Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01-CA169354 unterstützt &#160; und R01-047822 &#160; von den National Institutes of Health und Merit Award aus dem Department of Veterans Affairs (EZB). RKP wurde vom NIH T32 CA009287-30A1, einem ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship, und ein American Cancer Society Mentorierte Forschung Scholar Grants unterstützt; BAZ wurde vom NIH Zuschusses AI079320 unterstützt. JM wurde von Stipendien von NIH T-32 Ausbildungsförderung T32-AI07290- 25. T32-AI07290-24 und American Cancer Society Post-Doc-Stipendium PF-12-052-01-CSM unterstützt.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Stanford, Palo Alto VA HCS und National Institutes of Health Institutional Animal und Verwenden Ausschuss Leitlinien. 1. Vorbereiten der Probengewinnung und Verarbeitung (Zeitaufwand: ~ 10-15 min) <ol><li> Inokulieren murine B16F0-Melanomzellen (0,5-1 x 10 6) subkutan an oder nahe der Mittellinie des Bauches in weibliche C57BL / 6-Mäusen, wie zuvor 6 beschrieben. Alternativ inokulieren Tumorzellen an zusätzlichen anatomischen Stellen (zB Flanke Brustfettpolster, etc.). HINWEIS: Eine beliebige Anzahl von Tumoren (implantiert oder spontane) verwendet und ausgewertet werden mit diesem Protokoll. Beispielsweise können andere häufig verwendete syngenen Tumoren in C57BL / 6 sind die Doppelpunkt Linie MC38, Lewis-Lungenkarzinom (LLC) und die Prostata TRAMP-C2 Linie. Während menschlichen Xenotransplantaten in immundefiziente Mäuse inokuliert können auch auf diese Weise ausgewertet werden, sei darauf hingewiesen, dass die profiles der Tumor-infiltrierenden Leukozyten wird notwendigerweise gemß der immundefiziente Zustand des Host-Maus verändert werden. <ol><li> Verwenden Sie Vollmedien (zB RPMI mit 10% FBS und Additive) oder einem anderen geeigneten Protein-Puffer (zB HBSS oder PBS + 1% FBS oder 1% BCS). Chill-Medien oder Puffer auf 4 ° C vor der Euthanasie. </li></ol></li><li> Up Sammelröhrchen und Filter für resezierten Tumoren gesetzt; legen diese auf Eis. <ol><li> Verwenden Sie eine 50 ml konischen Röhrchen pro Tumor reseziert werden. Legen Sie eine 40-70 um Zellsuspension Filter in jedem. Alternativ können Sie auch 15 ml konische Röhrchen mit Metallfiltergewebe. Verwenden Sie ein 5 ml Spritzenkolben oder dicken Stift, um einen becherförmigen Filter an der Spitze der 15-ml-Tube erstellen. </li></ol></li><li> Bereiten Instrumente zur Resektion und Tumor Verarbeitung; benutzen chirurgische Pinzette und einer feinen Schere zu resezieren und Prozess Tumoren. Verwenden Sie 70% Ethanol zu reinigen Instrumente zwischen Resektionen / Tumorproben. Für größere Zahl of Proben (zB&gt; 10), empfehlen wir die gleichzeitige Verarbeitung von Proben, die von mehreren Forschern, signifikante Unterschiede in der Verarbeitungszeit zwischen Tumorproben zu vermeiden. </li></ol> 2. Tumorentfernung (Zeitaufwand: ca. 5 min / Tumor) <ol><li> Euthanize B16 tumortragenden Mäusen einzeln mit Kohlendioxid oder einem anderen zugelassenen Verfahren. </li><li> Sichern Sie die Maus auf eine chirurgische Bühne. Sprühen Sie den Tumorbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie überschüssiges aus; dies hilft, die Verbreitung von gegenwärtigen Haare zu verhindern. Für Nicht-Nacktmäusen, Rasur die Haut Gebiet rund um den Tumor vor der Resektion nach Bedarf. </li><li> Mit einer Pinzette und Schere, Resektion des subkutanen Tumor en bloc, einschließlich darüber liegenden und der umgebenden Haut. Die Höhe der &quot;margin&quot; Haut aufgenommen variiert werden kann, aber in der Regel 2-3 mm reseziert der Haut um den Tumor. <ol><li> Wiegen resezierten Tumoren (+/- umgebende Haut) an dieser Stelle. Legen Sie die reseziert Haut / Tumorbereich im Filter im pl gesichertastic konischen Rohr. </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung einer einzelnen Zelle Tumor Suspension (Zeitaufwand: ~ 5-7 min / Tumor) <ol><li> Verwenden einer Pinzette und Schere, um Tumor und darüberliegenden / umgebende Haut Blatt vor den Mund. Mince die Probe mit einer Schere, bis alle großen Teilen von Gewebe werden in 1-2 mm Abschnitte verarbeitet. Hinweis: In der Regel ganze Tumoren verarbeitet werden; Alternativ kann für größere Tumore, repräsentativen Schnitten von Tumoren konnte zerkleinert und verarbeitet werden. </li><li> Verwendung eines Kolbens aus einem Wegwerf 5 oder 10 ml-Spritze, mechanisch disaggregiert des zerkleinerten Tumorgewebe gegenüber dem gesicherten Filter. </li><li> Mit einer Pipette, waschen Sie die verarbeitet Tumorgewebe mit 5-10 ml kaltem Medium oder Puffer. Dadurch werden die einzelnen Zellen durch den Filter zu spülen. </li><li> Wiederholen der obigen zwei Schritte mehrmals, so dass die Gesamtanzahl und die Mengen der Wasch etwa gleich sind für ähnlich großen Tumoren. <ol><li> Nach dem Waschen der verarbeiteten Tumorgewebe beobachtenkleine Fragmente von Haut und / oder anderes Bindegewebe, sollte bei dem Filter verbleiben. </li><li> Alternativ für Tumore, bei denen mechanische Disaggregation allein nicht ausreichend sein, die Verdauung mit Collagenase und / oder andere Enzyme können vor dem Zerkleinerungsverfahren durchgeführt werden. Dies wird für eine gründlichere Einzelzellsuspension zu ermöglichen. Es sollte jedoch angemerkt, dass derartige Verdauung Protokolle können Oberflächenantigen-Expression 20 beeinflussen, so dass Vorsicht ist bei der Interpretation dieser Ergebnisse gemacht werden kann. </li></ol></li><li> Waschen und Pellet die Zellen durch Zugabe von Medien / Puffer und Zentrifugation bei 4 ° C 500 xg für 5 min. </li></ol> 4. FACS Färbung der Einzelzellsuspension (Zeitaufwand: ~ 30-60 min) <ol><li> Die Zellen in eiskaltem FACS-Puffer (PBS + 1% FBS). </li><li> Graf lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Hämozytometer oder automatisierten Zellzählers. </li><li> Bestimmen Sie die Gesamtkeimzellausbeute pro Volumen. Diese Daten können verwendet werden, um zu extrapolierenabsolute Zahlen tumorinfiltrierender Leukozyten in Kombination mit FACS-Daten. </li><li> Bestimmen der Anzahl von Zellen, gefärbt und durch FACS analysiert. Dies wird durch verschiedene Faktoren (zB Tumorhistologie Typ, Tumor Alter und Größe, durchschnittliche Prozentsatz der infiltrierenden Leukozyten, etc.) beeinflusst werden. HINWEIS: In B16 Melanom, fanden wir einen geringen Prozentsatz an Tumor-infiltrierenden Leukozyten (TIL, typischerweise &lt;5%) im Vergleich zu Tumorzellen. Somit sind zumindest 1 x 10 6 gesamt (Tumor infiltrierenden Leukozyten +) Zellen wurden typischerweise über FACS zur Analyse gesammelt. <ol><li> Mit Hilfe der Trypanblau gefärbten Zähldaten, um berechnete Volumen von Zellen für FACS gefärbt werden. Wenn zum Beispiel TIL machen typischerweise 5% der Gesamttumorzellen (viele der Tumorzellen tot auf Trypanblau-Färbung sein kann), um Faktor dieses in der Gesamtzahl der Tumoreinzelzellsuspension gefärbt. </li><li> Für weniger häufig Leukozytenuntergruppen zB CCR9 + PDC) verwenden, eine größere Anzahl von insgesamt Tumorzellen (Beispiel 2-3 x 10 6) für die FACS-Färbung, angesichts der relativ geringen Häufigkeit dieser Zellen in der Einzelzellsuspension. </li></ol></li><li> Färben Sie das Tumoreinzelzellsuspension für FACS. <ol><li> Für Live / Dead-Diskriminierung, verwenden Sie eine fixierbare Fleck oder nicht feststellbar Fleck (zB Propidiumiodid) verwendet werden. Wenn Zellen ohne Live / Dead Diskriminierung gebeizt, muss Vorsicht geboten gegeben werden das Potenzial für nicht-spezifische Bindung von Antikörpern. </li><li> Flecken auf der Zellsuspension für spezifische Leukozyten-Untergruppen mit einem Standard-FACS-Färbung Protokoll. Block-Zellen auf nicht-spezifische Antikörperbindung mit PBS / FBS, das 1% Rattenserum und Fc Block (anti-CD16 / 32) für 10 Minuten vor der Antigen-spezifische Antikörper-Färbung zu vermindern. Fügen Sie die richtigen Isotypenkontrolle Antikörper, um sicherzustellen, Färbung spezifisch ist. </li><li> An diesem Punkt, nachdem der FACS-Färbung abgeschlossen ist, zu fixieren Proben mit 4% Formaldehyd oder ähnliche Fixiermittel. Proben bei 4 ° C in der dark (wie zum Abschrecken der Fluorophore zu vermeiden) werden bis zur Sammlung und Analyse. HINWEIS: Speichern fester Proben für lange Zeiträume kann zu einer Veränderung in der Signalstärke und der Fluorophore 21 führen. </li><li> Sammeln Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer. Optimale Durchflusszytometer Einstellungen werden je nach Art des Instruments und Laser / Detektor-Setup ändern. HINWEIS: Zusätzlich kann es Variabilität zwischen Experimenten auch bei Verwendung der gleichen Maschine sein. So führen Sie die entsprechenden Maschineneinrichtung (zB mit der Kalibrierung Perlen) eine angemessene Entschädigung Einstellung vor der FACS Sammlung und Analyse von jedem Versuch zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Analyse leukoctye Teilmengen <ol><li> Mit FACS Datenanalyse-Software, die Daten zu analysieren. Für eine lebend / tot-Färbung, starten durch Gating aus toten Zellen. Verwenden Sie Antikörpers gegen ein Leukozyten-spezifischer Marker (zB Anti-CD45) auf Leukozyten innerhalb der lebenden Zellen zu identifizieren. <ol><li> Danach verwenden verschiedene gating Systemen an bestimmte Untergruppen zu identifizieren, in Abhängigkeit von dem Färbungsprotokoll. Um beispielsweise CD4 + T-Zellen zu identifizieren, wählen Sie die SSC lo Region aus der CD45 + Population und wählen Sie die CD19-CD3 + Zellen; aus dieser CD4 + T-Zellen identifiziert werden, 22. </li></ol></li><li> Analysieren von Daten und präsentieren sie in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, um die Konsistenz zu gewährleisten und bestimmte Muster oder Trends (dh, Gesamtzahlen, Prozentsätze oder Verhältnisse auf Teilmengen zu quantifizieren). HINWEIS: Zum Beispiel haben wir uns mit Gesamtlebend CD45 + Zellen in Prozent der Gesamttumorzellen gesammelt (Abbildung 1). Zusätzlich haben wir dann den prozentualen Anteil der einzelnen Leukozyten-Untergruppe (beispielsweise CD4 + T-Zellen) innerhalb des Tumors berechnet und diese als Verhältnisse zwischen den Kontroll- und Testgruppen (Abbildung 3). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Darstellende detaillierte Analyse der Tumor-Mikroumgebung ist kritisch bei der Bestimmung der Mechanismen und Wirkungen der Immunmodulation. Mit der zunehmenden Anwesenheit von Immuntherapeutika in der menschlichen klinischen Bereich, das Verständnis der Auswirkungen dieser Mittel auf die Tumor-infiltrierenden Leukozyten immer erforderliche in ihrem Wirkmechanismus definieren. Beim Menschen gibt oft existieren klinische und / oder logistischen Schwierigkeiten bei der Beschaffung und Analyse von Tumorgewebe für die Leu...

Die Balance zwischen Tumorwachstum und die Förderung und Regression ist, teilweise abhängig von der Balance zwischen pro- und anti-Tumor-infiltrierenden in der Mikroumgebung 1,2 vorhanden Leukozyten. Um die Tumorumgebung zu studieren (TME) und spezifisch identifizieren infiltrierenden Leukozyten-Subpopulationen, ein Verfahren zur Auswertung von subkutanen Tumoren entwickelten wir in einem Mäusetumormodell. Die Bedeutung der Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung ist gut bekannt und in der Literatur gestützt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Gleichgewicht von pro- und anti-Tumor-infiltrierenden Immunzellen können die Ergebnisse der das Tumorwachstum nicht nur in der Maus, sondern auch Studien am Menschen (in 3,4 prüft) auswirken. B. Curiel et al. Zeigten, dass verschlechterten klinischen Ergebnisse bei Eierstockkrebspatienten wurden mit der Anwesenheit von steigenden Prozent tumorinfiltrierender regulatorischen CD4 + T-Zellen (Treg) 5 korreliert. Unsere eigene Arbeit zeigte auch die Wirkung eines nichtvel Leukozyten Chemolockstoff auf dem Verhältnis der Leukozyten-Untergruppen in einem Maus-Melanom-Modell 6, die ebenfalls korreliert mit verringerten Tumorwachstum. Somit werden die detaillierten Analysen der Leukozyten-Untergruppen innerhalb eines Tumors nun allgemein anerkannt und mehr an Bedeutung. Es gibt viele Möglichkeiten, um die Tumor-Mikroumgebung für das infiltrierende Leukozyten zu bewerten; zB Gruppen transgenen Mäusen entwickelt, um verschiedene fluoreszierende Proteine, um Bild die TME 7, klassische Immunhistochemie und Immunfluoreszenz der erhaltenen Abschnitte 8, einschließlich der verschiedenen bildgebenden Verfahren wie MRI, PET, konfokale Mikroskopie 9-11 Ausdruck bringen - einige mit der Möglichkeit, intravital 10,12 überwachen. Diese können mit verschiedenen molekularen Bildgebungsmittel, wie Nanopartikel 13 oder neuartige Kontrastmittel 14, die Immunzellen Etikett verwendet werden. Unsere Methode ist eine Durchflusszytometrie-basierten Ansatz und hat mehrere Vorteile.Erstens kann der gesamte Tumor-Mikro abgetastet werden; bei der Analyse wird das gesamte subkutane Tumor und dem umgebenden Peripherie operativ zum Verarbeiten reseziert. Dies beseitigt jegliche potentiell Abtasten Bias innerhalb eines einzigen Tumor und gibt eine &quot;globale&quot; Analyse des Tumors als Ganzes. Zweitens, mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie, um die Leukozyten-Untergruppen analysieren, ermöglicht es uns, genauer zu messen den Phänotyp infiltrieren Leukozyten. Abhängig von der Anzahl der verwendeten Farben können sehr spezifische Untergruppen identifiziert werden. Dies ist wichtig, da es mehrere Leukozyten-Untergruppen in einem bestimmten Zelltyp - oder gar in einem allgemeinen Untertyp Klassifizierung - die unterschiedlichen Funktionen, die bei der Bestimmung des Schicksals des Tumors potenziell signifikante sind zu haben. Zum Beispiel haben plasmacytoid dendritischen Zellen (PDC) in Tumorimmunität 15 in Verbindung gebracht. Jedoch ist die CCR9 + Untergruppe von pDCs wurde gezeigt tolerogenen 16 sein, und Verschieben des baLanze einer solchen Untergruppe kann einen Einfluss auf das Tumorwachstum. Unsere Methode ist für die subkutane oder andere Tumoren, die en bloc reseziert werden können, geeignet. In unseren Händen, wurden Tumoren einheitlich zum Zeitpunkt der Euthanasie reseziert. Jedoch ist es denkbar, wie in einigen Studien durchgeführt worden, daß eine subkutane Tumor konnte vollständig Verschluss der umgebenden Haut in einem Überlebens Operation 17 reseziert werden, was eine zusätzliche Auswertung des Tieres. Die Analyse wird dann an der resezierten Tumorgeführt. So sind die Ergebnisse stellen einen einzigen Zeitpunkt in der Entwicklung des Tumors. Während dies ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Mikroumgebung, es ist auch ein statisches Bild von dem, was ist ohne Zweifel ein dynamischer Prozess. Jedoch isolierten Leukozyten (zB über magnetische Trennung oder Dichtegradientenzentrifugation) können dann separat von der Tumor Epithel und Stroma analysiert werden, oder in anderen, funktionelle Assays verwendet werden, um ihr Erscheinungsbild weiter zu definieren, wie bereits Previ hatlaufend beschrieben 18. Dieses Verfahren wäre dann nützlich irgendeinem Forscher interessiert die Analyse der Zusammensetzung der Leukozyten innerhalb der Tumormikroumgebung zu einem gegebenen Zeitpunkt zu sein, ob die Einstellung des natürlichen Krankheitsverlaufs oder nach einer bestimmten therapeutischen Störung. Obwohl nicht von uns durchgeführt, könnte Variationen dieses Verfahrens möglicherweise auch verwendet, um bestimmte Abschnitte eines Tumors in Isolation zu analysieren. Beispielsweise in Anbetracht der Größe des Tumors, die Randzone (n) kann von der zentralen, ggf. nekrotischen Kern des Tumors präpariert eine räumlich getrennte Ansicht der Tumor-Mikroumgebung, die Forscher zu ergeben. In dem aufstrebenden Gebiet der Tumorimmunologie, gibt es keinen Zweifel, eine exponentiell wachsende Anzahl von Studien zur Bewertung neuartiger immunmodulatorischer Wirkstoffe in murinen Tumormodellen sein. Mehrere Berichte haben die Unterschiede in bestimmten Leukozyten-Funktion innerhalb des Tumors gegenüber dem peripheren en hervorgehobenUmwelt. Beispielsweise Shafer-Weaver et al. Zeigten, in einem Mausmodell, das Antigen-spezifischen T-Effektorzellen CD8 + Zellen, während in der Peripherie aktiv, wurden in CD8 + T-Suppressor-Zellen umgewandelt werden, wenn sie in die Tumorumgebung 19 verschleppt. Dies war teilweise auf TGFß, aber andere Faktoren sind wahrscheinlich ebenso beteiligt. Somit Auswerten Leukozytenuntergruppen - Zahlen und Verhältnisse sowie Funktionszustand - im Tumor selbst wird eine genauere Darstellung der Wirkung eines bestimmten Immunmodulation auf Tumor Schicksal. Unsere Technik erlaubt eine detaillierte Analyse des Tumors und stellt dem Forscher die Möglichkeit, Veränderungen in der Leukozyten-Populationen als frühere Ansätze genauer identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:229px;">Company</td>
			<td style="width:229px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:229px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>http://cellgro.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-823-35</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical scissors/forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td>roboz.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-21-030-CM</td>
			<td>http://cellgro.com; keep on ice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trypan blue</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientifice&#160;</td>
			<td>02-671-54&#160;</td>
			<td>fischersci.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td>lieftechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo software</td>
			<td>TreeStar, Inc</td>
			<td></td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of tumor-infiltrating leukocyte subsets in a subcutaneous tumor model

Spezialisierten Immunzellen, die Tumorumgebung infiltrieren regulieren das Wachstum und Überleben von Neoplasie. Maligne Zellen müssen entziehen oder zu untergraben Anti-Tumor-Immunantwort, um zu überleben und zu gedeihen. Tumoren profitieren Sie von einer Reihe von verschiedenen Mechanismen der Immun &quot;Escape&quot;, einschließlich der Rekrutierung von tolerogenen DC, immunsuppressive regulatorischen T-Zellen (Tregs) und myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), die zytotoxische Antitumor-Reaktionen hemmen. Umgekehrt können Anti-Tumor-Effektor Immunzellen das Wachstum und die Ausdehnung von malignen Erkrankungen verlangsamen: immunstimulatorische dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, die angeborenen Tumorimmunität beherbergen, und zytotoxischen T-Zellen alle in der Tumorsuppression beteiligt. Die Balance zwischen pro- und anti-Tumor-Leukozyten letztlich bestimmt das Verhalten und das Schicksal der transformierten Zellen; eine Vielzahl von klinischen Studien am Menschen haben dies getragen heraus. Somit detaillierte Analyse Leukozytenuntergruppen innerhalbder Tumor-Mikroumgebung ist zunehmend wichtig geworden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Analyse infiltrierenden Leukozyten im Tumormikromilieu in einem Maus-Tumormodell vorhandenen Teilmengen. Maus-B16-Melanomtumorzellen wurden subkutan in C57BL / 6-Mäuse inokuliert. Zu einem bestimmten Zeitpunkt, wurden Tumoren und der umgebenden Haut en bloc reseziert und in Einzelzellsuspensionen, die dann für die Multi-Farb wurden Durchflusszytometrie verarbeitet. Mit einer Vielzahl von Leukozyten-Untergruppe Marker, konnten wir die relativen Prozentsätze der zu infiltrieren Leukozyten-Untergruppen zwischen Kontrolle und Chemerin-exprimierenden Tumoren zu vergleichen. Forscher kann ein solches Werkzeug zu verwenden, um die Immun Anwesenheit im Tumor-Mikroumgebung und als mit herkömmlichen Sattelgrößenmessungen von Tumorwachstum in Verbindung, wird möglicherweise damit sie die Auswirkungen von Veränderungen der Immunzusammensetzung auf das Tumorwachstum zu erhellen studieren. Eine solche Technik kann auf jede Tumormodell angewendet werden, in dem der Tumor und seiner Mikro cein reseziert und verarbeitet werden.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Überexpression von Chemerin in murine B16-Tumoren gezwungen Augmented den Prozentsatz an Tumor-infiltrierenden Leukozyten (TILs). Zusätzlich Änderungen des relativen Verhältnisses der Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung Chemerin Expression assoziiert dargestellt wurden identifiziert. Re-Print mit Erlaubnis von Pachynski et al. 6. 1 zeigt, dass es eine signifikante Zunahme der gesamten CD45 + Zelle...

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Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

evaluation-tumor-infiltrating-leukocyte-subsets-subcutaneous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses. 

Serie: Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Nierenkapsel Xenografting und subkutane Implantation Pellet für die Beurteilung von Prostata-Karzinogenese und benigne Prostatahyperplasie

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 - 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Subcutaneous implantation of osmotic pumps provides a convenient approach for prolonged and consistent delivery of compounds. This approach has been used extensively to study both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice.

Subkutane Angiotensin-II-Infusion mit osmotischen Pumpen induziert Aortenaneurysmen bei Mäusen

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals.  This article introduces a standard protocol used to induce aortic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Standardisierte histomorphometrische Bewertung von Osteoarthritis in einem chirurgischen Mausmodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...