This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

다음 프로토콜은 초기 내피 세포 이동의 조사 방법을 설명합니다. 혈관 내피 세포의 적절한 재배 내피 표현형의 적절한 증식과 유지 보수를 보장하기 위해 젤라틴과 세포 배양 플라스크의 사전 코팅이 필요합니다. 세포 배양 플라스크 1. 사전 코팅 <ol><li> 0.1 %의 최종 농도 0.1 M PBS에 젤라틴을 녹인다. </li><li> (자세한 내용은 특정 오토 클레이브의 지침을 참조하십시오) 액체 고압 증기 멸균에 대한 매개 변수를 사용하여 솔루션을 압력솥. </li><li> 무균 세포 배양 플라스크 (T25 세포 배양 용 플라스크 예, 적어도 5 ㎖)을 오토 클레이브 젤라틴 용액의 충분한 양을 추가한다. </li><li> 인큐베이터로 플라스크로 이동 (37 ℃, 5 % CO 2는 필요하지 않지만 방해하지 않는) 적어도 30 분 동안. </li><li> 나머지 젤라틴 용액을 제거합니다. 이후 사전 코팅 된 플라스크를 사용하십시오 (세포 배양) 또는 S사용할 때까지 무균 상태에서 찢었다. </li></ol> 초기 내피 세포의 2. 세포 배양 주 : 앞서 설명 된 바와 같이 10, 11, 배아 줄기 세포 유래의 초기 내피 세포 (EEC)를 PECAM-1 양성 세포 분획의 자기 활성화 세포 정렬하여 차별화 뮤린 배양체로부터 수득 하였다. <ol><li> DMEM에서 젤라틴 코팅 된 세포 배양 접시에 배양 EEC 15 % FCS, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 U로 보충 / ㎖ 스트렙토 마이신, 200 μM L- 글루타민, 100 μM의 ß 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산. 멸균 조건에서 세포를 처리합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 세포를 배양하고, 95 % 습도의 합류 부 (최대. 80 %)까지. </li><li> 5 비율 : 하위 합류, 1에서 세포를 분리. 참고 : 내피 세포의 박리가 중요한 단계입니다. <ol><li> RT의 accutase와 세포를 수확. 용지를 제거 PBS로 씻어 25cm 당 accutase 1 ㎖를 추가 <sup&gt; 2. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 2 내지 10 분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이션. 세포를 분산하고 원하는 응용 프로그램으로 전송합니다. 참고 : accutase의 화학적 중화가 시드 세포는 37 ° C에서 인큐베이터에 저장됩니다 때 발생으로 필요하지 않습니다. 그러나 accutase 활동도 FCS 함유 DMEM을 첨가함으로써 감소 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 보이든 상공 회의소 주 : 보이든 챔버 분석은 8 ㎛의 공경을 갖는 광 불 투과 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 삽입 시스템을 사용하여 수행된다. <ol><li> 프리 코트를 적어도 30 분 동안 0.1 M PBS에 용해시킨 0.1 % 젤라틴의 500 μl를 첨가하여 필터 인서트 (따라서 보이 덴 챔버를 생성하는 세포 배양 웰 내부 그 착용감). </li><li> 세포 독성 화학 물질에 노출 될 경우, 세포를 수확하기 전에 특정 실험 디자인에 따라 노출. 주 : 세포 / ㎖ DMEM 12.5 μg의 클로 노출시켰다24 시간 동안. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 수확 EEC는 카운팅 셀 챔버를 이용하여 세포 수를 확인하고. 참고 : 자동 계산 장치를 사용할 수 있지만,주의하여 사용되어야한다 : 수동 세포 계수가 더 정확하며 강력히 추천된다. </li><li> 보이든 챔버의 하부 챔버 구획에 500 μL 세포 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 상부 챔버 구획에 필터를 삽입 당 500 μL 세포 배양 배지에서 정확히 10 4 EEC를 추가합니다. 거품을 제거합니다. </li><li> 정확히 8 시간 동안 인큐베이터에서 필터 삽입을 품어. </li><li> PBS로 한번 씻어 세포 고정 용 25 분 동안 두 구획에 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 매체를 교체합니다. 광범위하게 필터를 세척하지만 0.1 M PBS로 3 회 이상. </li><li> 메스와 점막을 절제. </li><li> 핵 stainin에 대한 DAPI를 포함하는 설치 매체와 함께 두 개의 유리 커버 전표 사이의 막 마운트G. 방향에주의를 기울이십시오. 멤브레인의 낮은 구획쪽으로 마이그레이션 만 세포가 계산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 400X 배율 형광 현미경으로 막의 하부 구획실쪽으로 이주 셀 개수. 마이그레이션 세포 (그림 1A, 1B)와 막 모공을 혼동하지 마십시오. 생물 복제의 적절한 수 (조건 당 적어도 3 생물 복제)을 조사합니다. </li></ol> 4. 상처 치유 분석 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 라이브 세포 이미징에 적합한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 4cm의 유리 바닥 배양 접시에 적합) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 않습니다. </li><li> 멸균 10 μL 피펫 팁 단일 층을 긁어. 접시 표면에 너무 많은 압력없이 부드럽게 끝을 누르고 분리 된 세포를 제거하기 위해 0.1 M PBS로 세포를 두 번 other.Wash 한 측에서 원활하게 직선으로 이동합니다. </li><li> 배양 접시에 매체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 해당되는 경우, 조사해야 화합물을 추가합니다. 주 : 1.5 mL를 함유하는 배지 15 NG / ㎖ 알파 리놀렌산을 첨가 하였다. </li><li> 라이브 세포 이미징 할 수있는 현미경으로 배양 접시를 탑재합니다. 이산화탄소 5 %, 37 ° C와 가습 분위기를 확인합니다. 주 : 가습 매체 증발을 방지하는 것이 특히 중요하다. </li><li> 10 분 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 큰 파일 크기에 대한 계획. 주 : 512 X 512 픽셀의 해상도가 충분합니다; 그러나, 우리는 적어도 1,024 X 1,0의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다(24). </li><li> 오픈 소스 소프트웨어 (예를 ImageJ에) 현미경 구비 길이 소프트웨어 도구를 사용 = 24 시간 t = 0에서 시간 t와의 갭 폭을 측정하거나 사용한다. 참고 : 일반적으로 특정 이미지 수집 및 분석 소프트웨어의 제조업체에서 제공합니다. 따라서, 소프트웨어의 사용에 대한 기술적 인 세부 사항은 설명서를 참조하십시오. </li></ol> 5. 셀 추적 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 적합한 세포 배양 장치에 보충 DMEM에 5 × 104 EEC 시드 (예, 24 멀티 웰 플레이트), 37 ° C, 1-2 일 동안 95 %의 습도에서 5 % CO 2 세포를 배양. </li><li> 세포는 80까지 성장하는 경우%의 합류는, 각각의 시험 물질의 존재의 미디어와 문화를 새로운 매체를 사용하여 세포를 제거 (예를 들어, 12.5 μg의 클로 람 부실 / ㎖ DMEM). 항상 (개별 분석 시스템에 따라 24 시간)에서 일정 시간 동안 37 ° C에서 (용매, 예를 들면, 에탄올로 처리) 대조군 세포를 포함한다. </li><li> 라이브 세포 이미징 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도) 가능한 현미경 배양 접시를 탑재. 미리 정의 된 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 10 분 간격으로 화상을 취득. </li><li> ImageJ에 플러그인 MTrackJ를 사용하여 수동으로 EEC의 추적을 수행합니다. 시야에서 무작위로 10 셀을 선택하고이 MTrackJ의 명령을 &quot;추가&quot;를 사용하여 시간에 포인트 당 데이터 포인트를 추가하여 그들의 움직임을 추적 할 수 있습니다. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ가에서 무료로 사용할 수 있습니다 및 ImageJ에는 availab입니다 참고 :[Rasband, ImageJ에. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]에서 제작 :. MTrackJ 플러그인에 대한 상세한 매뉴얼은 &quot;http://www.imagescience.org&quot;에서 확인할 수있다. 6. 라이브 세포 이미징 / 미토콘드리아 막의 평가 가능성 <ol><li> 적절한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 라이브 세포 이미징에 적합한 4cm의 유리 바닥 페트리 접시) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 마십시오. </li><li> 해당되는 경우, 화학 물질로 세포를 노출. 참고 : 세포는 24 시간 동안 12.5 μg의 / ㎖의 클로 람 부실에 노출되었다. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 테트라 메틸에 DMSO (TMRM)의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다. 주 : 원액 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> (: 1000 희석 1) 10 μM의 농도로 작동 용액 세포 배양 배지에 원액을 희석. 빛으로부터 보호가능한 한 빨리 사용한다. 주 : 작업 용액은 몇 시간 (&gt; 1 시간) 동안 실온에서 유지 될 수 있지만, 새로운 작동 용액의 조제 추천된다. </li><li> 1ml의 신선한 세포 배양 배지 (로딩 용액)로 작동 용액 2 μl를 추가. </li><li> 로딩 용액으로 세포 배양 배지로 대체하여 세포를로드. 37 ° C, 5 % CO 2 및 가습 분위기 (배양기)에서 15 분 동안 인큐베이션. 주의 : 거의 모든 형광 지표는 시간이 지남에 살아있는 세포 내 보낸; 따라서 오랜 로딩 또는 지연 분석을 피하십시오. </li><li> 세척하지 않고, 살아있는 세포 이미징에 적합한 현미경으로 접시를 놓습니다. 중요 : 형광 지표 따라서, 불필요한 빛 노출을 방지, 빛에 매우 민감하다. </li><li> 다른 이미지 사이의 비교를 위해 획득 파라미터를 변경하지 않고 이미지를 획득. </li></ol>

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B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. 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The authors have nothing to disclose.

독성 화학 물질에 대한 피부 노출은 종종 심한 상처 치유에 장애를 초래한다. 기본 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 상처 치유는 서로 다른 단계 (지혈, 염증, 증식 및 리모델링)로 구성된 복잡한 과정이다. 세포 이동은 그러나, 육아 조직의 형성에 가장 중요하고, 모든 단계에 관여한다. 여기서, 새로운 혈관은 혈관 형성 또는 angio- 의해 하나 형성된다. 두 과정은 전구체 및...

세포 이동은 피부 손상 후 개발, 각종 질병 및 상처 치유 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에 중요하다. 피부 손상에 따라, 염증은 손상 또는 괴사 조직과 육아 드라이브를 예비 상처 봉합을 제거하고 혈관 생성을 통해 새로운 모세 혈관의 네트워크 형성 (소설 형성) 또는 혈관 신생 (기존 소포의 발아) 1-3 수 있습니다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 이동을 필요로한다. 혈관의 네트워크가 증가하는 궁극적 각질화를 받아야 각질 세포 증식에​​ 산소와 영양분을 운반하는 것이 필수적이며, 새로운 상피를 형성하고 상처 봉합을 제공한다. 내피 세포의 손상 마이그레이션 장애 4,5 상처 치유의 근본 원인이다. 초기 내피 세포의 따라서, 방법을 평가하기 위해 마이그레이션 pathophysiol을 탐구하는 데 필요한세포 이동이 ogy 질환 및 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인한다. 알킬화제 (예를 들면, 황 및 질소 머스타드)에 피부 노출 장애 (6) 상처 치유됩니다. 이러한 화합물로 인해 정치적으로 불안정한 지역과 비교적 간단한 합성의 기존 비축에 강한 우려에 대한 이유를 20 세기에 여러 갈등 화학 전쟁 에이전트로 사용 남아 있었다. 황 머스타드 먼저 1822 년 합성되었지만, SM 노출의 분자량과 임상 병리학 상세히 이해되지 않고 SM 노광용 해독제가 확인되지 않았다. 몇몇 연구는 이해하고 SM 노광 후에 손상된 상처 치유를 모델링하고 그 효과를 확보 할 수있는 잠재적 후보 화합물을 시험하기 위해 수행되었다. 슈미트 외. (2009) 클로 람 부실의 영향, 양해 각서 (MOU)에 SM과 유사한 특성을 가진 알킬화 화합물을 테스트SE 배아 체 모델 및 혈관 형성 7 극적인, 때때로 99 % 이상의 감소를 알았다. 이 부작용은 대부분, 생리 학적 조건 하에서, 증식 및 혈관 내피 전구 세포의 이동에 의해 지배된다 개발 단계에서 두드러졌다. 따라서, 이들 세포는 알킬화제에 특히 민감한 것으로 확인되었다. Steinritz 외. (2010)에, 마우스 배아 체 모델에서 특히 SM 독성을 감소시키는 그들의 능력에 대하여 특히, N- 아세틸 시스테인 (NAC)과 알파 리놀렌산 (ALA)에서 반응성 산소 종 (ROS)의 청소부 테스트 혈관 형성 (8)를 복원합니다. 임시 보호 효과는 과도한 활성 산소의 형성은 상처 치유에 SM의 부작용에 ​​기여할 가능성이되었음을 나타내는, 관찰되었다. 이러한 효과는 영구 없었고 두 후보 화합물은 장기 8에서 혈관 형성 및 상처 치유를 복원 할 수 없을 수도있다. HoweveR, 그 실험은 세포 이동의 조사를 허용했다 복잡한 3D 모델에서 실시 하였다. 따라서, 우리는 이후 용기 (9)의 형성 과정에서 중요한 역할을 EEC의 세포 이동에 대한 유익한 효과에 대한 ALA NAC 및 시험. 또한, 셀 극성 세포 이동을 위해 필요하다는 증거가있다. ROS의 형성으로 이어지는 미토콘드리아 기능 장애 세포 극성을 저해하는 것으로하고, 따라서 악영향 세포 이동에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 미토콘드리아 기능에 관한 라이브 세포 이미징을 수행하고, ROS 제거제의 효과를 조사 하였다. 다음 프로토콜은 EEC, 보이든 챔버 분석, 세포 추적 분석 및 세부에서 미토콘드리아 기능의 평가 TMRM의 사용을 포함하여 분석 상처 치유의 재배에 대한 일반 요구 사항에 대해 설명합니다. EEC 재배 및 마이그레이션을위한 실험 프로토콜의 중요한 측면이 강조된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

(황 및 질소 겨자 등의 알킬화 화학 전쟁 에이전트 포함) 화학 물질에 노출되면 상처 치유 장애를 포함하여 임상 증상의 과다 발생합니다. 상처 치유의 생리 학적 과정은 매우 복잡하다. 어느 혈관 생성을 통한 (신규 형성) 또는 혈관 생성 (기존 용기의 돋) - 육아 조직의 형성은 예비 상처 봉합의 결과 및 새로운 모세 혈관의 네트워크가 제공하는이 과정에서 중요한 단계이다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 기능, 지시 마이그레이션을 필요로한다. 따라서, 초기 내피 세포 (EEC) 이전의 조사는 잠재적으로 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인 장애를 치유 화학 물질에 의한 상처의 병태 생리를 이해하고하는 것이 중요하다. 우리는 에이전트 노출을 알킬화 후 손상된 상처 치유를 평가하고, TR에 대한 잠재적 인 후보 화합물을 테스트eatment. 우리는이 프로토콜에 설명 된 기법들을 사용 하였다. 수정 된 보이든 챔버는 정량적 EEC의 chemokinesis 설명한다보고자 하였다. 더욱이, 정 성적으로 마이그레이션을 평가하기 위해 트랙 분석과 조합하여 분석 상처 치유의 사용이 예시된다. 마지막으로, 우리는 교란 된 세포 이동의 기본 메커니즘을 식별하는 미토콘드리아 막전위의 조사 TMRM 형광 염료의 사용을 입증한다. 다음 프로토콜은 EEC의 조사를 위해 적응 된 기본 기술에 대해 설명합니다.

알킬화제에 대한 피부 노출은 홍반, 수포 형성 및 상처 치유 장애와 관련된 피부 궤양을 유발. 상처 치유는 내피 세포의 이동을 기반으로 angio- 및 혈관 생성을 필요로한다. 정량적 마이그레이션 된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 평가 될 수있다. 알킬화제 클로 람에 EEC의도 1c에 도시 한 바와 같이 노광시에 세포 이동 (9)에 상당한 감소 결과. 직접 24 시간 동안 클로 람 부실에 노...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K 조회수.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.