Dieses Protokoll ermöglicht die Bildgebung von Mausembryonen während ihrer Entwicklung. Dies ermöglicht es, die frühe Kardiogenese im Detail zu untersuchen. Wie bei der Aufnahme von Standbildern von gefälschten Embryonen bietet die Live-Bildgebung vollen Zugriff auf die Untersuchung des dynamischen Prozesses in der Embryonalentwicklung.
Die Fähigkeiten, die für die Bildgebung des Lebens erforderlich sind, sind durch reine Textveröffentlichungen schwer zu erfassen. Einer anderen Person dabei zuzusehen, ist wichtig zu lernen. Schneiden Sie zunächst einen Zentimeter lange Wolframdrahtstücke ab und schärfen Sie sie auf einen Durchmesser von 0,02 bis 0,05 Millimetern, indem Sie die Spitze des Drahtes in eine gesättigte Natriumnitratlösung tauchen.
Um Ellbogenglaskapillaren vorzubereiten, legen Sie den Mittelpunkt einer Standard-Glaskapillare von einem Millimeter drei bis sechs Sekunden lang über ein Bunsenfeuerzeug und ziehen Sie langsam an beiden Enden, bis die Kapillare dünn und flexibel wird. Brechen Sie dann die Kapillare in zwei Hälften und erhitzen Sie sie kurz, um eine 90-Grad-Biegung zwei Zentimeter von der Spitze entfernt zu erzeugen. Säge ein Stück Polymethylmethacrylat mit einer Länge von etwa sieben Millimetern, einer Breite von vier Millimetern und einer Dicke von zwei Millimetern.
Halten Sie das Methacrylatstück mit einem Schraubstock fest und bohren Sie dann maßgeschneiderte Löcher quer durch das gesamte Stück. Drehen Sie den Bohrer langsam und üben Sie dabei einen niedrigen, aber konstanten Druck aus. Verwenden Sie eine feine Feile, um die Kante des Halters zu glätten und seine Größe anzupassen.
Erstellen Sie außerdem eine leichte Neigung an den Rändern des Halters, um die Positionierung des Embryos zu erleichtern. Legen Sie den fertigen Halter zum Abspülen in eine Schüssel mit destilliertem Wasser. Überprüfen Sie unter dem Stereomikroskop die Halterung, um festzustellen, ob die Löcher Bohrstaub enthalten.
Wenn Staub vorhanden ist, verwenden Sie Wolframnadeln, um ihn zu entfernen. Um den Halter zu sterilisieren, legen Sie ihn in ein konisches Röhrchen mit destilliertem Wasser und beschallen Sie ihn 20 Minuten lang mit einer Leistung von mindestens 20 Watt. Extrahieren Sie die Gebärmutter einer euthanasierten embryonalen Maus mit 6,75 bis 7,5 schwangeren Tagen und legen Sie sie auf ein trockenes und sauberes Papiertuch.
Schneiden Sie dann die Gebärmutter ab, führen Sie die Spitze einer feinen Schere von der mesometrialen Seite ein und schieben Sie die Klinge entlang, um die Decidui freizulegen, und übertragen Sie sie auf das Dissektionsmedium. Sezieren Sie die Embryonen und halten Sie den ektoplazentaren Kegel intakt. Ziehen Sie dann die Reichter-Membran ab und lassen Sie einen Teil davon auf der zusätzlichen embryonalen Region.
Um die Dissektion mittelwarm zu halten, ersetzen Sie sie alle 10 Minuten. Darüber hinaus wird decidui in Gruppen von drei bis vier Personen präpariert, während der Rest in einem Dissektionsmedium aufbewahrt wird, das in ein 37-Grad-Celsius-Bad gestellt wird. Legen Sie die sezierten Embryonen sofort in ein Nährmedium.
Wählen Sie die Embryonen mit den gewünschten Fluoreszenzmerkmalen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop aus und legen Sie sie in das Röhrchen mit dem Kulturmedium im Zellkulturinkubator, um sich zwei Stunden lang vor der Bildgebung zu erholen. Schalten Sie nach dem Einschalten aller Mikroskopkomponenten, einschließlich Computer, Software und Laser, den Kohlendioxidregler ein und stellen Sie ihn auf 7% Legen Sie einen Tropfen Hochvakuum-Silikonfett auf eine 35-Millimeter-Schale mit einem Glasdeckelboden. Legen Sie den Halter auf den Tropfen und drücken Sie ihn vorsichtig, um ihn zu immobilisieren.
Übertragen Sie für die Embryonenmontage zwei bis drei Embryonen aus dem Inkubator mit einem Halter in die Schale. Setzen Sie die Embryonen mit einer Pinzette und einer sich verjüngenden Wolframnadel in die Löcher. Verwenden Sie die Nadel, um den Embryo am ektoplazentaren Kegel einzuhaken und in ein größengerechtes Loch einzuführen.
Bewegen Sie die Schale mit den Embryonen und dem Halter vorsichtig auf die Mikroskopplatte. Senken Sie das Objektiv ab, bis sich an der Grenzfläche des mittleren Objektivs ein flüssiger Meniskus bildet. Nachdem Sie den Embryo scharf gestellt haben, montieren Sie die Inkubationskammer und verschließen Sie sie mit Klebeband um das Objektiv.
Passen Sie mithilfe einer Live-Aufnahme in der Mikroskopsteuerungssoftware die Laserleistung und die Verstärkungspegel an. Decken Sie dann das Medium mit Paraffinöl ab, indem Sie es langsam auf das Objektiv tropfen. Richten Sie eine Zeitrafferaufnahme ein.
Stellen Sie ein Intervall von fünf bis 10 Minuten mit einem Z-Abstand von drei bis fünf Mikrometern zwischen den Stapeln ein. Lassen Sie eine Leerstelle auf dem Z-Stapel, um das Wachstum des Embryos zu antizipieren. Ein Minimum von 50 Mikrometern, das Hinzufügen von 30 Mikrometern für jede Stunde, in der die Erfassung nicht überwacht wird.
Aktivieren Sie die Option "Automatisches Speichern", um die Überwachung der Erfassung von einem Computer aus zu ermöglichen, damit die Z-Stack-Größe bei Bedarf angepasst werden kann, um den interessierenden Bereich in den Fokus zu bringen. Gezeigt wird die Lebend-Ganzkörper-Embryo-Herz-Entwicklung durch Multiphotonen-Bildgebung. Am embryonalen Tag 7,5 ist eine venöse Fluoreszenz im gesamten neuralen Ektoderm vorhanden, mit einigen positiven Kernen am splanchnischen und extraembryonalen Mesoderm.
Nach vier Stunden aktivieren endotheliale Vorläuferzellen venös und setzen sich zu einem Endokardrohr und den darunter liegenden Aorten zusammen, die nach sieben Stunden zu geschlossenen Strukturen werden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Reichtermembran entfernen. Es kann wirklich am Embryo kleben, besonders in den Stadien vor dem Schwanken.
Versuchen Sie während des Entfernens, die Membran an der zusätzlichen embryonalen Region einzuklemmen.
