This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

Das folgende Protokoll beschreibt Techniken für die Untersuchung der frühen Endothelzellmigration. Die richtige Pflege der vaskulären Endothelzellen erfordert pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen mit Gelatine, um die ordnungsgemäße Verbreitung und Aufrechterhaltung eines endothelialen Phänotyp zu gewährleisten. 1. Pre-Beschichtung von Zellkulturflaschen <ol><li> Auflösen Gelatine in 0,1 M PBS auf eine Endkonzentration von 0,1%. </li><li> Autoklavieren Sie die Lösung mit Parametern für flüssige Autoklavieren (Details siehe Anleitung der spezifischen Autoklav). </li><li> Gebe ausreichend Volumen des autoklavierten Gelatinelösung in eine sterile Zellkulturflasche (beispielsweise zumindest 5 ml einer T25 Zellkulturflasche). </li><li> Übertragen Sie die Flaschen in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 nicht erforderlich, aber nicht stört) für mindestens 30 min. </li><li> Entfernen Sie die verbleibende Gelatine-Lösung. Verwenden Sie die vorbeschichtete Kolben anschließend (siehe Zellkultivierung) oder sriß unter sterilen Bedingungen bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Zellkultur der frühen Endothelzellen Hinweis: embryonalen Stammzellen abgeleitet frühen Endothelzellen (EWG) wurden von differenzierten murine embryonale Körper durch magnetische Zellsortierung der PECAM-1-positive Zellfraktion, wie zuvor beschrieben, erhalten 10,11. <ol><li> Kultur EWG Gelatine beschichtete Zellkulturschalen in DMEM, ergänzt mit 15% FCS, 50 U / ml Penicillin, 50 U / ml Streptomycin, 200 &amp; mgr; M L-Glutamin, 100 &amp; mgr; M ß-Mercaptoethanol und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren. Griff Zellen unter sterilen Bedingungen. Kultivieren der Zellen mit 5% CO 2 bei 37 ° C und 95% Feuchtigkeit bis Subkonfluenz (max. 80%). </li><li> Bei Subkonfluenz, teilen Sie die Zellen bei einer 1: 5-Verhältnis. Anmerkung: Ablösung der Endothelzellen ist ein kritischer Schritt. <ol><li> Ernten Sie die Zellen, die mit RT Accutase. Entfernen Sie die Medien, Spülen mit PBS und 1 ml Accutase pro 25 cm <sup&gt; 2. </li><li> Der Kolben wird bei RT inkubieren 2-10 min, bis die Zellen abgelöst. Dispergieren der Zellen und sie auf die gewünschte Anwendung. Anmerkung: Eine chemische Neutralisation des Accutase ist nicht erforderlich, wie es stattfindet, wenn die angesiedelten Zellen werden im Brutschrank bei 37 ° C gelagert. Jedoch kann Accutase Aktivität auch durch Zugabe DMEM FCS verringert werden. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Chamber Hinweis: Boyden-Kammer-Tests werden unter Verwendung von lichtundurchlässigen Polyethylenterephthalat Einsatzsystemen mit 8 &amp; mgr; m Porengröße durchgeführt. <ol><li> Precoat- die Filtereinsätze (dh passen in Zellkulturvertiefungen wodurch eine Boyden-Kammer), die durch Zugabe von 500 ul 0,1% Gelatine in 0,1 M PBS für mindestens 30 min. </li><li> Wenn Zellen mit toxischen Chemikalien ausgesetzt werden sollen, ausgesetzt werden entsprechend der speziellen Versuchsdesign vor der Zellernte. Anmerkung: Die Zellen wurden auf 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM ausgesetzt24 h. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren. </li><li> Ernte EWG und bestimmen die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. Hinweis: Die automatische Zählgeräte verwendet werden, sollte aber mit Vorsicht verwendet werden: manuelle Zellzählung ist genauer und ist sehr zu empfehlen. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l Zellkulturmedium in die untere Kammer Raum des Boyden Chamber. </li><li> In genau 10 4 EWG in 500 ul Zellkulturmedium pro Filtereinsatz in der oberen Kammer Fach. Beseitigen Sie Luftblasen. </li><li> Inkubieren Sie die Filtereinsätze in den Inkubator für genau 8 Stunden. </li><li> Spülen mit PBS einmal und ersetzen Sie das Medium mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in beiden Fächern für 25 min für die Zellfixierung. Das Filter ausgiebig waschen, aber mindestens 3-mal mit 0,1 M PBS. </li><li> Verbrauchsteuern, die Membranen mit einem Skalpell. </li><li> Montieren Sie die Membran zwischen zwei Glasplättchen mit Eindeckmedium enthält DAPI zur Kern staining. Achten Sie auf die Ausrichtung. Sicherzustellen, dass nur Zellen, die in Richtung der unteren Kammer der Membran gewandert sind, gezählt. </li><li> Zählen von Zellen, die in Richtung der unteren Abteilseite der Membran mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 400-facher Vergrößerung gewandert sind. Nicht zu verwechseln Membranporen mit migrierten Zellen (1A, 1B). Untersuchen Sie eine angemessene Anzahl von biologischen Replikaten (mindestens 3 biologischen Wiederholungen pro Bedingung). </li></ol> 4. Wundheilung Assay <ol><li> In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt. Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden. </li><li> Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging), Bis 80% Zusammenfluss. Wichtig: nicht kultivieren die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen. </li><li> Rubbeln Sie an der Monoschichten mit 10 ul sterile Pipettenspitzen. Schieben Sie die Spitze vorsichtig ohne zu viel Druck auf der Geschirroberfläche und verschieben Sie sie in einer geraden Linie sanft von einer Seite auf die other.Wash die Zellen zweimal mit 0,1 M PBS, um abgelösten Zellen zu entfernen. </li><li> Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Mediums in die Kulturschale. Falls zutreffend, fügen Sie Verbindungen, die untersucht werden sollten. Anmerkung: 1.5 ml Medium, enthaltend 15 ng / ml Alpha-Linolensäure zugegeben. </li><li> Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging. Sicherzustellen, 5% CO 2, 37 ° C und feuchter Atmosphäre. Anmerkung: Die Befeuchtung ist besonders wichtig, mittlere Verdunstung zu vermeiden. </li><li> Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden bei 10 min-Takt. Plan für große Dateigrößen. Hinweis: Eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln ist in der Regel ausreichend; Wir empfehlen jedoch die Verwendung von Bildern von mindestens 1.024 x 1,024. </li><li> Messen Sie die Spaltbreite bei t = 0 h und bei t = 24 h unter Verwendung des Werkzeuglänge der Software mit dem Mikroskop geliefert oder verwenden Sie Open-Source-Software (zB ImageJ). Anmerkung: In der Regel spezifische Bilderfassung und -analyse-Software wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. Daher ist für technische Details in Bezug auf die Verwendung der Software finden Sie in der Bedienungsanleitung. </li></ol> 5. Zelltracking <ol><li> In Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung, sorgfältig auswählen, die Zellkulturschalen oder Platten: Bei der Verwendung von DIC-Mikroskopie, zu vermeiden Kunststoffoberfläche basierend Kulturschalen oder Well-Platten, sondern verwenden Glas basierten Geräten statt. Hinweis: Bei Verwendung Phasenkontrastmikroskopie, können Kunststoffgerichten verwendet werden. </li><li> Seed 5 × 10 4 EWG in DMEM ergänzt in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (beispielsweise 24-Multiwell-Platte) und pflegen Sie die Zellen mit 5% CO 2 bei 37 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit für 1-2 Tage. </li><li> Wenn Zellen wurden bis zu einer 80 gewachsen% Konfluenz, entfernen Sie die Medien und Kultur der Zellen mit neuen Medien in Anwesenheit der jeweiligen Testsubstanzen (zB 12,5 ug Chlorambucil / ml DMEM). Immer auch die Kontrollzellen (mit dem Lösungsmittel, zum Beispiel Ethanol behandelt) bei 37 ° C für eine bestimmte Zeitdauer (24 Stunden, abhängig von der individuellen Assay-System). </li><li> Montieren Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop in der Lage, Live Cell Imaging (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit). Erwerben Sie Zeitrafferbilder über 24 Stunden in vordefinierten Intervallen. Erwerben Sie Bilder in 10-Minuten-Intervallen. </li><li> Führen Sie manuell die Verfolgung der EWG durch den Einsatz der ImageJ Plugin MTrackJ. Wählen Sie 10-Zellen nach dem Zufallsprinzip aus dem Sichtfeld und verfolgen ihre Bewegungen, indem Sie einen Datenpunkt pro Punkt in der Zeit mit dem Befehl von MTrackJ &quot;Hinzufügen&quot;. </li></ol> Hinweis: MTrackJ ist kostenlos abrufbar und ImageJ ist availab [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le bei [Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Ein ausführliches Handbuch über die MTrackJ Plugin auf &quot;http://www.imagescience.org&quot; zur Verfügung. 6. Live Cell Imaging / Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials <ol><li> Kultivieren EWG in einem geeigneten Zellkulturvorrichtung (zB 4 cm Glasboden Petrischale für Live Cell Imaging) bis zu einer 80% Zusammenfluss. Wichtig: kultivieren Sie die Zellen bis zur Konfluenz abzuschließen. </li><li> Falls zutreffend, setzen die Zellen gegenüber Chemikalien. Anmerkung: Die Zellen wurden zu 12,5 &amp; mgr; g / ml Chlorambucil 24 h ausgesetzt. Im Hinblick auf die spezifische experimentelle Design können Befehle variieren. </li><li> Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Tetramethylrhodamin (TMRM) in DMSO. Vor Licht schützen. Hinweis: Die Stammlösung kann bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Von der Stammlösung in Zellkulturmedium zu einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 uM (1: 1000 Verdünnung). Vor Licht schützenund die Verwendung als schnell wie möglich. Hinweis: Die Arbeitslösung kann bei Raumtemperatur für einige Zeit (&gt; 1 h) gehalten werden, jedoch Zubereitung eines frischen Arbeitslösung ist sehr zu empfehlen. </li><li> In 2 ul der Arbeitslösung zu 1 ml frisches Zellkulturmedium (Beladungslösung). </li><li> Laden der Zellen durch Austausch des Zellkulturmedium mit der Auftragslösung. Proben für 15 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und befeuchteter Atmosphäre (Brutschrank). Achtung: Fast alle Fluoreszenzindikatoren werden von lebenden Zellen mit der Zeit ausgeführt werden; Daher vermeiden längerer Belastung oder verzögerten Analyse. </li><li> Ohne Waschen, die Schale unter einem geeignet für Live Cell Imaging Mikroskop. Wichtig: Fluoreszenzindikatoren sind sehr lichtempfindlich, daher unnötige Lichtexposition. </li><li> Bilder zu erwerben, ohne die Erfassungsparameter, um die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Bilder zu gewährleisten. </li></ol>

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Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. 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The authors have nothing to disclose.

Dermale Exposition gegenüber giftigen Chemikalien führt oft zu schweren Wundheilungsstörung. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Wundheilung ist ein komplexer Prozess, der aus verschiedenen Phasen (Hämostase, Entzündung, Proliferation und Remodellierung) besteht. Zellmigration in jeder Phase, wie auch immer, ist es von größter Bedeutung für die Bildung von Granulationsgewebe. Hier werden neue Blutgefäße entweder durch Angio- oder Vaskulogenese gebildet. Be...

Zellmigration ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Entwicklung, verschiedene Krankheiten, und die Wundheilung nach Verletzungen der Haut wichtig. Folgende Hautverletzung, Entzündung beseitigt beschädigte oder nekrotische Gewebe und Granulierung Antriebe vorläufigen Wundverschluß und ermöglicht die Bildung eines Netzwerks von Kapillaren durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (Sprießen von vorhandenen Bläschen) 1-3. Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern Migration von Endothelzellen. Die wachsende Netzwerk von Blutgefäßen ist wichtig, um Sauerstoff und Nährstoffe zu proliferierenden Keratinozyten, die letztlich Verhornung unterziehen zu transportieren, bilden eine neue Epithel und bieten Wundverschluss. Beeinträchtigt Migration von Endothelzellen ist eine zugrunde liegende Ursache der Wundheilungsstörung 4,5. Somit Methoden zur Messung der Migration der frühen Endothelzellen sind erforderlich, um die pathophysiol erforschenlogie der Zellmigration Störungen und neue Strategien für die therapeutische Intervention zu identifizieren. Hautexposition Alkylierungsmittel (beispielsweise Schwefel und Stickstoffsenfgas) verursacht Wundheilungsstörung 6. Solche Verbindungen wurden als chemische Kampfstoffe in mehrere Konflikte im 20. Jahrhundert Grund für große Besorgnis wegen der bestehenden Lagerbestände in politisch instabilen Regionen und die relativ einfache Synthese verwendet werden und zu bleiben. Obwohl Senfgas wurde zum ersten Mal im Jahre 1822 synthetisiert wird die molekularen und klinischen Pathologie der SM Exposition nicht im Detail verstanden und kein Gegenmittel für SM Exposition festgestellt wurde. Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu verstehen und zu einer Beeinträchtigung der Wundheilung nach SM Expositionsmodell und für potenzielle Kandidatenverbindungen, die die Reservierung diese Wirkung zu testen. Schmidt et al. (2009) untersucht die Wirkung von Chlorambucil, einem alkylierenden Verbindung mit ähnlich SM in mou Eigenschaftense Embryoidkörper Modelle und fand eine dramatische, manchmal mehr als 99% ige Reduktion der Gefäßbildung 7. Dieser nachteilige Effekt war besonders im Stadium der Entwicklung, die unter physiologischen Bedingungen durch die Proliferation und Migration der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen dominiert ausgeprägt. Somit wurden diese Zellen identifiziert besonders empfindlich Alkylierungsmittel sein. Steinritz et al. (2010) getestet Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), insbesondere N-Acetylcystein (NAC) und Alpha-Linolensäure (ALA) auf ihre Fähigkeit zur SM-Toxizität in der Maus Embryoidkörper Modelle und insbesondere zu verringern, Wiederherstellung Gefäßbildung 8. Temporäre Schutzwirkungen wurden nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass die übermäßige Bildung von ROS wahrscheinlich war, um die negativen Auswirkungen der SM auf die Wundheilung bei. Diese Effekte waren nicht dauerhaft und die zwei Kandidatenverbindungen nicht wiederherstellen kann Gefäßbildung und Wundheilung langfristig 8 sein. However wurden diese Experimente in einem komplexen 3D-Modell, das ermöglicht Untersuchung der Zellmigration haben durchgeführt. So haben wir anschließend getestet NAC und ALA für eine wohltuende Wirkung auf die Zellmigration der EWG, die eine Schlüsselrolle im Prozess der Gefäßbildung 9 haben. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass die Zellpolarität ist für Zellmigration erforderlich. Mitochondriale Dysfunktion, die zu ROS-Bildung wurde gezeigt, dass Zellpolarität beeinträchtigen und somit nachteilig auf die Zellmigration. Daher wurde lebenden Zellen im Hinblick auf die mitochondriale Funktion durchgeführt, und die Wirkungen von ROS-Fänger wurden untersucht. Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeinen Anforderungen für den Anbau von EWG, der Boyden-Kammer-Assay, der Wundheilungsassay einschließlich Zell Tracking-Analyse und den Einsatz von TMRM zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien im Detail. Wichtige Aspekte der Versuchsprotokolle für EWG Anbau und Migration werden hervorgehoben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

Die Exposition gegenüber chemischen Stoffen (einschließlich alkylierende chemische Kampfstoffe wie Schwefel und Stickstoffsenf) führen eine Fülle von klinischen Symptomen wie Wundheilungsstörung. Der physiologische Prozess der Wundheilung ist sehr komplex. Die Bildung von Granulationsgewebe ist ein wichtiger Schritt in diesem Prozess, was zu einer vorläufigen Wundverschluss und die Bereitstellung eines Netzes von neuen kapillaren Blutgefäßen - entweder durch Vaskulogenese (Roman Bildung) oder Angiogenese (sprießen bestehender Schiffe). Sowohl vasculo- und Angiogenese erfordern funktionale, gerichtete Wanderung von Endothelzellen. Somit ist Untersuchung von frühen Endothelzellen (EWG) Migration wichtig, die Pathophysiologie der chemischen induzierten Wundheilungsstörungen zu verstehen und möglicherweise zu identifizieren neue Strategien für die therapeutische Intervention. Wir beurteilen Wundheilungsstörungen nach Alkylierungsmittel Belichtung und getestet potenziellen Kandidatenverbindungen für treatment. Wir haben eine Reihe von Techniken, die in diesem Protokoll beschrieben. A modifizierten Boyden-Kammer, um quantitativ zu untersuchen Chemokinese der EWG beschrieben. Darüber hinaus wird die Verwendung der Wundheilungs Assay in Verbindung mit Gleis Analyse qualitativ beurteilen Migration dargestellt. Schließlich zeigen wir die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs TMRM zur Erforschung des mitochondrialen Membranpotentials zu Grunde liegenden Mechanismen der gestörten Zellmigration zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt grundlegende Techniken, die für die Untersuchung der EWG adaptiert wurden.

Dermale Exposition Alkylierungsmittel provoziert Rötung, Blasenbildung und Hautgeschwürbildung, die mit einer Wundheilungsstörung assoziiert ist. Wundheilung erfordert Angio- und Vaskulogenese, die auf die Migration von Endothelzellen beruhen. Quantitative Migration kann durch die Verwendung des Boyden-Kammer-Assays bewertet werden. Wie in 1C Belichtung EWG zum eingesetzten Alkylierungsmittel Chlorambucil gezeigt führte zu einer signifikanten Abnahme der Zellmigration 9. Neben der ROS-Sca...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Aufrufe.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Serie: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...