Die Autoren bedanken sich bei Gabriel Arom und Michael Yeranosian für ihre technischen Beiträge zu früheren Iterationen dieses Projekts danken. Dieses Projekt wurde von der OREF Kliniker Scientist Ausbildung Grant (NL) finanziert, HH Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR &amp; E Merit Bewertung 1 I01 BX00012601 (DM) und Muskel-Skelett-Stiftung für Transplantation Young Investigator Award (FP).

HINWEIS: Alle Tier Operationen wurden von der örtlichen Tierärzten und Tier Verwendung Ausschuss vor Beginn der Experimente zugelassen. 1. Vorbereitung von elektro Polycaprolacton Gerüste <ol><li> Einwiegen und lösen Grade Ester medizinischen Poly (ε-caprolacton) in Granulatform, in 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol, um eine 10% w erstellen / w Lösung des PCL-Polymer. Lassen Sie die Lösung für Aufsehen mit einer Rührplatte für mindestens 3 Stunden um eine homogene Lösung zu gewährleisten. </li><li> Elektrospinnen den PCL-Lösung, um eine Manschette hoch ausgerichtet PCL-Fasern für Gerüstherstellung erstellen. <ol><li> Bereiten Sie das Elektrospinnen Setup in einem Laborabzug mit dem Lüfter auf zu allen Zeiten. Diese besteht aus einem großen Acryl-Box, die als isolierte Vakuum Medium für die Elektrospinnverfahren Einstiegspunkte für die Quelle PCL-Lösung durch eine Spannungsquelle, die motorgetriebene Sammeln Dorn und einem Vakuumanschluss angetrieben dienen und hat. Reinigen Sie die acrylic Kasten gründlich mit Ethanol und decken alle Oberflächen mit Parafilm Blätter, um Verunreinigungen, die die Qualität der elektro Produkts beeinträchtigen können, zu entfernen. </li><li> Last ungefähr 3 ml der obigen Lösung in eine 10 ml-Spritze mit einer stumpfen Enden 18 G, 1 ½ inch Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie die Spritze auf. Schleusenlösung in eine programmierbare Spritzenpumpe. Führen Sie die Nadel durch ein kleines Loch in die Acryl-Box, während ca. ½ Zoll der Nadel außerhalb des Acryl-Box für die Befestigung der Spannungsquelle Draht. </li><li> Verwenden Sie eine 30 mm-Drehmaschine Drehdorn als Kollektor für die hoch ausgerichtet PCL-Fasern; decken den Dorn fest mit einem dünnen Streifen aus Aluminiumfolie. Verriegeln des Dorns in den Motor auf der gegenüberliegenden Seite der Box, etwa 15 cm weg von der Injektionsnadel. </li><li> Stecken Sie den Kunststoffschlauch in die Vakuumanschluss und eine Verbindung zum Abzug Vakuumquelle. Einschalten der Vakuumquelle und decken das Acryl-Box mit einem Deckel. </li><li> Set die Infusionsrate der programmierbaren Spritzenpumpe auf 2,5 ml / hr. Schalten Sie den Motor, um den Dorn bei 3450 Umdrehungen pro Minute betrieben und bringen Sie den Pluspol der Spannungsquelle an der Nadelspitze außerhalb der Box mit einer Krokodilklemme. </li><li> Nach Infusion der PCL-Lösung begonnen hat, schalten Sie die Spannungsquelle und zu einer 20 kV Betriebsspannung eingestellt. </li><li> Die Infusion erfolgt die Lösung für 12 min, um eine homogene Manschette 0,5 ml der PCL-Lösung. HINWEIS: Im Durchschnitt hat jeder Manschette genügend elektro Material zwei Sechsstreifen Blätter, die verwendet werden können, um insgesamt drei vierlagige Gerüste zu schaffen. </li></ol></li><li> Laser schneiden Sie die PCL-Manschette, mehrere kleine Blätter auf einem VersaLaser Cutter 2.3 bei niedrigem Vakuumeinstellung, 10,0 keV Landespannung, 6,4 mm Arbeitsabstand und Sondendurchmesser von 3,0 betrieben zu bilden. HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Computer Aided Design verwendet, um den Schneider anzuweisen, mehrere Blätter x 35 mm x 150 um Gerüste mit einer Ausbeute von 1,5 mmgleichmäßig verteilt 150 um Löcher mit einem Durchmesser von 15% Porenfläche. </li><li> Plasma ätzen die PCL Gerüste mit einem Plasma-Reiniger, um Hydrophilie der PCL-Oberfläche mit Ionenbeschleunigung zu induzieren. Stellen Sie das Vakuum auf 450 mTorr und dem Genuss die Gerüste für 30 Sekunden bei hoher Leistung (29,6 W). </li><li> Bathe die Gerüste in 70% Ethanol in einer sterilen Umgebung. </li><li> Bestreichen Sie die einzelnen Gerüste mit Kollagen, zelluläre Adhäsion und Proliferation in vivo zu erleichtern. <ol><li> Erstellung einer Kollagenbeschichtungslösung durch Verdünnen einer 8: 1: 2,5 sterile Lösung Purecol Kollagen 3 mg / ml Standardlösung, 10x PBS und 0,1 N NaOH 1: 9 in 1x PBS bei 4 ° C. Gründlich mischen, um Lösung Homogenität zu gewährleisten. </li><li> Coat einzelnen 1,5 mm x 35 mm x 150 um Gerüste mit einer dünnen Folie aus dem obigen Kollagenlösung. Man lässt 24 h in einer sterilen Umgebung zu trocknen. </li></ol></li><li> Mit 5-0 Vicryl Nahtmaterial, stapeln und bringen vier Einzel 1,5 mm x 35 mm x 150 um Gerüstemit einem Krackow Stich, um eine endgültige Dicke von 0,6 mm, vielschichtig, mit Kollagen beschichteten Gerüst, das bereit für die Implantation zu schaffen. </li></ol> 2. Rat Chirurgie Protocol <ol><li> Anästhesie herbei indem Ratte in der Inhalationskammer und liefert 2% Isofluran mit 2 l / min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Ratte ausreichend durch Druck auf Fuß hinter und Bewertung für jede Antwort betäubt. </li><li> Auf der nicht-sterilen zurück Tabelle, subkutan injiziert 25 mg / kg Ampicillin und 0,03 mg / kg Buprenorphin. </li><li> Bewerben Augensalbe für die Augen. Befestigen Sie den Pelz aus dem operativen Hinterbein und prep die Operationsstelle mit drei Wechsel Peelings von Chlorhexidin und 70% Ethanol. </li><li> Übertragen Sie die Ratte auf dem OP-Tisch, auf einem Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern. Sichere Bugnase und Aufrechterhaltung einer Narkose durch das Verfahren mit 2% Isofluran in 2 l / min Sauerstoff, geliefert Nasenkegel. Abdecktuch steril, so dass die operative Glied ausgesetzt. </li><li&gt; Vor dem Start der Operation, nach Best angemessene Betäubung durch Fehlen einer Reaktion auf Fußdruck hinter. </li><li> Einen 2 cm langen vertikalen Einschnitt medial zum Knie, auf der Ebene der Patella zentriert. Ziehen Sie die Haut seitlich, bis der Schnitt über dem Knie zentriert. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen medialen parapatellar Arthrotomie, indem nur der Patella medial und proximal zu dem Niveau der Muskelsehnenverbindung des Quadrizeps und distal zu der Ebene der Patellarsehnenansatzes auf dem Schienbein tubercule machen. Darauf achten, dass die Patella oder Quadrizeps Sehnen schneiden. </li><li> Seitlich Mitteilung Kniescheibe, indem Sie einen 1 cm vertikaler Schnitt durch die Kniekapsel unmittelbar lateral der Patellarsehne. </li><li> Stellen Sie sicher, das Knie gestreckt. Nehmen Sie ein Paar für feine Schneid fahren unter der Kniescheibe von lateral nach medial. Verbreiten Sie die Schere ein paar Mal, so dass die Streckapparat ist zu beiden Seiten übersetzt werden. </li><li> Während Biegen ter Knie, übersetzen die Patella seitlich an der Innenseite des Kniegelenks aussetzen. Stellen Sie sicher, klare Visualisierung der Fossa intercondylaris und Femurkondylen. Mit einem Skalpell durchschneiden die ACL und PCL in die Kerbe. </li><li> Last Bohrmaschine mit einem 1,6 mm K-Draht. Zeigen k-Drahtspitze auf ACL Ursprung in der Fossa intercondylaris. Bohren Sie superolaterally und visualisieren den Ausgangspunkt auf der lateralen Seite des Oberschenkels, Entfernen von Weichgewebe bei Bedarf mit einem Skalpell. Übergeben Sie die k-Draht in und aus ein paar Mal, um freien Durchgang für das Transplantat zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die k-Draht auf der ACL-Fußabdruck auf dem Tibiaplateau. Bohren Sie anterolateral und visualisieren Austrittspunkt auf der anterolateralen Tibia. Verwenden Skalpell, um Weichgewebe bei Bedarf zu löschen, so dass der Punkt, wo die k-Draht verlässt die Tibia vollständig sichtbar ist. </li><li> Übergeben Sie eine verkürzte Keith Nadel (idealerweise nicht mehr als 2 cm lang) durch die Oberschenkelknochentunnel. Führen Sie die beiden Fadenenden von einem Ende des Transplantats durch das Auge des Keith Nadel. Verwenden Sie die Nadel an einem Ende des Transplantats durch den Femoral-Hohlraum zu ziehen. </li><li> Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um das andere Ende des Transplantats durch den tibialen Tunnel. </li><li> Verwenden Sie 4-0 Vicrylnaht die Oberschenkel Ende des Transplantats in die umliegenden Knochenhaut oder anderes weiches Gewebe mit einer Figur einer Acht Masche anzubringen. Manuelles Spannen des Transplantats mit dem Knie in Extension. Befestigen Sie den Tibia- Ende des Transplantats in die umliegenden Knochenhaut oder anderes weiches Gewebe mit einer Figur einer Acht Stich. </li><li> Verwenden Sie eine Schere abzuschneiden überschüssige Transplantat an beiden Enden, so dass 1-2 mm an jedem Ende an der Zahl Acht Stich. </li><li> Verlängern Sie die Knie und zur Verringerung der Kniescheibe. Mit 4-0 Vicryl, legen Sie eine einzelne Zahl Acht Masche, um die mediale Gelenkkapsel zu schließen, verhindert seitlichen Subluxation der Patella. </li><li> Schließen Sie die Haut mit einer Lauf subkutikuläre 5-0 Monocryl oder Vicrylnaht, mit darauf, dass die darunter liegende Muskulatur zu nähen oder sichtbare Naht, wenn die Haut wird geschlossen. </li><li> Inject Ratten subkutan mit Buprenorphin alle 12 h für insgesamt drei Tage nach der Operation. Prüfen Operationsstelle für jede Drainage oder Wunddehiszenz zum Zeitpunkt der Injektion. Hinken und einige Schwellungen sind normal in den ersten Tagen nach der Operation, aber prompt wenden Sie sich bei postoperativen Bedenken im Zusammenhang mit Tierärzten. Das Tier kann den sozialen Wohnungsbau der Operation zurück werden in 2 Wochen, als chirurgische Schnitte werden vollständig geheilt. </li></ol> 3. Datenerfassung Protocol <ol><li> Zum Zeitpunkt der Opfer ersticken Ratten einzeln in einem geschlossenen CO 2 Kammer gefolgt von Thorakotomie. </li><li> Ernten Sie sowohl die operativ rekonstruiert und kontralateralen Gliedmaßen durch die Trennung im Hüftgelenk. <ol><li> Für den rekonstruierten Gliedmaßen, entfernen Sie alle Weichgewebe, einschließlich des hinteren Kreuzbandes und den Überresten aus dem chirurgisch gestört Mutter ACL, mit feinen Sezierung, nur den Oberschenkel, Schienbein, und Graft isolieren. </li> &lt;li&gt; Für die kontralateralen Gliedmaßen, entfernen Sie alle Weichteile bis auf die Mutter ACL als auch die Ober- und Unterschenkel durch feinen Sezierung. </li><li> Verwenden eines Drehwerkzeuges, wie Dremel, alle bis ¾ bis 1 cm von Knochen von jedem Ende des Femur-graft-Tibia-Komplex zu entfernen. </li><li> Während dieses Prozesses und im gesamten biomechanischen Tests, regelmäßig und häufig sprühen die Band Regionen mit physiologischer Kochsalzlösung, um ein Austrocknen des geernteten Knie die fälschlicherweise Ergebnisse verändern können, zu verhindern. </li></ol></li><li> Für die histologische Analyse, beheben jedes Knie einzeln in 4% Paraformaldehyd-Lösung bei 25 ° C für 48 Stunden. Als nächstes tauchen das Knie in einer Lösung von Immunocal Reagenz für vollständige Entkalkung; Dieses Verfahren ist abhängig von den calcific Inhalt der Probe und kann bis zu fünf Tage dauern. Überprüfen Sie einzelne Proben täglich den Fortschritt als unvollständig Entkalkung kann Probenqualität senken zu bewerten. Wenn Sie fertig sind, führen Sie Schneiden, Schienenführung und Färbung nach Wunsch. </li><li> Perform biomechanische Tests, um die Funktionsfähigkeit des Tissue Engineering Bänder bewerten. <ol><li> Sichern Sie die Oberschenkel und Schienbein durch Umwickeln 28 G Stahl verzinkt Draht um die Epiphyse der einzelnen Knochen getrennt. Dies ist zu ungenauen biomechanischen Testdaten vor vorzeitiger Zugversagen der Probe am Knochen und nicht am Bandinteressiere verhindern. </li><li> Pot der Oberschenkelknochen in eine Mischung aus Polymethylmethacrylat (PMMA) Knochenzement. Dazu mischen Sie die beiden Zementkomponenten und sofort die viskose Mischung, um den Oberschenkelknochen in das Metall zu sichern, vollständig umschließt die Diaphyse des Knochens in dem Hart Topf mit der Epiphyse und die angeschlossenen Band frei herausragend. Lassen spontane radikalische Polymerisation nach und nach zu einer teigigen Material und schließlich in eine feste gehärtete Matrix-Transformation der gemischten viskosen Komponenten. HINWEIS: Dieser Vorgang dauert mehrere Minuten und kann durch die manuelle Prüfung der Temperatur des Bolus aus gemacht überwacht werdender restliche Zement; sollte die Temperatur vorübergehend während der exothermen Polymerisationsreaktion zu erhöhen und klingen auf RT nach dem Material erstarrt. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang über zum Zementieren der Tibia, nur unter Beibehaltung der Kreuzbandriss bei 20 ° Flexion für optimale mechanische Prüfung. </li><li> Montieren Sie den zementierten Femur-graft-Tibia-Komplex auf eine Zugprüfmaschine, und bereiten sich auf Rekord Last und Verschiebung als Funktion der Zeit vom Beginn der Spannung zum Scheitern. In diesem Beispiel verwendeten wir ein Instron Modell 5564 mit einer 1 kN Lastzelle. </li><li> Vorspannung das Transplantat zu 2 N bei einem Anstieg von 0,5 N / min und testen Sie dann das Transplantat zum Scheitern bei einer Verformungsgeschwindigkeit von 0,5 mm / sec. Während des Prozesses werden Sie sicher, dass das Band an der Mitte der Substanz versagen und dass die Knochen Oberschenkel und Schienbein sicher sind und nicht vorzeitig versagen, was ungenau abschätzen kann biomechanischen Eigenschaften der getesteten Ligament. </li><li> Verwenden Sie die erzeugte Last-Weg-Kurven, die Bruchlast und Steifigkeit des getesteten Ligament zu berechnen. </li></ol></li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biodegradable+nanofiber+scaffold+by+electrospinning+and+its+potential+for+bone+tissue+engineering.">A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).</li><li>Xu, Y., Ao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+and+biomechanical+studies+of+inter-strand+healing+in+four-strand+autograft+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+a+rabbit+model.">Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).</li><li>Shino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+the+anterior+cruciate+ligament+by+an+allogeneic+tendon+graft.+An+experimental+study+in+the+dog.">Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog.</a> J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).</li><li>Stasiak, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+device+to+apply+controlled+flexion+and+extension+to+the+rat+knee+following+anterior+cruciate+ligament+reconstruction.">A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Biomech Eng. 134 (4), 041008 (2012).</li><li>Brophy, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+short-duration+low-magnitude+cyclic+loading+versus+immobilization+on+tendon-bone+healing+after+ACL+reconstruction+in+a+rat+model.">Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model.</a> J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ACL Verletzungen sind eine häufige Erkrankung in der orthopädischen Sportchirurgie, mit begrenzten Möglichkeiten für den Wiederaufbau in der heutigen Zeit. Um einen geeigneten Tissue-Engineering Ersatz für die ACL, die Regeneration in vivo ermöglicht entwickeln wird ein geeignetes Tiermodell erforderlich. In dieser Studie wird die Herstellung eines biologisch abbaubaren Werk Transplantats beschrieben, so ist seine in vivo-Implantation unter Verwendung eines reproduzierbaren Modell ACL-Rekonstrukt...

Ruptur des vorderen Kreuzbandes (ACL) ist eine der häufigsten Verletzungen der Bänder des Knies 1. Da die gerissenen ACL nicht ohne chirurgischen Eingriff zu heilen ist, die Einschränkungen in Aktivitäten des täglichen Lebens, sowie die Teilnahme an Sport fahren mehr als 175.000 Patienten einer Operation unterziehen jedes Jahr 2, mit geschätzten Kosten von einer Milliarde Dollar jährlich 3. Derzeit wird entweder autologe oder Allograft-Sehne für Bandrekonstruktion verwendet. Obwohl hohe Erfolgsraten kann sowohl mit Autograft und Transplantatersatz erreicht werden, sind schwere Komplikationen mit diesen Wiederaufbau Optionen 4 verbunden. Autologe Gewebe mit Entnahmemorbidität assoziiert und ist im Lieferumfang beschränkt, vor allem in Fällen von Wieder Bruch oder Mehrbandverletzung. Auf der anderen Seite wird Allotransplantatgewebe mit verzögerter Transplantatintegration, schädliche Entzündungsreaktion, theoretische Infektionsrisiko und begrenzte supp verbundenly 5. Synthetische nicht abbaubaren Transplantate wurden in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt wurden aber von vorzeitigen Bruch Transplantat, Fremdkörperreaktionen, Osteolyse und Synovitis 6 behindert. Als Ergebnis dieser ernsthaften Bedenken gibt es noch keine synthetische Transplantate für den klinischen Einsatz in den Vereinigten Staaten zur Verfügung. Aufgrund dieser Einschränkungen mit bestehenden Transplantat-Optionen und die jüngsten Entwicklungen in der Biologie, Technik und regenerative Medizin, gab es ein großes Interesse an einer Tissue Engineering Lösung für ACL Pfropfen. Aktuelle Tissue-Engineering-Strategien beschäftigen abbaubaren biologischen und synthetischen Materialien, um für Host Einwachsen von Gewebe zu ermöglichen, während die Vermeidung der Einschränkungen mit Permanent Kunststoff Implantation 7 verbunden. Polycaprolacton (PCL) ist ein biologisch abbaubares Polymer, das von der FDA für eine Reihe von medizinischen Anwendungen einschließlich Adhäsionsbarriere und Wundverband 8 ist, dass u gewesen istin einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Gefäß, Knochen, Knorpel, Nerven, Haut, und Speiseröhrenkrebs Tissue Engineering 5,9-16 sed. Günstige Biokompatibilität relativ lange in-vivo-Halbwertszeit, eine ausreichende mechanische Festigkeit und hohe Elastizität tragen zur Popularität dieses Polymer in Tissue Engineering. In einem Nagetiermodell der Wundheilung wurde implantierten elektro PCL gezeigt, dass nicht-immunogen und in lokale Gewebe ohne Nebenwirkungen bei 13 zu integrieren. Ein SEM-Bild von elektro PCL ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit aktuellen FDA regulatorischen Standards, Wirksamkeit und Sicherheit in kleinen und großen Tiermodellen würde bei einer PCL oder andere technisch ACL Transplantat benötigt, um in klinischen Studien in den Vereinigten Staaten zu bewegen. Darüber hinaus können in vivo-Bedingungen oft erweitern die Eigenschaften eines in vitro Gewebezüchtung ACL Transplantat. Ein Rattenmodell der autologen ACL-Rekonstruktion mit Beuge digitorum longus wurde bereits beschrieben, in dem die Mutter ACL wurde abgetrennt, Oberschenkel- und Schienbein Tunnel wurden gebohrt, und das Transplantat wurde verabschiedet und an Ort und Stelle mit Naht 17-22 gesichert. In dieser Arbeit werden wir eine Änderung des Modells für die Auswertung von technischen ACL Ersetzungen nicht für Autograft-basierte Rekonstruktion (Abbildung 2) zu beschreiben. Obwohl viele Tiermodelle für Bandgewebetechnik vorhanden sind, ist die Ratte vorteilhaft im Vergleich zu größeren Modelle für eine Reihe von Gründen. Zu diesen Vorteilen gehören einfacher Haltung und Handhabung, weniger ethische Überlegungen und reduzierte Kosten 17,23. Darüber hinaus ist die Ratten-Modell wurde umfangreich als ein Modell für orthopädische Geweberegeneration, einschließlich Knorpel, Sehnen und Knochengewebe 24 verwendet. Insbesondere wurden athymische Nacktratten aufgrund ihrer mangel der zellvermittelten Immunantwort 25 gewählt, so dass für die spätere Implantation of xenogenen Spenderzellen in diesem Modell zur weiteren Verbesserung der technisch Transplantat in der Zukunft. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir die Herstellung und chirurgischen Implantation einer zellfreien, biologisch abbaubaren Polymer Transplantat in einer athymischen Rattenmodell der ACL-Rekonstruktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:77px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:317px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Medical grade ester terminated poly (&#949;-caprolactone), granule form (MW = 110,000)</td>
			<td style="width:147px;">Lactel Absorbable Polymers</td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:317px;">Custom synthesized polymer to desired molecular weight</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td style="width:317px;">Solvent for PCL polymer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">18G x 1 1/2&#34;bevel needle</td>
			<td style="width:147px;">BD Medical</td>
			<td>305196</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump</td>
			<td style="width:147px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:77px;">702101</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver</td>
			<td style="width:147px;">Microgeo USA</td>
			<td style="width:77px;">VLS2.30</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Expanded Plasma Cleaner 115V</td>
			<td style="width:147px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:77px;">PDC-001</td>
			<td style="width:317px;">Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">PureCol&#160; Collagen Standard Solution, 3 mg/ml</td>
			<td style="width:147px;">Advanced Biomatrix</td>
			<td style="width:77px;">5015-A</td>
			<td style="width:317px;">Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1N NaOH 1:9 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">Suture, 5-0 Vicryl</td>
			<td style="width:147px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:77px;">1086471</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Suture, 4-0 Vicryl</td>
			<td style="width:147px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:77px;">6540072</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:77px;">8940</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Buphrenorphine hydrochloride</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:77px;">B9275</td>
			<td style="width:317px;">Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">Ampicillin, injectable</td>
			<td style="width:147px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:77px;">1185678</td>
			<td style="width:317px;">Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">K-wire, 1.6 mm</td>
			<td style="width:147px;">Spectrum Surgical</td>
			<td style="width:77px;">SI040062</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Keith Needle, Straight 1 1/2&#34;</td>
			<td style="width:147px;">Delasco Dermatology Lab &#38; Supply</td>
			<td style="width:77px;">KE-112</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:347px;">Immunocal Decalcifying Solution</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9491030</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer)</td>
			<td style="width:147px;">US Dental Depot</td>
			<td style="width:77px;">OPTICRYL 100410&#160;</td>
			<td style="width:317px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:347px;">Instron Model 5564 Tensile Testing Machine</td>
			<td style="width:147px;">Instron</td>
			<td style="width:77px;">5564</td>
			<td style="width:317px;">Any comparable tensile testing apparatus is suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

athymic rat model for evaluation of engineered anterior cruciate ligament grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Wir haben die Erfahrung von 92 Ratten Operationen von einem einzigen Chirurgen, meine operative Zeit vom Schnitt bis zur Fertigstellung der Wunde war 16,9 min, mit einer Standardabweichung von 4,7 min. Zum Zeitpunkt der Opfer, wog Ratten 356 ± 23 g. Alle Ratten toleriert die Operation gut und hatten keine Komplikationen. Unmittelbar nach der Operation wurden die Ratten darauf hingewiesen, das Gewicht auf dem operativen Ende tragen, zeigten aber eine leichte schlaff. Um eine Woche nach der Operation wurden alle Ratten o...

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Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

athymic-rat-model-for-evaluation-engineered-anterior-cruciate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Aufrufe.  University of California Los Angeles. Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Serie: Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Forschung

Biotechnik

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...