Die Autoren möchten danke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) für seine Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung der Videos. Die PS120 Fibroblasten-ähnliche Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3-wt oder NHE3-YRK wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Hinweis: Zwei Verstärker sind erforderlich für die Aufnahme der Tätigkeit der elektroneutraler Transporter durch eine selbst verweisende ISE in Verbindung mit Patch spannen, einen Patch Clamp Verstärker weiterhin die Zelle in eine ganz-Zell Konfiguration und eine hohe außerdem Verstärker ( Elektrometer) aufzeichnen die Transporter-Aktivität über die ISE (siehe Tabelle der Materialien). Der Patch-Clamp-Verstärker ist direkt mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Das Elektrometer mit der Differenzverstärker verwendet, um zu filtern und verstärken das Signal verbunden ist. Der Differenzverstärker ist mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Capmeter, Patch Clamp-Software, die Zelle Kapazität überwacht wurde in früheren Studien20 verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Kammer und Perfusion Aufzeichnungslösungen werden bei 37 ° c beibehalten.
1. Vorbereitung von Pipetten für ISEs
<ol><li>Ziehen Sie die Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm (siehe Tabelle der Materialien) mit der Pipette Abzieher2 .</li>
	<li>Polieren Sie die Pipette mit der Microforge. Der Durchmesser des die Pipettenspitze sollte 2-3 µm.</li>
	<li>Legen Sie die Pipetten in einem Glas-Halter für Pipetten mit der Pipettenspitze nach oben (siehe Tabelle der Materialien). Achtung: Führen Sie Schritte 1,4-1,6 in einem gut belüfteten chemische Abzug.</li>
	<li>Mischen Sie die Silikonisierung Mischung, die aus 1 Tropfen (~ 150 µL) besteht der BIZ (Dimethylamino) Dimethyl Silane und 10 Tropfen der Carbon Titantetrachlorid (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Gießen Sie die Silikonisierung Mischung in das Glas und schließen Sie den Deckel fest.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Glas mit der Silikonisierung Mischung für 24-48 h in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur, bis die Mischung vollständig verdunstet ist.</li>
	<li>Die Pipette mit dem entsprechenden ionenselektive Harz Hinterfüllung erstellen Sie eine Spalte von ca. 2-4 mm. Hinweis: Wasserstoff Ionophore ich cocktail B Geschäftstermine Aufnahme NHE Aktivität werden kann (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Tippen Sie auf die Spitze der Pipette, die ionenselektive Harz bis zur Spitze zu verteilen, und legen Sie die Pipette senkrecht in den Glas-Halter mit der Pipettenspitze nach unten.</li>
	<li>Checkunder der sezierenden Mikroskop, dass der Harz-Cocktail am Ende der Spitze erreicht hat. Bei Bedarf positive Druck, das Harz bis zum Ende zu drücken.</li>
	<li>Abgleich der Hälfte-Pipette mit der entsprechenden Lösung (~ 100 μL). Hier verwenden 100 mM KCl und 10 mM HEPES bei pH 7,0, wenn Ionophore ich cocktail B.</li>
	<li>Verbinden Sie die ISE mit dem Elektrometer und setzen Sie die Spitze der ISE in der Bad-Lösung für die Aufzeichnung verwendet. Das Elektrometer auf Null.</li>
	<li>Testen Sie die H+-selektive ISE Reaktion verändern den pH-Wert der Lösung Bad. Die durchschnittliche H+-selektive ISE Antwort ist ~ 58 mV pro Einheit von pH.</li>
	<li>In regelmäßigen Abständen bewerten Sie die ISE-Reaktion auf Kalibrierung.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Patch Clamp Pipetten für die Aufnahme
Hinweis: Die Methode von Donald Hilgemann in seinem Artikel auf Einkanal-Aufnahme21 beschrieben wird empfohlen.
<ol><li>Ziehen Sie die Pipetten für riesige Patch aus Borosilikatglas Kapillaren (2.0 MmOD / 1,5 mm ID) auf die Pipette Abzieher2,22,23.</li>
	<li>Verwendung einer Microforge montiert auf der Bühne von einem inversen Mikroskop zu einem breiten Pipette Tipp (10-22 μm)23. Eine Perle zu schmelzen (~ 0,5 mL) von Weichglas auf den dicken Platin Draht von der Microforge. Hinweis: Eine relativ dicke Platindraht ist erforderlich (~0.5 mm), riesiger Patch Pipetten zu fabrizieren.</li>
	<li>Positionieren Sie die Patch-Pipette in der Nähe der weichen Glasperle und gelten Sie volle Hitze, bis die Spitze beginnt zu schwinden. Der Platindraht bewegt sich etwas in Richtung der Centerduring Heizung.</li>
	<li>Schalten Sie die Hitze, und schieben Sie die Pipettenspitze in die weiche Glasperle. Die kühle Draht wird zurückziehen und brechen die Pipettenspitze.</li>
	<li>Erneut die Hitze zu glätten die Pipettenspitze und erstellen eine Pipettenspitze mit dem gewünschten Durchmesser. Der Durchmesser der Spitze ist abhängig von der Größe der Zelle werden gepatcht (8 – 10 μm in dieser Studie).</li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + und Mg2 +, Trypsin-EDTA-Lösung und Wachstumsmedium, bei 37 ° c erwärmen</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS. Verwenden Sie 1 mL des Puffers für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur.</li>
	<li>0,5 mL Trypsin zu den Zellen für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur zugeben. Hinweis: Wenn Zellen beginnen sich zu Round-Up, schütteln Sie die Platte, um die Zellen de befestigen.</li>
	<li>Hält die Trypsin-Handlung durch Zugabe von 5 mL (Betrag für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur) komplette Wachstumsmedium mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt. Hinweis: Ist die Reaktionszeit in Trypsin-Zelltyp abhängig.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen auf einem Boston-Shaker mit rockigen um Bildung von Klumpen zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie Zellen für bis zu 2 h nach Trypsinization. Hinweis: Die Zeit variieren je nach Zelllinie.</li>
</ol>4. Erstellung eines Intra-Pipette Perfusion Systems
<ol><li>Schneiden Sie eine geeignete Größe des Quarz-Schlauch (150 µm OD / 75 µm ID), die Intra-Pipette Perfusion Linie vorzubereiten.</li>
	<li>Ein 200 µL Pipettenspitze stecken Sie einseitig von den Quarz-Schlauch. Kleben Sie die Quarz-Schlauch auf die Spitze und schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer scharfen Rasierklinge.</li>
	<li>Schließen Sie die Perfusion Leitung (Quarz-Schlauch an der Spitze geklebt), ein kleines Stück Silikon-Schläuche, die als Reservoir für die Intra-Pipette Perfusion Lösung dienen würde.</li>
	<li>Schließen Sie den Silikon-Schläuche an eine Spritze um Überdruck zu erstellen.</li>
	<li>Legen Sie das freie Ende des Quarz-Schlauch durch das Polyethylen-Rohr von der Pipette Inhaber der Durchblutung port (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die Perfusion-Linie mit der Pipette Lösung zu bewerten.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie eine stark gepufferten Pipette-Lösung zur Erfassung von NHE (115 mM Kalium Aspartat-(KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM Rohre MOPS 12,5 mM und 12,5 mM MES, pH 6.0 mit Asparaginsäure eingestellt). Hinweis: Bereiten Sie das Lager Pipette Lösung und Filter. Mg-ATP vor der Aufnahme hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine frisches Bad Lösung jedes Mal (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2und 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).</li>
</ol>6. Aufnahme von Transporter-Aktivität
<ol><li>Halten Sie die Aufnahme Kammer und alle Lösungen bei 37 ° C, da Transporter Aktivität temperaturabhängig ist.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen in der Aufnahme-Kammer. Warten Sie, bis sie auf den Boden der Kammer fallen aber lass sie nicht anhängen an die Kammer.</li>
	<li>Wählen Sie eine entsprechende Zelle. Messen Sie den Durchmesser der Zelle mit der okulären Mikrometer. Wählen Sie Zellen mit ähnlichen Durchmessern. Hinweis: In der Regel wird eine große Zelle mehr zellularen Oberfläche und möglicherweise mehr Transporter über die Plasmamembran, also auch mit mehr Transporter Aktivität zum Ausdruck gebracht haben. Dies ist jedoch nicht unbedingt richtig, als Transporter Aktivität hängt von der spezifischen Transporter und Zelltyp unter Studie.</li>
	<li>Montieren Sie die ionenselektive Mikroelektrode Pipette an der Mikromanipulator, Hinterfüllung die Patch-Klemmung Pipette mit der intrazellulären Lösung stellen sicher, dass die Lösung die Spitze der Pipette2erreicht. Hinweis: Es möglicherweise mehrere sanfte Taps, Luftblasen in der Spitze der Pipette zu beseitigen.</li>
	<li>Montieren Sie die Patch-Klemmung Pipette auf den Kopf Bühne der Elektrophysiologie eingerichtet,2,22,23. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Kopf Bühne über einen 45-Grad-Winkel auf der horizontalen Achse, da dadurch eine Eintrittswinkel für die Pipette, die für die Bildung einer hochresistenten Dichtung geeignet ist.</li>
	<li>Eine kleine positive Druck (~ 5 cm H2O) um die Patch-Pipette zu verringern die Möglichkeit der Sperrung der Spitze, und legen Sie sie in die Bad-Lösung.</li>
	<li>Nicht mehr die Patch-Clamp-Pipette zu bewegen, sobald die Spitze in der Nähe der Zelle ist.</li>
	<li>Entlasten den positiven-Luftdruck während Pipette die Zelle berührt und leichten negativen Druck (~ 5 cm H2O) erhalten eine > 1000 MΩ (ein Giga-Ohm) Siegel auf der Zellmembran mit dem Patch pipette23.</li>
	<li>Legen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der gleichen Brennebene als die ISE, und bewegen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der Nähe der ISE (~ 5-10 µm)2,5 aber vermieden werden, dass die Zelle an der ISE (Abbildung 1A).</li>
	<li>Versichern, dass die potenziellen Holding 0 ist mV.</li>
	<li>Bruch der Dichtung mit Serie von kurzen Lenzsauger, die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten.</li>
	<li>Verschieben Sie die ISE (oder Patch-Clamp-Pipette) langsam links-rechts oder oben-unten, um die Aktivität des Transporters (Abbildung 1 b) aufzuzeichnen.</li>
	<li>Aufzeichnen von mindestens 5-8-Gipfel (Abbildung 1, von A nach B).</li>
	<li>Gelten Sie Rechtecksignal Störungen während der Aufnahme, die Qualität der Dichtung und die Zellmembran Kapazität (Abbildung 1) zu überwachen.</li>
	<li>Schätzen Sie das Flussmittel H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) aus der Differenz im freien H+ Konzentration der Zelloberfläche und Bulk-Lösung (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Hinweis: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> und <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> h+ und Puffer Diffusionskoeffizienten bzw. BT ist die Konzentration der gesamten Puffer, KD ist die Dissoziationskonstante des Puffers, R ist die Zelle Radius, und <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> bestimmt die Steady-State Änderung in der Konzentration der gebundenen H+ für eine kleine Änderung im freien H+. H+ zeigt eine freie Protonen in Lösung. Um mit früheren Studien, H+ Fluten in elektrophysiologische Flussmittel Einheiten durch die Berechnung der aktuellen Entsprechungen von den Fluten konvertiert (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) in pA-3,-5].</li>
	<li>Den Proton-Flux an der Zelloberfläche, die von der Zellengröße berechnet werden können oder die Membran-Kapazität zu normalisieren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Trotz der wichtigen Funktionen von Transportern sind die Methoden zur Verfügung, um ihre Tätigkeit zu studieren ineffektiv und unzureichend. Eine Einschränkung besteht darin, dass die verfügbaren Methoden Ionenbewegung vermittelt durch Transporter Aktivität ohne Rücksicht auf Schwankungen der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung während das Experiment4messen. Die vorgestellte Methode sorgt für präzise Steuerung der extrazellulären und intrazellulären Ionen-Kompositionen und bietet ein...

Transport von Ionen und gelösten Stoffen über die Plasmamembran ist essentiell für das Überleben der Zellen und damit der Organismen1. Selektive Transport von Ionen und gelösten Stoffen wird durch eine Reihe von spezialisierten Kanal und Transporter-Proteinen erreicht. Mutationen in diesen Proteinen führen oft zu einer Vielzahl von klinischen Bedingungen, Kanal und Transporter Proteine potenzielle Ziele für pharmakologische Behandlung1rendern. Leider ist das Verständnis der Mechanismen, die zugrunde liegenden Kanal und Transporter Funktion und Regulation durch die Ansätze zur Verfügung, um ihre Aktivität2,3,4studieren oft begrenzt.
Insbesondere Transporter können werden grob unterteilt in zwei große Gruppen, je nachdem, ob sie die Zelle transmembranen Potenzial beim Transport von gelösten Stoffen verändern: die Veränderung elektrogenes Ion-Transporter [z. B. Natrium-Phosphat Co-Transporter 2a (NaPi2a), Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) usw..] oder die nicht verändernde elektroneutraler Ionen-Transporter [z. B. Natrium-Proton Wärmetauscher (NHE), Natrium-Chlorid-Co-Transporter, NaPi2c, etc..]. Die Aktivitäten der beiden Klassen von Transportern wurden untersucht ausgiebig mit Aufnahme von radioaktiven Isotopen und Membran-permeationsfähigen fluoreszierenden Farbstoffen2. Beide Ansätze schätzen die Tätigkeit der Transporter durch die Messung der Masse Konzentrationsänderungen von speziellen zytoplasmatischen Ionen, und beide Methoden haben Einschränkungen, z. B. mäßige Empfindlichkeit und Zeitauflösung und unzureichende Kontrolle über die intrazelluläre Milieu. In der Tat, die Aktivität von vielen Transportern ist abhängig von der zytoplasmatischen Konzentration der Ionen (z. B. NHE3, NCX) durchgeführten, und Veränderungen in diesen Ionen-Konzentrationen werden voraussichtlich eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Transporter Aktivität2 , 3 , 5. präzise Messung dieser regulative Mechanismen beschränkt sich mit klassischen Methoden.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Patch-Clamp-Methoden verwendet, um den Transporter Aktivität2,6zu studieren. Insbesondere erlaubt die selbst verweisende ionenselektive Elektroden (ISEs)7,8 in Kombination mit dem Patch Spannsystem vor kurzem die Messung von elektroneutraler Transporter Aktivität3,4 , 5. ISEs sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein ISE bewegt sich auf und Weg von der Zellmembran in eine sich wiederholende, zeichnet oszillierende Mode eine Spannungsdifferenz (µV). Spannungsdifferenzen können in Ionen-Fluss Werte mit einer Kalibrierungsmethode, die erste Gesetz des Fick'schen Diffusion2,9gilt umgewandelt werden. Während ISEs verwendet werden zu erkennen, der Fluß der Ionen, die Bewegung von Zellen, Patch-Clamp-Methode in beide ganz-Zelle oder Inside-out-Konfigurationen wird verwendet, um die Membran Potenzial und intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu kontrollieren. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung der riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide und Proteine3,5.
Zusammenfassend lässt sich sagen die Vielseitigkeit der Patch-Clamp-Methode im Vergleich zu, dass andere Methoden zu studieren Transporter Aktivität hat Patch Klemmung geeignet, die allgemeinen Einschränkungen dieser anderen Methoden zu überwinden. Die Kombination von verweisen auf sich selbst ISEs und Patch-Clamp-Technik bietet die einzigartige Möglichkeit, die Aktivität von elektroneutraler Transporter in einem streng kontrollierten experimentellen Umfeld messen und Roman biophysikalische und molekularen entdecken Eigenschaften der Zellmembran transportieren3,4,5. Dieser Ansatz hat erfolgreich eingesetzt, um die Aktivität der NHE zu studieren. Die Säugetier-NHE Proteinfamilie katalysiert die elektroneutraler net Austausch von extrazellulären Natrium (Na+) für intrazelluläre Protonen (H+)10,11 unter Verwendung einer nach innen Na+ Steigung. Bei Säugetieren umfasst die NHE Proteinfamilie 11 verwandte Proteine (NHE1-9 und NHA1-2) und eine Sperma-spezifische NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a Familie) sind ubiquitär in den meisten lebenden Organismen aus einfachen Prokaryoten zu höheren Eukaryoten gefunden und engagieren sich in einer Vielzahl von lebenswichtige Zelle Funktionen10,11, einschließlich die Zelle Salzgehalt Verteidigung im controlling Prokaryoten, Aufrechterhaltung des Säure-Basen-Homöostase und Zelle Volumen und reguliert die Aufnahme von Salz und Wasser in verschiedenen spezialisierten Epithelien10,12,14,15. Die biologische Schlüsselrollen NHEs und die Bedeutung ihrer Funktionen wurden durch mehrere Studien festgelegt; jedoch haben einige Studien die biophysikalischen und molekulare Eigenschaften von Säugetieren NHEs Wegen methodischer Einschränkungen4untersucht. Vor kurzem hat die Anwendung von verweisen auf sich selbst ISEs während der gesamten Zelle Patch Klemmung neuartigen molekulare Mechanismen der NHE Isoformen von Änderungen in den intrazellulären Konzentrationen von Ionen, Proteine und Phospholipide3reguliert ergeben, 4.
Insbesondere das Protokoll zur Verfügung gestellt in diesem Manuskript beschreibt die Methoden und Ansätze zur Erforschung der Aktivität und Regulierung der NHE Isoform 3 (NHE3), einer der Hauptakteure bei der Aufnahme von Na+, Cl–, HCO3– und Flüssigkeit in der Bürste Grenze Membran Nieren- und Darm Epithelien14,16. Neue Einblicke in die Unterschiede in der Empfindlichkeit der NHE3 Aktivität, intrazelluläre Phosphoinositides (Phosphatidylinositide 4,5-Bisphosphate [PI (4,5) P2] und Phosphatidylinositide 3,4,5-Triphosphat [PI(3,4,5]P3]) wird berichtet. Zelle-Transport-Proteine, wie Kanäle und Transporter, Phosphoinositides17geregelt sind, und NHE3 bindet direkt PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5)18. Basierend auf der aktuellen Literatur, könnte entweder Phosphoinositide relevant für die physiologische und pathophysiologische Regulierung des NHE35,18,19. Unsere Befunde stützen separate Rollen für PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5) bei der Regulierung der NHE3 Aktivität. Diese Unterscheidung war aufgrund der Anwendung der ISE-Techniken in Kombination mit ganzen Zelle Patch Clamp Aufnahme möglich. Diese Technik ermöglicht auch Kontrolle der Phosphoinositide zellulären Inhalte über die intrazelluläre Perfusion der verschiedenen Phosphoinositides während der Messung der NHE3 Tätigkeit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

Der Transport von Ionen durch Zellmembranen sorgt für die Feinsteuerung der Ionengehalt innerhalb und außerhalb der Zelle, die Zelle Überleben unverzichtbar ist. Diese Transportmechanismen werden durch die Aktivitäten von spezialisierten Transporter-Proteinen vermittelt. Insbesondere pH Dynamik sind fein gesteuert Plasmamembran Proton (H+) Extrusionsanlagen, wie Na+/h+ Wärmetauscher (NHE) Proteinfamilie. Trotz umfangreicher Bemühungen, die Mechanismen NHE Verordnung studieren reicht unser gegenwärtige Verständnis der biophysikalischen und molekularen Eigenschaften der NHE Familie wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Methoden, um effektiv NHE Aktivität messen . In diesem Manuskript verwendet wir H+-selektive Elektroden während der gesamten Zelle patch klemmenden Aufnahme um NHE-induzierte H+ Flussmittel zu messen. Wir haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz in der Regel einige Einschränkungen der Methoden zur Messung der NHE Aktivität, z. B. radioaktiven Aufnahme und fluoreszierende Membran Permeants. Messung der NHE Aktivität mit der beschriebenen Methode ermöglicht hohe Empfindlichkeit und Auflösung und eine effizientere Kontrolle der intrazellulären Konzentrationen H+ . H+-selektive Elektroden sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein H+-selektiven Elektrode bis zu bewegen und entfernt von der Zellmembran in einer sich wiederholenden, oszillierende Mode zeichnet eine Spannungsdifferenz, die H+ Flux abhängig ist. Während H+-selektive Elektroden werden verwendet, um H+ Flux bewegen aus der Zelle, die Patch-Clamp-Methode in der ganz-Zell Konfiguration dient zur Steuerung der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide. Die Transporter-Aktivität der NHE Isoform 3 (NHE3) wurde durch Phosphoinositides gemessen mit diesem technischen Ansatz, um die molekulare Grundlagen der NHE3-Verordnung zu studieren.

Ein selbst verweisende ISE während der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme wurde angewandt, um die Regelung der NHE3 Tätigkeit zu studieren von Phosphoinositides. PS120 Fibroblasten-wie Zellen24, die die Expression von endogenen Plasmamembran NHEs fehlt, wurden verwendet. NHE3-Wildtyp (NHE3-wt) oder NHE3-Mutanten, die nicht binden Phosphoinositides [Tyrosin 501, 503 Arginin und Lysin 505 wurden ersetzt mit Alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] wurden in PS120 Fib...

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Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K Aufrufe.  Des Moines University. Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Serie: Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Anwenden von Mikrofluidik zur Elektrophysiologie

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...