung Zyklus, führt in der Regel spontan nach der Plattierung schlagen Zellen 20 Stunden, während adulte Kardiomyozyten erfordern in der Regel Tempo der Kontraktion induzieren. Neonatale Kardiomyozyten sind auch leichter transfizierbar mit liposomalen Transfektion Methoden, während adulte Kardiomyozyten erfordern virale Vektoren für die erfolgreiche Umsetzung der transgenen DNA. Im Gegensatz zur neonatalen Kardiomyozytens, die Kultur der erwachsenen Nagetieren Kardiomyozyten 11-13 ermöglicht Untersuchungen von myofibrillären Abbau und späteren Wiederherstellung der kontraktilen Apparates. Diese charakteristischen morphologischen Veränderungen in adulten Kardiomyozyten treten über einen Zeitraum von ca. 1-2 Wochen. Die Entdifferenzierung - Redifferenzierung Zyklus wird durch Reexpression des fetalen Gen Programm begleitet, was in der menschlichen Kardiomyopathien 14 beobachteten pathologischen Veränderungen imitiert. Ein weiterer Vorteil des adulten Rattenherzmuskelzellen auf die Kultur von neonatalen Kardiomyozyten ist die Fähigkeit, diese Zellen Kultur für lange Zeiträume. Ratten-Herzmuskelzellen gegen Maus Die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen hat einige Vorteile gegenüber der von der Maus neonatalen Kardiomyozyten, darunter höhere Ausbeuten an lebenden Zellen und erhöhte Transfektionsraten. Doch die breite Verwendung von genetisch veränderten Mausmodellen für Herzerkrankungen (zB &lt;/ Em&gt; der Muskel lim Protein-Knockout-Maus als Modell für die dilatative Kardiomyopathie 15) wurde auf die Anpassung der Verfahren für die Isolation von Kardiomyozyten neugeborenen Mäusen abgeleitet geführt. Obwohl die zur neonatalen Ratte und Maus Kardiomyozyten isolieren Protokolle sind nahezu identisch, müssen größere Sorgfalt bei der Auswahl eines geeigneten Enzymmischung für die letztere eingenommen werden. Tatsächlich sind neonatalen Maus Kardiomyozyten im allgemeinen anfälliger für overdigestion, was zu einer verringerten Zell Ausbeute und Lebensfähigkeit. Außerdem sollte die Beschichtung Dichte eingestellt werden, weil Kardiomyozyten aus neugeborenen Mäusen abgeleitet Vergleich zu Zellen von neugeborenen Rattenherzen abgeleitet sind etwas kleiner. Bei vielen Anwendungen für die Untersuchung der morphologischen, elektrochemische, biochemische, zellbiologische und biomechanische Parameter als auch für das Verfahren der Myofibrillogenese haben kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen zu einem der vielseitigsten Systeme für das Studium derHerzzellfunktionen in vitro. Der erste Schritt zu einem erfolgreichen Test hängt jedoch auf eine einfache und zuverlässige Methode zur neonatalen Kardiomyozyten der Maus zu isolieren. Unser Protokoll bezieht seine Methodik aus vielen Quellen und wurde für die Reproduzierbarkeit und Robustheit optimiert. Wir diskutieren Faktoren, die Kardiomyozyten-Ertrag und Rentabilität zu beeinflussen, und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Kultivierten neonatalen Kardiomyozyten seit langem verwendet, um Myofibrillogenese und myofibrillären Funktionen zu studieren. Kultivierte Kardiomyozyten ermöglichen eine einfache Untersuchung und Manipulation von biochemischen Wege, und ihre Wirkung auf die biomechanischen Eigenschaften des spontan schlagenden Herzmuskelzellen. Die folgende 2-Tages-Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Wir zeigen, wie leicht zu sezieren Herzen von Neugeborenen, distanzieren das Herzgewebe und bereichern Kardiomyozyten aus dem Herz-Zell-Population. Wir diskutieren den Einsatz von verschiedenen Enzymmischungen für Zell-Dissoziation und ihre Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit. Die isolierten Herzmuskelzellen kann anschließend für eine Vielzahl von morphologischen, elektrophysiologischen, biochemischen und zellbiologischen biomechanische Tests verwendet werden. Wir optimieren das Protokoll für die Robustheit und Reproduzierbarkeit, indem nur kommerziell erhältlichen Lösungen und Enzymmischungen, dass show wenig viel-zu-viel Variabilität. Wir wenden uns auch gemeinsame Probleme mit der Isolierung und Kultivierung von Herzmuskelzellen verbunden und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.

Über dieses Protokoll isolierten wir Herzen aus 8 einen Tag alt neugeborenen Mäusen (1A, 1B, STADT Film S1). Nach dem Waschen und Zerkleinern der die Herzen mit einer Schere (1C-1F), Gewebefragmente wurden in Isolationsmedium über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln vorverdaut. Nach Vorverdauung (1G), die Gewebefragmente übertragen wir in frisch gemacht Verdauung Medium und die Gewebefragmente für 20 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. Die resultieren...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

62.3K Aufrufe.  King’s College London.  Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden. 

Serie: Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Forschung

Biologie

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...