Name: application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
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Die Autoren möchten danke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) für seine Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung der Videos. Die PS120 Fibroblasten-ähnliche Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3-wt oder NHE3-YRK wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Hinweis: Zwei Verstärker sind erforderlich für die Aufnahme der Tätigkeit der elektroneutraler Transporter durch eine selbst verweisende ISE in Verbindung mit Patch spannen, einen Patch Clamp Verstärker weiterhin die Zelle in eine ganz-Zell Konfiguration und eine hohe außerdem Verstärker ( Elektrometer) aufzeichnen die Transporter-Aktivität über die ISE (siehe Tabelle der Materialien). Der Patch-Clamp-Verstärker ist direkt mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Das Elektrometer mit der Differenzverstärker verwendet, um zu filtern und verstärken das Signal verbunden ist. Der Differenzverstärker ist mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Capmeter, Patch Clamp-Software, die Zelle Kapazität überwacht wurde in früheren Studien20 verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Kammer und Perfusion Aufzeichnungslösungen werden bei 37 ° c beibehalten.
1. Vorbereitung von Pipetten für ISEs
<ol><li>Ziehen Sie die Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm (siehe Tabelle der Materialien) mit der Pipette Abzieher2 .</li>
	<li>Polieren Sie die Pipette mit der Microforge. Der Durchmesser des die Pipettenspitze sollte 2-3 µm.</li>
	<li>Legen Sie die Pipetten in einem Glas-Halter für Pipetten mit der Pipettenspitze nach oben (siehe Tabelle der Materialien). Achtung: Führen Sie Schritte 1,4-1,6 in einem gut belüfteten chemische Abzug.</li>
	<li>Mischen Sie die Silikonisierung Mischung, die aus 1 Tropfen (~ 150 µL) besteht der BIZ (Dimethylamino) Dimethyl Silane und 10 Tropfen der Carbon Titantetrachlorid (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Gießen Sie die Silikonisierung Mischung in das Glas und schließen Sie den Deckel fest.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Glas mit der Silikonisierung Mischung für 24-48 h in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur, bis die Mischung vollständig verdunstet ist.</li>
	<li>Die Pipette mit dem entsprechenden ionenselektive Harz Hinterfüllung erstellen Sie eine Spalte von ca. 2-4 mm. Hinweis: Wasserstoff Ionophore ich cocktail B Geschäftstermine Aufnahme NHE Aktivität werden kann (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Tippen Sie auf die Spitze der Pipette, die ionenselektive Harz bis zur Spitze zu verteilen, und legen Sie die Pipette senkrecht in den Glas-Halter mit der Pipettenspitze nach unten.</li>
	<li>Checkunder der sezierenden Mikroskop, dass der Harz-Cocktail am Ende der Spitze erreicht hat. Bei Bedarf positive Druck, das Harz bis zum Ende zu drücken.</li>
	<li>Abgleich der Hälfte-Pipette mit der entsprechenden Lösung (~ 100 μL). Hier verwenden 100 mM KCl und 10 mM HEPES bei pH 7,0, wenn Ionophore ich cocktail B.</li>
	<li>Verbinden Sie die ISE mit dem Elektrometer und setzen Sie die Spitze der ISE in der Bad-Lösung für die Aufzeichnung verwendet. Das Elektrometer auf Null.</li>
	<li>Testen Sie die H+-selektive ISE Reaktion verändern den pH-Wert der Lösung Bad. Die durchschnittliche H+-selektive ISE Antwort ist ~ 58 mV pro Einheit von pH.</li>
	<li>In regelmäßigen Abständen bewerten Sie die ISE-Reaktion auf Kalibrierung.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Patch Clamp Pipetten für die Aufnahme
Hinweis: Die Methode von Donald Hilgemann in seinem Artikel auf Einkanal-Aufnahme21 beschrieben wird empfohlen.
<ol><li>Ziehen Sie die Pipetten für riesige Patch aus Borosilikatglas Kapillaren (2.0 MmOD / 1,5 mm ID) auf die Pipette Abzieher2,22,23.</li>
	<li>Verwendung einer Microforge montiert auf der Bühne von einem inversen Mikroskop zu einem breiten Pipette Tipp (10-22 μm)23. Eine Perle zu schmelzen (~ 0,5 mL) von Weichglas auf den dicken Platin Draht von der Microforge. Hinweis: Eine relativ dicke Platindraht ist erforderlich (~0.5 mm), riesiger Patch Pipetten zu fabrizieren.</li>
	<li>Positionieren Sie die Patch-Pipette in der Nähe der weichen Glasperle und gelten Sie volle Hitze, bis die Spitze beginnt zu schwinden. Der Platindraht bewegt sich etwas in Richtung der Centerduring Heizung.</li>
	<li>Schalten Sie die Hitze, und schieben Sie die Pipettenspitze in die weiche Glasperle. Die kühle Draht wird zurückziehen und brechen die Pipettenspitze.</li>
	<li>Erneut die Hitze zu glätten die Pipettenspitze und erstellen eine Pipettenspitze mit dem gewünschten Durchmesser. Der Durchmesser der Spitze ist abhängig von der Größe der Zelle werden gepatcht (8 – 10 μm in dieser Studie).</li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + und Mg2 +, Trypsin-EDTA-Lösung und Wachstumsmedium, bei 37 ° c erwärmen</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS. Verwenden Sie 1 mL des Puffers für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur.</li>
	<li>0,5 mL Trypsin zu den Zellen für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur zugeben. Hinweis: Wenn Zellen beginnen sich zu Round-Up, schütteln Sie die Platte, um die Zellen de befestigen.</li>
	<li>Hält die Trypsin-Handlung durch Zugabe von 5 mL (Betrag für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur) komplette Wachstumsmedium mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt. Hinweis: Ist die Reaktionszeit in Trypsin-Zelltyp abhängig.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen auf einem Boston-Shaker mit rockigen um Bildung von Klumpen zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie Zellen für bis zu 2 h nach Trypsinization. Hinweis: Die Zeit variieren je nach Zelllinie.</li>
</ol>4. Erstellung eines Intra-Pipette Perfusion Systems
<ol><li>Schneiden Sie eine geeignete Größe des Quarz-Schlauch (150 µm OD / 75 µm ID), die Intra-Pipette Perfusion Linie vorzubereiten.</li>
	<li>Ein 200 µL Pipettenspitze stecken Sie einseitig von den Quarz-Schlauch. Kleben Sie die Quarz-Schlauch auf die Spitze und schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer scharfen Rasierklinge.</li>
	<li>Schließen Sie die Perfusion Leitung (Quarz-Schlauch an der Spitze geklebt), ein kleines Stück Silikon-Schläuche, die als Reservoir für die Intra-Pipette Perfusion Lösung dienen würde.</li>
	<li>Schließen Sie den Silikon-Schläuche an eine Spritze um Überdruck zu erstellen.</li>
	<li>Legen Sie das freie Ende des Quarz-Schlauch durch das Polyethylen-Rohr von der Pipette Inhaber der Durchblutung port (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Die Perfusion-Linie mit der Pipette Lösung zu bewerten.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie eine stark gepufferten Pipette-Lösung zur Erfassung von NHE (115 mM Kalium Aspartat-(KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM Rohre MOPS 12,5 mM und 12,5 mM MES, pH 6.0 mit Asparaginsäure eingestellt). Hinweis: Bereiten Sie das Lager Pipette Lösung und Filter. Mg-ATP vor der Aufnahme hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine frisches Bad Lösung jedes Mal (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2und 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).</li>
</ol>6. Aufnahme von Transporter-Aktivität
<ol><li>Halten Sie die Aufnahme Kammer und alle Lösungen bei 37 ° C, da Transporter Aktivität temperaturabhängig ist.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen in der Aufnahme-Kammer. Warten Sie, bis sie auf den Boden der Kammer fallen aber lass sie nicht anhängen an die Kammer.</li>
	<li>Wählen Sie eine entsprechende Zelle. Messen Sie den Durchmesser der Zelle mit der okulären Mikrometer. Wählen Sie Zellen mit ähnlichen Durchmessern. Hinweis: In der Regel wird eine große Zelle mehr zellularen Oberfläche und möglicherweise mehr Transporter über die Plasmamembran, also auch mit mehr Transporter Aktivität zum Ausdruck gebracht haben. Dies ist jedoch nicht unbedingt richtig, als Transporter Aktivität hängt von der spezifischen Transporter und Zelltyp unter Studie.</li>
	<li>Montieren Sie die ionenselektive Mikroelektrode Pipette an der Mikromanipulator, Hinterfüllung die Patch-Klemmung Pipette mit der intrazellulären Lösung stellen sicher, dass die Lösung die Spitze der Pipette2erreicht. Hinweis: Es möglicherweise mehrere sanfte Taps, Luftblasen in der Spitze der Pipette zu beseitigen.</li>
	<li>Montieren Sie die Patch-Klemmung Pipette auf den Kopf Bühne der Elektrophysiologie eingerichtet,2,22,23. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Kopf Bühne über einen 45-Grad-Winkel auf der horizontalen Achse, da dadurch eine Eintrittswinkel für die Pipette, die für die Bildung einer hochresistenten Dichtung geeignet ist.</li>
	<li>Eine kleine positive Druck (~ 5 cm H2O) um die Patch-Pipette zu verringern die Möglichkeit der Sperrung der Spitze, und legen Sie sie in die Bad-Lösung.</li>
	<li>Nicht mehr die Patch-Clamp-Pipette zu bewegen, sobald die Spitze in der Nähe der Zelle ist.</li>
	<li>Entlasten den positiven-Luftdruck während Pipette die Zelle berührt und leichten negativen Druck (~ 5 cm H2O) erhalten eine > 1000 MΩ (ein Giga-Ohm) Siegel auf der Zellmembran mit dem Patch pipette23.</li>
	<li>Legen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der gleichen Brennebene als die ISE, und bewegen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der Nähe der ISE (~ 5-10 µm)2,5 aber vermieden werden, dass die Zelle an der ISE (Abbildung 1A).</li>
	<li>Versichern, dass die potenziellen Holding 0 ist mV.</li>
	<li>Bruch der Dichtung mit Serie von kurzen Lenzsauger, die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten.</li>
	<li>Verschieben Sie die ISE (oder Patch-Clamp-Pipette) langsam links-rechts oder oben-unten, um die Aktivität des Transporters (Abbildung 1 b) aufzuzeichnen.</li>
	<li>Aufzeichnen von mindestens 5-8-Gipfel (Abbildung 1, von A nach B).</li>
	<li>Gelten Sie Rechtecksignal Störungen während der Aufnahme, die Qualität der Dichtung und die Zellmembran Kapazität (Abbildung 1) zu überwachen.</li>
	<li>Schätzen Sie das Flussmittel H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) aus der Differenz im freien H+ Konzentration der Zelloberfläche und Bulk-Lösung (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Hinweis: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> und <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> h+ und Puffer Diffusionskoeffizienten bzw. BT ist die Konzentration der gesamten Puffer, KD ist die Dissoziationskonstante des Puffers, R ist die Zelle Radius, und <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> bestimmt die Steady-State Änderung in der Konzentration der gebundenen H+ für eine kleine Änderung im freien H+. H+ zeigt eine freie Protonen in Lösung. Um mit früheren Studien, H+ Fluten in elektrophysiologische Flussmittel Einheiten durch die Berechnung der aktuellen Entsprechungen von den Fluten konvertiert (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) in pA-3,-5].</li>
	<li>Den Proton-Flux an der Zelloberfläche, die von der Zellengröße berechnet werden können oder die Membran-Kapazität zu normalisieren.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Trotz der wichtigen Funktionen von Transportern sind die Methoden zur Verfügung, um ihre Tätigkeit zu studieren ineffektiv und unzureichend. Eine Einschränkung besteht darin, dass die verfügbaren Methoden Ionenbewegung vermittelt durch Transporter Aktivität ohne Rücksicht auf Schwankungen der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung während das Experiment4messen. Die vorgestellte Methode sorgt für präzise Steuerung der extrazellulären und intrazellulären Ionen-Kompositionen und bietet ein...

Transport von Ionen und gelösten Stoffen über die Plasmamembran ist essentiell für das Überleben der Zellen und damit der Organismen1. Selektive Transport von Ionen und gelösten Stoffen wird durch eine Reihe von spezialisierten Kanal und Transporter-Proteinen erreicht. Mutationen in diesen Proteinen führen oft zu einer Vielzahl von klinischen Bedingungen, Kanal und Transporter Proteine potenzielle Ziele für pharmakologische Behandlung1rendern. Leider ist das Verständnis der Mechanismen, die zugrunde liegenden Kanal und Transporter Funktion und Regulation durch die Ansätze zur Verfügung, um ihre Aktivität2,3,4studieren oft begrenzt.
Insbesondere Transporter können werden grob unterteilt in zwei große Gruppen, je nachdem, ob sie die Zelle transmembranen Potenzial beim Transport von gelösten Stoffen verändern: die Veränderung elektrogenes Ion-Transporter [z. B. Natrium-Phosphat Co-Transporter 2a (NaPi2a), Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) usw..] oder die nicht verändernde elektroneutraler Ionen-Transporter [z. B. Natrium-Proton Wärmetauscher (NHE), Natrium-Chlorid-Co-Transporter, NaPi2c, etc..]. Die Aktivitäten der beiden Klassen von Transportern wurden untersucht ausgiebig mit Aufnahme von radioaktiven Isotopen und Membran-permeationsfähigen fluoreszierenden Farbstoffen2. Beide Ansätze schätzen die Tätigkeit der Transporter durch die Messung der Masse Konzentrationsänderungen von speziellen zytoplasmatischen Ionen, und beide Methoden haben Einschränkungen, z. B. mäßige Empfindlichkeit und Zeitauflösung und unzureichende Kontrolle über die intrazelluläre Milieu. In der Tat, die Aktivität von vielen Transportern ist abhängig von der zytoplasmatischen Konzentration der Ionen (z. B. NHE3, NCX) durchgeführten, und Veränderungen in diesen Ionen-Konzentrationen werden voraussichtlich eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Transporter Aktivität2 , 3 , 5. präzise Messung dieser regulative Mechanismen beschränkt sich mit klassischen Methoden.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Patch-Clamp-Methoden verwendet, um den Transporter Aktivität2,6zu studieren. Insbesondere erlaubt die selbst verweisende ionenselektive Elektroden (ISEs)7,8 in Kombination mit dem Patch Spannsystem vor kurzem die Messung von elektroneutraler Transporter Aktivität3,4 , 5. ISEs sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein ISE bewegt sich auf und Weg von der Zellmembran in eine sich wiederholende, zeichnet oszillierende Mode eine Spannungsdifferenz (µV). Spannungsdifferenzen können in Ionen-Fluss Werte mit einer Kalibrierungsmethode, die erste Gesetz des Fick'schen Diffusion2,9gilt umgewandelt werden. Während ISEs verwendet werden zu erkennen, der Fluß der Ionen, die Bewegung von Zellen, Patch-Clamp-Methode in beide ganz-Zelle oder Inside-out-Konfigurationen wird verwendet, um die Membran Potenzial und intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu kontrollieren. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung der riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide und Proteine3,5.
Zusammenfassend lässt sich sagen die Vielseitigkeit der Patch-Clamp-Methode im Vergleich zu, dass andere Methoden zu studieren Transporter Aktivität hat Patch Klemmung geeignet, die allgemeinen Einschränkungen dieser anderen Methoden zu überwinden. Die Kombination von verweisen auf sich selbst ISEs und Patch-Clamp-Technik bietet die einzigartige Möglichkeit, die Aktivität von elektroneutraler Transporter in einem streng kontrollierten experimentellen Umfeld messen und Roman biophysikalische und molekularen entdecken Eigenschaften der Zellmembran transportieren3,4,5. Dieser Ansatz hat erfolgreich eingesetzt, um die Aktivität der NHE zu studieren. Die Säugetier-NHE Proteinfamilie katalysiert die elektroneutraler net Austausch von extrazellulären Natrium (Na+) für intrazelluläre Protonen (H+)10,11 unter Verwendung einer nach innen Na+ Steigung. Bei Säugetieren umfasst die NHE Proteinfamilie 11 verwandte Proteine (NHE1-9 und NHA1-2) und eine Sperma-spezifische NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a Familie) sind ubiquitär in den meisten lebenden Organismen aus einfachen Prokaryoten zu höheren Eukaryoten gefunden und engagieren sich in einer Vielzahl von lebenswichtige Zelle Funktionen10,11, einschließlich die Zelle Salzgehalt Verteidigung im controlling Prokaryoten, Aufrechterhaltung des Säure-Basen-Homöostase und Zelle Volumen und reguliert die Aufnahme von Salz und Wasser in verschiedenen spezialisierten Epithelien10,12,14,15. Die biologische Schlüsselrollen NHEs und die Bedeutung ihrer Funktionen wurden durch mehrere Studien festgelegt; jedoch haben einige Studien die biophysikalischen und molekulare Eigenschaften von Säugetieren NHEs Wegen methodischer Einschränkungen4untersucht. Vor kurzem hat die Anwendung von verweisen auf sich selbst ISEs während der gesamten Zelle Patch Klemmung neuartigen molekulare Mechanismen der NHE Isoformen von Änderungen in den intrazellulären Konzentrationen von Ionen, Proteine und Phospholipide3reguliert ergeben, 4.
Insbesondere das Protokoll zur Verfügung gestellt in diesem Manuskript beschreibt die Methoden und Ansätze zur Erforschung der Aktivität und Regulierung der NHE Isoform 3 (NHE3), einer der Hauptakteure bei der Aufnahme von Na+, Cl–, HCO3– und Flüssigkeit in der Bürste Grenze Membran Nieren- und Darm Epithelien14,16. Neue Einblicke in die Unterschiede in der Empfindlichkeit der NHE3 Aktivität, intrazelluläre Phosphoinositides (Phosphatidylinositide 4,5-Bisphosphate [PI (4,5) P2] und Phosphatidylinositide 3,4,5-Triphosphat [PI(3,4,5]P3]) wird berichtet. Zelle-Transport-Proteine, wie Kanäle und Transporter, Phosphoinositides17geregelt sind, und NHE3 bindet direkt PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5)18. Basierend auf der aktuellen Literatur, könnte entweder Phosphoinositide relevant für die physiologische und pathophysiologische Regulierung des NHE35,18,19. Unsere Befunde stützen separate Rollen für PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5) bei der Regulierung der NHE3 Aktivität. Diese Unterscheidung war aufgrund der Anwendung der ISE-Techniken in Kombination mit ganzen Zelle Patch Clamp Aufnahme möglich. Diese Technik ermöglicht auch Kontrolle der Phosphoinositide zellulären Inhalte über die intrazelluläre Perfusion der verschiedenen Phosphoinositides während der Messung der NHE3 Tätigkeit.

<table><tbody><tr><td>Patch clamp Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>Differential Amplifier (DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Software Based on MatLab</td><td>MatLab with acquisition toolbox</td><td></td><td>The capmeter software is recommended</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 Temperature Control System</td><td>&amp;nbsp;AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>In-line heater</td></tr><tr><td>Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Used for ion selective electrodes</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tetrachloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen ionophore I - cocktail B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Tubing</td><td>&amp;nbsp;Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>Used for patch clamp pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Used for intra-pipette perfusion system</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium aspartate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

Der Transport von Ionen durch Zellmembranen sorgt für die Feinsteuerung der Ionengehalt innerhalb und außerhalb der Zelle, die Zelle Überleben unverzichtbar ist. Diese Transportmechanismen werden durch die Aktivitäten von spezialisierten Transporter-Proteinen vermittelt. Insbesondere pH Dynamik sind fein gesteuert Plasmamembran Proton (H+) Extrusionsanlagen, wie Na+/h+ Wärmetauscher (NHE) Proteinfamilie. Trotz umfangreicher Bemühungen, die Mechanismen NHE Verordnung studieren reicht unser gegenwärtige Verständnis der biophysikalischen und molekularen Eigenschaften der NHE Familie wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Methoden, um effektiv NHE Aktivität messen . In diesem Manuskript verwendet wir H+-selektive Elektroden während der gesamten Zelle patch klemmenden Aufnahme um NHE-induzierte H+ Flussmittel zu messen. Wir haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz in der Regel einige Einschränkungen der Methoden zur Messung der NHE Aktivität, z. B. radioaktiven Aufnahme und fluoreszierende Membran Permeants. Messung der NHE Aktivität mit der beschriebenen Methode ermöglicht hohe Empfindlichkeit und Auflösung und eine effizientere Kontrolle der intrazellulären Konzentrationen H+ . H+-selektive Elektroden sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein H+-selektiven Elektrode bis zu bewegen und entfernt von der Zellmembran in einer sich wiederholenden, oszillierende Mode zeichnet eine Spannungsdifferenz, die H+ Flux abhängig ist. Während H+-selektive Elektroden werden verwendet, um H+ Flux bewegen aus der Zelle, die Patch-Clamp-Methode in der ganz-Zell Konfiguration dient zur Steuerung der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide. Die Transporter-Aktivität der NHE Isoform 3 (NHE3) wurde durch Phosphoinositides gemessen mit diesem technischen Ansatz, um die molekulare Grundlagen der NHE3-Verordnung zu studieren.

Ein selbst verweisende ISE während der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme wurde angewandt, um die Regelung der NHE3 Tätigkeit zu studieren von Phosphoinositides. PS120 Fibroblasten-wie Zellen24, die die Expression von endogenen Plasmamembran NHEs fehlt, wurden verwendet. NHE3-Wildtyp (NHE3-wt) oder NHE3-Mutanten, die nicht binden Phosphoinositides [Tyrosin 501, 503 Arginin und Lysin 505 wurden ersetzt mit Alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] wurden in PS120 Fib...

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Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K Aufrufe.  Des Moines University. Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.

Serie: Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Messung der induzierten Spannung Membran mit Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Forschung

Biologie

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Biochemie

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of membrane carrier proteins reconstituted in lipid bilayer membranes is a powerful but delicate method for the assessment of their physicochemical and pharmacological properties. The substrate turnover number is a unique parameter that allows the comparison of the activity of different membrane proteins. In an electrogenic transport, the gradient of the translocated substrate creates a membrane potential that directly correlates to the substrate turnover rate of the protein. By using silver chloride electrodes, a diffusion potential, also called liquid junction potential, is induced, which alters electrode potential and significantly disturbs precise membrane potential measurements. Diffusion potential can be minimized by a salt bridge, which balances electrode potential. In this article, a micro-agar salt bridge is designed to improve the electrophysiological set-up, which uses micropipettes for the membrane formation. The salt solution is filled into a microcapillary pipette tip, stabilized by the addition of agarose, and can be easily mounted to a standard electrode. The electrode potential of a micro-salt bridge electrode is more stable compared to a standard electrode. The implementation of this system stabilizes electrode potential and allows more precise measurements of membrane potential generated by a pH gradient. Using this system, the proton turnover rates of the mitochondrial carriers UCP1 and UCP3 are reinvestigated and compared to earlier measurements.

In electrophysiological measurements, the presence of a diffusion potential disturbs the precise measurement of the reverse potential by altering the electrode potential. Using a micro-agar salt bridge, the impact of the diffusion potential is minimized, which allows a more precise measurement of substrate turnover numbers of reconstituted recombinant membrane proteins.

Eine Mikro-Agar-Salz-Brücke-Elektrode für die Analyse der Proton Fluktuationsrate von rekombinanten Membranproteine

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

Neurowissenschaften

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Elektroporationseffekte auf gentechnisch veränderte Spiking-HEK-Zellen

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be affected by electric pulses even in therapies where they are not the primary targets, and this can cause adverse side effects. Therefore, to optimize the electroporation-based treatments of excitable and non-excitable tissues, there is a need to study the effects of electric pulses on excitable cells, their ion channels, and excitability in vitro. For this purpose, a protocol was developed for optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells. With the use of a fluorescent potentiometric dye, the changes in transmembrane voltage were monitored under a fluorescence microscope, and relevant parameters of cell responses were extracted automatically with a MATLAB application. This way, the excitable cell responses to different electric pulses and the interplay between excitation and electroporation could&#160;be efficiently evaluated.

<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

For studying responses of excitable cells in vitro, the protocol describes optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells as well as changes in transmembrane voltage with automated extraction of relevant parameters.

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Messung der induzierten Spannung Membran mit Di-8-ANEPPS

Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten

Eine Mikro-Agar-Salz-Brücke-Elektrode für die Analyse der Proton Fluktuationsrate von rekombinanten Membranproteine

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen