Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Ethik-Statement: Maushaltung und Handhabung sind in Übereinstimmung mit dem britischen Home Office Vorschriften und UCL Ethikkommission Leitlinien, die Einhaltung der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 des Vereinigten Königreichs und der Änderung der Verordnungen 2012. HINWEIS: Alle Lösungen sollten mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) hergestellt werden - behandelte Wasser restliche RNase zu zerstören. Für DEPC Behandlung, fügen DEPC (1 ml pro Liter), kräftig schütteln, bis alle DEPC Globuli verschwunden sind dann im Autoklaven die DEPC abzubauen. 1. RNA-Sondensynthese <ol><li> ACHTUNG: Bei der Formamid Handhabung Persönliche Schutzausrüstung (PSA) und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Hybridisierungspuffer: DEPC-behandeltem deionisiertes Wasser mit 50% (v / v) entionisiertes Formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml Hefe-tRNA, 1 × Denhardt-solution und 10% w / v Dextran-Sulfat. </li><li> Wählen Sie eine DNA-Klon, der die cDNA-Sequenz des Gens von Interesse in einem Plasmid mit RNA Polymerase-Promotoren enthält. Für dieses Beispiel verwenden , um ein pCMV-SPORT6 Klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), mit T7 und SP6 - RNA - Polymerase - Promotoren für Aspa (Supplementary Abbildung 1). </li><li> Bereiten linearisierte Plasmid-DNA als Matrize. <ol><li> Wachsen, um die DNA-Klons, extrahieren, die das Plasmid mit einem Plasmid Purification Kit kleinräumige gemäß dem Protokoll des Herstellers und die Sequenz mit dem T7 und Sp6 universellen Primer. </li><li> Digest 1.020 ug Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das am 5&#39;-Ende des Sense-Strangs der cDNA schneidet. Für dieses Beispiel verwenden 100 Einheiten Sal I das pCMV-SPORT6- Aspa Plasmid zu verdauen. Inkubieren für 1,5 Stunden bei 37 ° C </li><li> Führen Sie einen kleinen aliquoten auf einem Agarose-Gel zu überprüfen, dass das Plasmid vollständig linearisiert. </li></ol></li><li> Reinige dielinearisierten Plasmids mit Phenol-Chloroform verwendet. <ol><li> Hinzufügen 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat, ein Volumen von 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - äquilibriert Phenol und einem Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (IAA) (24: 1). </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min bei RT (20 - 25 ° C, RT) und Extrahieren obere wässrige Phase. </li><li> Hinzufügen einem Volumen Chloroform / IAA, Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min und die obere wässrige Phase zu extrahieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.4.3. </li><li> Fügen Sie 2 Volumen Ethanol und lassen bei -20 o C für 1 h oder O / N. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Pellets mit 70% kaltem Ethanol und resuspendieren in approximativ 1 ug cDNA pro 2,5 &amp; mgr; l in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Synthesize die beiden Sonden ein, markiert mit Digoxigenin (DIG) und die andere mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC). <ol><li> Wählen Sie die entsprechende RNA-Polymerase die anti-se zu machennse Sonde (komplementär zu der Ziel-mRNA). In diesem Beispiel verwenden T7 RNA Polymerase Aspa Sonde zu machen. </li><li> Bereiten Sie in vitro Transkriptionsreaktion: add 1 ug linearisierter DNA, 4,0 ul 5 x Transkriptionspuffer, 6,0 ul 100 mM DTT, 2,0 ul 10x DIG oder FITC RNA Markierungsmischung enthält dNTPs, 1 ul RNase - Inhibitor und 20 bis 40 Einheiten der RNA-Polymerase; machen das endgültige Volumen von bis zu 20 &amp; mgr; l mit DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Inkubieren bei 37 o C für 1,5 Std. </li></ol></li><li> Run1 ul der Transkriptionsreaktion auf einem 1,0% igen Agarose-Gel zu überprüfen, ob die Reaktion gearbeitet hat. Das Gel sollte die lineare Vorlage und eine helle Band der Sonde zeigen. </li><li> Machen Sie das Volumen bis zu 100 &amp; mgr; l mit Hybridisierungspuffer und Speichern von 10 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusions, Fixierung und Gewebeentnahme <ol><li> ACHTUNG: Beim Umgang mit Paraformaldehyd (PFA), sowohl feste als auchwässrige, tragen PPE und ein Sicherheitsgehäuse. Bereiten Formaldehydlösung durch Lösen von 4% (w / v) PFA in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung unter Verwendung von Wärme (55 ° C). Filtern Sie die Formaldehydlösung mit Filterpapier. </li><li> Bereiten Saccharoselösung durch Auflösen von 20% (w / v) Saccharose in destilliertem Wasser und mit 0,1% (v / v) DEPC-Lösung. Lassen Sie O / N bei RT mit einem losen Deckel und dann Autoklaven. </li><li> Unheilbar betäuben eine Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Entzugs Reflex zeigt tiefe Narkose. </li><li> Sobald die Maus unter tiefer Narkose ist, machen einen Schnitt unterhalb des Brustkorbs und durch den Brustkorb auf beiden Seiten abgeschnitten, sie heben das Herz aussetzen. </li><li> Legen Sie eine 25-G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens. </li><li> Perfuse das Tier mit 20 ml PBS und dann 40 ml Formaldehydlösung. Für P30 und älterMäuse, verwenden Sie eine Perfusions-Rate von 12 ml / min, aber für jüngere Tiere verwenden, um eine niedrigere Rate (7 bis 10 ml / min). </li><li> Präparieren Sie das Gehirn. <ol><li> Sever mit der Maus den Kopf mit einer chirurgischen Schere durch einen Schnitt posterior von den Ohren zu machen. Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in der Haut und arbeiten rostral die Haut von Schädel zu entfernen. </li><li> Ausgehend von der Schwanzteil, schneiden durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen mit Iris Schere. Entfernen Sie die parietalen und frontalen Knochenplatten von einer Seite einer Knochenplatte Kippen jedes Mal, und schnappen sie mit einer Pinzette aus. </li><li> Kippen Sie vorsichtig das Gehirn nach oben von dem vorderen Teil mit einer Pinzette und schneiden Sie die Sehnerven und andere Hirnnerven. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gehirn in eine Maus koronalen Hirn Matrix. Schneiden Sie das Gehirn in 3 etwa 4 mm Stücke mit einer Feder Rasierklinge. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben in 4% PFA-Lösung und Inkubation O / N bei 4 ° C. </li><li> Transfer GehirnScheiben bis 20% Saccharoselösung DEPC-behandeltem und O / N bei 4 ° C inkubieren </li><li> Legen Sie jedes Gehirn Scheibe in einem trockenen cryomould, umgeben mit optimale Schnitttemperatur (OAT) Medium und frieren auf Trockeneis. Bei -80 ° C. </li></ol> 3. Kryoschneiden <ol><li> Cut 15 &amp; mgr; m Abschnitte von gefrorenem Gewebe in einem Kryostaten und sammeln die Schnitte auf Objektträger. Bei Bedarf benetzen die Abschnitte mit DEPC-PBS und glätten sie mit einem feinen Pinsel. </li><li> Lassen Sie die Folien für etwa 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe auf dem Objektträger anhaftet. </li></ol> 4. Die Hybridisierung <ol><li> Vorbereitung 65 ° C Waschpuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x saline Natriumcitrat), 50% (v / v) Formamid und 0,1% (v / v) Tween- 20. </li><li> Bereiten MABT Puffer: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5. </li><li> Verdünnen Sie die beiden Sonden (DIG-markierten und FITC-labelled) 1 / 1.000 in Hybridisierungspuffer vorgewärmt auf 65 ° C und gut mischen. </li><li> Bewerben um 300 ul Hybridisierungsmischung auf jeder Folie, coverslipwith Ofen gebacken (200 ° C) Deck und Inkubation O / N bei 65 ° C in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Die Objektträger in eine Coplin-Gefäß vorgewärmten Waschpuffer enthält. Waschen der Objektträger 30 min zweimal bei 65 ° C mit Waschpuffer. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 10 Minuten dreimal mit MABT bei RT. </li></ol> 5. Visualisierung des FITC-Sonde <ol><li> Vorbereitung ISH Blockierungspuffer: MABT mit 2% Blockierungsreagenz und 10% Hitze-inaktiviertes Schafserum. </li><li> Optional: eine hydrophobe Stift Kreise um die Gewebeabschnitte auf der Folie zeichnen das Volumen der Antikörperlösungen zu reduzieren. </li><li> Inkubieren der Objektträger für 1 h bei RT mit ISH-Puffer in einer befeuchteten Kammer blockiert. </li><li> Inkubieren Sie die Dias O / N bei 4 ° C mit einem Meerrettich-Peroxidase (POD) - Konjugatd anti-FITC-Antikörper Blockierungspuffer 1/500 (v / v) in ISH verdünnt. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Coplin Gefäß mit PBS mit 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). 3 x waschen für 10 min in PBST und ersetzen mit frischem PBST jedes Mal. </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch bereiten die fluoreszierende Tyramidesters durch 100-mal in die Amplification Verdünnungsmittel verdünnt wird. Für dieses Beispiel verwenden FITC-Tyramidesters. </li><li> Fügen Sie diese auf den Schlitten und lassen für 10 min bei RT. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Glasküvette und waschen 3 Mal in PBST 10 min. </li></ol> 6. Visualisierung der DIG-Sonde <ol><li> Bereiten 0,1 M Tris- HCl pH-Wert 8,2. </li><li> Inkubieren der Objektträger mit ISH Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT. </li><li> Inkubieren der Objektträger O / N bei 4 ° C mit einer alkalischen Phosphatase (AP) -konjugiertem anti-DIG-Antikörper, verdünnt 1 / 1.500 (v / v) in ISH Blockierungspuffer. </li><li> Waschen Sie mit MABT für 10 Minuten dreimal. </li><li> Wasche zweimal mit 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 für 5 min bei RT. </li><li>Unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet Fast Red-Lösung, indem die Tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2 gelöst wird. Filtern der Lösung durch einen 0,22 um-Filter. </li><li> Inkubieren der Objektträger bei 37 ° C mit Fast Red-Lösung in einer befeuchteten Kammer. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, überprüfen Sie die Dias regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop die Bildung von Niederschlag zu überwachen. Für dieses Beispiel Die Reaktion nach 2 - 3 Stunden. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li></ol> 7. Immunhistochemie <ol><li> Bereiten IHC Blockierungspuffer: 10% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host) in PBST. </li><li> Inkubiere Objektträger mit IHC-Puffer für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. </li><li> Bereiten primäre Antikörper: den primären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% Serum verdünnt (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper Host). Für dieses Beispiel verwenden, um ein Kaninchen-Anti-Olig2 Antikörper bei 1/400 (v / v) Verdünnung. </li><li>Inkubieren in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li><li> Bereiten sekundären Antikörper: Verdünnen ein Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung in PBST mit 5% (v / v) Serum (von einer anderen Spezies zu primärem Antikörper host) und 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Für dieses Beispiel Gebrauch ein Esel-anti-Kaninchen-Alexa647 sekundären Antikörper bei 1 / 1,000 (v / v) Verdünnung. </li><li> Inkubieren in der sekundären Antikörperlösung bei RT für 1 Std. </li><li> Waschen mit PBST 10 min dreimal. </li></ol> 8. Montage <ol><li> Trocknen teilweise die Folien bei RT und Halterung mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie die Folien Bild, um zu trocknen und dann in einem konfokalen Mikroskop unter 10X, 20X und 63X Ziele unter Verwendung von 4 verschiedenen Kanälen mit den folgenden Anregungswellenlängen: 570 nm für Fast Rot, 488 nm für FITC, 647 nm für Olig2 Immunmarkierung und 350 nm für Hoechst . </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieses Protokoll stellt eine Schritt- für -Schritt - Verfahren für ein Doppel RNA in situ Hybridisierung von Immunfärbung gefolgt. Wir haben dieses Protokoll verwendet , um zu bestätigen , dass Aspa in reifen Oligodendrozyten in mehreren Bereichen des Gehirns exprimiert wird . Diese mehrstufigen Verfahren hat viele potenzielle Gefahren, die Empfindlichkeit beeinflussen können und sollten vermieden werden. Zuerst werden alle Lösungen und Speicherpuffer für die Transkr...

Gliazellen, die die am häufigsten vorkommenden Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS) sind, umfassen Oligodendrozyten (die myelinisierenden Zellen von ZNS), Oligodendrozyten Vorläufern (OPs, die auch als &quot;NG2 cells&quot; bekannt), Astrozyten und Mikroglia. Es gibt in den Funktionen von Gliazellen und ihre mögliche Rolle bei neurologischen Krankheiten 1 wachsendes Interesse. Zum Beispiel Canavan - Krankheit (CD) ist eine erbliche früh in der Kindheit beginnen neurodegenerative Erkrankung mit spongiformen Leukodystrophie und einem fortschreitenden Verlust von Nervenzellen, die zum Tode führen in der Regel vor 10 Jahren 2,3. Mutationen im Aspartoacyclase (ASPA) Gen , das drastisch führen zu einer verminderten Aktivität ASPA 4 in CD identifiziert worden. ASPA ist ein Enzym , das Deacetylierung von N-Acetylaspartat (NAA) Katalysieren, ein Molekül stark in Gehirn konzentriert, Erzeugen Acetat und Aspartat 5-7. Viele CD-Patienten zeigen eine höhere NAA wegen des Mangels an ASPA acvität. Einige Studien spekulieren , dass NAA abgeleitete Acetat eine wichtige Quelle von Fettsäuren / Lipiden im Gehirn während der Entwicklung sein könnte und CD können sich aus Myelinsynthese vermindert während durch den Ausfall von NAA verursacht Entwicklung 3,5,6 abgebaut werden. ASPA wird vorwiegend in der Niere, der Leber und der weißen Substanz des Gehirns und die wichtige Rolle der ASPA in CD gegeben, die zelluläre Expression dieses Enzyms im Gehirn wurde von mehreren Labors untersucht worden. Mit Blick auf ASPA enzymatische Aktivität im Gehirn gefunden früheren Studien , dass die Zunahme in ASPA Aktivität während der Entwicklung des Gehirns verläuft parallel den zeitlichen Verlauf der Myelinisierung 8-10. Auf zellulärer Ebene, Assays für enzymatische Aktivität sowie in situ - Hybridisierung (ISH) und Immunhistochemie (IHC) Analysen legen nahe , dass ASPA hauptsächlich in Oligodendrozyten im Gehirn exprimiert wird , aber nicht in Neuronen oder Astrozyten 11-16. Einige Studien fanden heraus, dass ASPA könnte auchwerden in Mikroglia im ZNS 12,14 ausgedrückt. Bisher Daten über ASPA Ausdruck in OPs sind begrenzt. Nach einer aktuellen Studie , in Transkriptomen verschiedener Zelltypen in der Maus Hirnrinde einschließlich Neuronen, Astrozyten, OPs, neugebildeten Oligodendrozyten, myelinisierenden Oligodendrozyten, Mikroglia, Endothelzellen und Perizyten durch RNA - Sequenzierung analysiert wurden 17 wird ASPA ausschließlich in Oligodendrozyten exprimierten insbesondere Oligodendrozyten in myelinisierende (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Trotz dieser Studien über ASPA Expressionsmuster im Gehirn, noch eine Reihe von Unsicherheiten. Verschiedene Techniken können zum Studium von Genexpressionsmustern verwendet werden. IHC ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Bestimmung der Funktionsprodukt Erfassen (dh Protein) einer Genexpression in Gewebeschnitten. Trotz seiner großen Nutzen, diese Technik hat seine Grenzen, deren Anwendung und Spezifität Thema t sindo der Verfügbarkeit und Spezifität des Antikörpers erforderlich. Im Vergleich dazu hat ISH den Vorteil, dass sie die Expression eines beliebigen Gens auf mRNA-Ebene zu offenbaren. mehrere Sonden kann es jedoch technisch schwierig zu verwenden, die gleichzeitig um eine Gen-Expression zu speziellen Zelltypen zu lokalisieren. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll RNA Doppel Fluoreszenz in situ - Hybridisierung mit Fluoreszenzimmunmarkierung eines Proteins verbinden. Wir haben diese Reihe von Techniken verwendet , um die Expressionsmuster von Aspa in Maushirn zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die genaue Untersuchung der Genexpression unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>for ISH blocking buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt&#039;s solution</td><td>Life Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa cDNA clone</td><td>Source Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Equilibrated phenol</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher scientific</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Coronal Brain Matrix</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Personna Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/microtome</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>for 65 &amp;deg;C wash buffer</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-FITC POD-conjugated antibody</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&amp;trade; Plus Fluorescein System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-DIG AP-conjugated</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast red tablets</td><td>Roche</td><td>11496549001</td><td></td></tr><tr><td>.22 &amp;micro;M filter</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Olig2 Rabbit antbody</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647-conjugated &amp;alpha;-rabbit antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

Nachweis der Genexpression in verschiedenen Arten von Gehirnzellen , beispielsweise Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia - Vorläufern kann durch das Fehlen von spezifischen primären oder sekundären Antikörper für Immunfärbungs behindert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll , die Expression von drei verschiedenen Genen im gleichen Hirnschnitt mit doppelseitigem Fluoreszenz in situ Hybridisierung mit zwei genspezifischen Sonden durch Immunfärbung mit einem Antikörper , der eine hohe Spezifität gegenüber dem durch ein drittes Gen kodierte Protein gerichtet ist, gefolgt zu detektieren. Die Aspartoacyclase (ASPA) Gen, Mutationen , von denen einer seltenen menschlichen Erkrankung der weißen Substanz führen kann - Canavan Krankheit - Es wird angenommen , in Oligodendrozyten und Mikroglia exprimiert werden , aber nicht in Astrozyten und Neuronen. Allerdings hat die genaue Expressionsmuster von ASPA im Gehirn noch etabliert werden. Dieses Protokoll hat uns erlaubt, zu bestimmen, dass ASPA in einer Untergruppe von reifen Oligodendrozyten a ausgedrückt wirdnd sie kann allgemein auf einen weiten Bereich von Genexpressionsmuster Studien angewendet werden.

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren für eine ISH Doppelfluoreszenz gefolgt von Immunmarkierung in Mausgehirnschnitte. Eine kurze Beschreibung dieses Protokolls ist in Abbildung 1. Der erste Schritt gezeigt Sonden synthetisieren war spezifisch für Aspa und MBP (myelin basic protein). Um zu überprüfen, dass die Sonden synthetisiert worden war, ein kleines Aliquot jeder Reaktion wurde auf einem Agarosegel laufen gelassen. Das schwache lineare Templ...

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Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

13.1K Aufrufe.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Serie: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Entwicklungsbiologie

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative approaches are widely used to handle the tissue sections during the staining procedure, one approach consists of mounting the sections directly on glass slides, while a second approach, the free-floating, allows for fixed sections to be maintained and stained while suspended in solution. Although slide-mounted and free-floating approaches may yield similar results, the free-floating technique allows for better antibody penetration and thus should be the method of choice when thicker sections are to be used for 3D reconstruction of the tissues, for example when the focus of the experiment is to gain information on dendritic and axonal projections in brain regions. In addition, since the sections are kept in solution, a single aliquot can easily accommodate 30 to 40 sections, handling of which is less laborious, particularly in large-scale biomedical studies. Here, we illustrate how to apply the free-floating method to fluorescent immunohistochemistry staining, with a major focus on brain sections. We will also discuss how the free-floating technique can easily be modified to fit the individual needs of researchers and adapted to other tissues as well as other histochemical-based stainings, such as hematoxylin and eosin and cresyl violet, as long as tissue samples are properly fixed, typically with paraformaldehyde or formalin.

The free-floating technique allows researchers to perform histological-based stainings including immunohistochemistry on fixed tissue sections to visualize biological structures, cell type, and protein expression and localization. This is an efficient and reliable histochemical technique that can be useful for investigating a multitude of tissues, such as brain, heart, and liver.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Biologie

 Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections

<a href='https://app.jove.com/v/53976/combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling'>Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (2016).</a>This video demonstrates the use of double fluorescence in situ hybridization to visualize the expression of two RNA targets in mouse brain sections. The protocol involves sequential detection of RNA using probes labeled with fluorescein isothiocyanate and digoxigenin, followed by enzymatic signal amplification to enhance sensitivity. The resulting fluorescence enables co-localization analysis of the target RNAs within the tissue.

Source: Jolly, S., et.al. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse ...

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Performing Double Fluorescence In Situ Hybridization to Detect Gene Expression in Mouse Brain Sections