Name: silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
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This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. Bereiten siRNA-Lösungen <ol><li> Resuspendieren 5 nmol von verschlüsselten (Strg) und 5 nmol BRCA2 siRNA getrockneten Pellets in 100 ul RNase-freies Wasser (final siRNA-Konzentration: 50 um). Dies ist die siRNA Lager und muss bei -20 ° C in 10 &amp; mgr; l Aliquots gelagert werden. </li><li> Einen aliquoten von 10 &amp; mgr; l von der siRNA Lager und fügen Sie 40 ul RNase-freies Wasser, das 10 uM siRNA Arbeitslösung zu erhalten. Diese Verdünnung ist bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. HINWEIS: Die siRNA Arbeitslösung sollte nicht unterzogen Einfrieren / Auftauen mehr als 3 mal. </li></ol> 2. Seeding der Menschen Epithelzelllinien <ol><li> Entfernen des Wachstumsmediums aus menschlichen epithelialen Zellinien wachsen als Zellmonoschichten in Gewebekulturplatten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Die Zellen in der Platte einmal mit RT PBS (10 ml PBS für eine 100 mm-Platte) zu waschen. </li><li> Um die Zellen von der Platte zu trennen,2 ml 0,25% Trypsin / 0,53 mM EDTA-Lösung und Inkubation 3-5 min, je nach Zelltyp. </li><li> Vor dem Sammeln der abgelösten Zellen neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 2 ml komplettem Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum enthielt. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 320-330 g für 3 Minuten bei 4ºC in einem Schwingbecher-Rotor. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml von Antibiotika-freiem Medium. </li><li> Zähle die Zellen unter dem Mikroskop in einer Burker Kammer oder durch Verwendung eines automatischen Zählsystem nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Seed die Zellen in 6-Well-Platten auf etwa 80% konfluent nach 24 Stunden (0,5-1 x10 6 Zellen in 2 ml Medium für jede Vertiefung) sein. Optimale Zellennummer ausgesät werden können, abhängig von den spezifischen Zellen und der Wachstumsrate variieren. HINWEIS: Antibiotika im Medium Fügen Sie nicht an dieser Stelle, weil Antibiotika negativ mit der Effizienz der transfe störenction. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen bei niedrigen Kulturpassagen (&lt;10), um einen hohen Wirkungsgrad der BRCA2 siRNA-Transfektion zu erzielen. </li></ol> 3. Transfektion von Zellen mit siRNA <ol><li> Vierundzwanzig Stunden nach der Plattierung der Zellen, fahren Sie mit der ersten Runde der Transfektion. <ol><li> Verdünnen 6 ul Lipidbasis 10 siRNA spezifischen Transfektionsreagenz in 130 &amp; mgr; l reduziert Serummedium. </li><li> Verdünnen 3 ul von 10 uM siRNA (30 pmol) in 130 &amp; mgr; l reduziert Serummedium. </li><li> Kombinieren Sie die verdünnten siRNA mit der verdünnten Transfektionsreagenz und Inkubation für 5-10 min bei RT. </li><li> Während der Inkubation, entfernen Sie das Medium aus den Zellen und 2 ml frischem Medium bei 37 ° C vorgewärmt (ohne Antibiotika). </li><li> Fügen Sie 250 ul der siRNA-Transfektionsreagenz Komplexe zu den Zellen (dieser Betrag ist für einen einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte). </li><li> Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 3776; C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Nach 24 Stunden, weiter mit der zweiten Runde der Transfektion durch Wiederholung der Schritte 3.1.1-3.1.5 mit folgender Änderung für Schritt 3.1.2: verdünnen 5 ul von 10 uM siRNA (50 pmol) in 130 &amp; mgr; l reduziert Serummedium. <ol><li> Die Zellen für 1-2 Tage bei 37 ° C vor der Analyse. HINWEIS: Zwei Runden Transfektionen und Verwendung eines Hoch siRNA / Transfektionsreagenz Verhältnis in der zweiten Runde sind unerlässlich, um hohe Effizienz der BRCA2-Silencing zu bekommen. </li></ol></li></ol> 4. Lyse Zellen für Immunoblot-Analyse <ol><li> Ansetzen Lysepuffer mit PBS (pH 7,4), enthaltend 1% des nicht-ionischen, nicht-denaturierenden Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol, 5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumfluorid, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ml Leupeptin, 10 ug / ml Aprotinin. Halten Sie es auf Eis. </li><li> Entfernen des Mediums von den Zellen und wAsche sie einmal mit kaltem PBS (2 ml / Vertiefung) in der Platte. Um jede PBS Verschleppung zu vermeiden, vollständig zu entfernen von der Platte. </li><li> Zugeben von 200 &amp; mgr; l Lysepuffer zu jedem Well. HINWEIS: Die Zellen müssen auch für andere Tests verwendet werden, trypsinize die Zellen wie in Schritt 2.1-2.6 beschrieben und Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Puffer / Medium gemäß der Anwendung eingesetzt werden. </li><li> Drehen Sie vorsichtig die Platte gleichmäßig zu verteilen das Lyse-Puffer und Inkubation für 15 min bei 4 ° C auf einem Rotator. </li><li> Sammeln des Zelllysats in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem Zellschaber. </li><li> Zentrifuge bei 17.900 xg für 25 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstands in ein neues Röhrchen. </li><li> Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Protein-Assay gemß den Herstelleranweisungen. </li></ol> 5. BRCA2 Immunoblotting-Analyse <ol><li> Bereiten Sie den Laufpuffer durch Verdünnung von 50 ml 20x Tris-Acetat SDS Lauf buffer (50 mM Tricin, 50 mM Tris-Base, 0,1% SDS, pH-Wert 8,24) mit 950 ml destilliertem Wasser. </li><li> Vorbereitung der Probe wie folgt: in 15 ug Gesamt-Zelllysat wurden 5 ul 4x Probenpuffer, Lithiumdodecylsulfat bei pH 8,4, 2 ul 10x Probe Reduktionsmittels (0,5 M DTT) und Lyse-Puffer auf ein Endvolumen von 20 ul. Hinweis: Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von BRCA2 in normalen Zelllinien auch bei Verwendung einer geringeren Menge an Gesamtproteinen (bis auf 5 ug). </li><li> Denaturieren Proben bei 55 ° C für 10 min. Hinweis: Es ist wichtig, auf 55 ° C zu verwenden. Seit BRCA2-Protein ist thermo 11 führen höhere Denaturierung Temperaturen in Einklang Verlust der intakten voller Länge (390 kDa) BRCA2-Protein. </li><li> Die elektrophoretische Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt. </li><li> Laden Sie die Proben und 10 ul mit hohem Molekulargewicht vorgefärbten Proteinstandard auf vorgefertigte Gel (Tris-Acetat 8.3%) und bei 120 V für ab laufenout 2 h 12. Stoppen Sie den Elektrophoreselauf bevor die 55 kDa blaue Markierung lässt die vorgefertigte Gel. </li><li> Bereiten Sie den Transferpuffer mit 50 ml 20x Transferpuffer, 100 ml 100% Methanol und 850 ml Wasser. </li><li> Aktivieren PVDF-Membran (0,45 um Porengrße) durch Einweichen in 100% Methanol für 5 min mit destilliertem Wasser gespült und in Transferpuffer äquilibriert für mindestens 5 min. Weichen Sie die Schwämme der Transfervorrichtung in Transferpuffer bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Wenn die Elektrophoreselauf vorbei ist, montieren Sie die Sandwich in der Transferstapel in der folgenden Reihenfolge (von unten nach oben): Drei Schwämme in Transferpuffer gesättigt, ein 3MM Grade Blatt Papier in Transferpuffer, Gels, aktiviert PVDF-Membran, einer gesättigten 3MM Grade Blatt Papier in Transferpuffer gesättigt, drei Schwämme in Transferpuffer 13,14 gesättigt. Platzieren des Stapels in die Vorrichtung und das Transferproteine ​​bei 350 mA für 4 Stunden bei 4 ° C oder bei 180 mA über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Being BRCA2 ein sehr großes Protein ist, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Übertragungszeit von 1 h bis 4 h erstrecken oder über Nacht (wie durch den Hersteller und die meisten Übertragungsprotokolle vorgeschlagen), um eine vollständige Übertragung der hochmolekularen Proteine ​​zu gewährleisten. Darüber hinaus aufgrund der langen Transferzeit ist es wichtig, die Blotting in einem Kühlraum bei 4 ° C durchzuführen, um eine Überhitzung zu minimieren und zu erleichtern Sandwich-Demontage. Halbtrockentransfersysteme sind nicht gut für die Übertragung von großen Proteinen. </li><li> Nach dem Transfer, waschen der Membran mit TBS, blockieren für 1 h bei RT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T), das 5% fettfreie Trockenmilch und der Sonde über Nacht bei 4 ° C mit 30 &amp; mgr; l anti-BRCA2 polyklonaler Kaninchen-Antikörper ( 200 ug / ml) in 9 ml TBS-T + 5% fettfreier Trockenmilch verdünnt [1: 300 (v / v) Verdünnung]. </li><li> Dreimal (jeweils 10 Minuten) mit TBS-T Waschen der Membran dann Inkubieren der Filter für 1 h mit 1 &amp; mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper in 10 ml TBS-T + 5% fettfreier Trockenmilch. Danach waschen Sie die Membran drei Mal (jeweils 10 Minuten) mit TBS-T. </li><li> Führen Immundetektion von ECL zu BRCA2-Proteins aufdecken Verwendung verstärkter Chemilumineszenz (ECL) Western Blotting Nachweisreagenz nach den Anweisungen des Herstellers. Visualisieren immunochemiluminescent Bands auf hochauflösende ECL-Filme. </li><li> Zuführen Immunodetektion mit einem Antikörper für ein Housekeeping-Gen, wie β-Tubulin (55 kDa), auf dem gleichen Filter als Ladekontrolle durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörper gegen β-Tubulin einer Verdünnung von 1: 1000 (10 ul von Anti-Tubulin-Antikörper in 10 ml TBS-T + 5% fettfreie Trockenmilch) für 1 h bei RT. Waschen und Inkubieren sekundären Antikörper für BRCA2 (5,10-5,11) beschrieben, mit Ausnahme der Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Maus anstelle von Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper. </li><li> Erwerben Sie ein digitales Bild der mit immunochemiluminescent Bands beeindruckt Filme und die Bandenintensität von engagierten Bildanalyse-Software zu analysieren (zB., ImageJ). </li></ol>

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	<li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2:+a+universal+recombinase+regulator.">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li><li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair,+transcription,+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage.">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li><li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic.">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li><li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer.">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li><li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients.">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li><li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2.">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82 (2013).</li><li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma.">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li><li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death.">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li><li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems:+pharmaceutical+perspectives.">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA2:+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression.">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Western+blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer.">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li><li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2.">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li><li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+the+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer.">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li><li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction.">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Da Keimbahnmutationen des BRCA2-Gen zu einem erhöhten Risiko für verschiedene Krebsarten, einschließlich der weiblichen und männlichen Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom und 3,4, eine Reihe von Studien durchgeführt, um die biologische Funktion zu verstehen, des BRCA2-Protein. Die meisten dieser Studien sind genetisch-basierte vor allem auf technische Schwierigkeiten bei der Analyse eines Riesenprotein wie BRCA2. Die zum Dämpfen und Analysieren BRCA2-Pr...

Der BRCA2 (Brustkrebsanfälligkeit Gen-2) Gen kodiert für ein Protein, das Tumorsuppressor eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die Regelung der Funktion des Rekombinaseenzym Rad51 1 spielt. BRCA2 ist auch in der Modulation der Transkription und an der Zellzyklussteuerung 2 in Verbindung gebracht. Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen induzieren eine autosomal dominant Anfälligkeit für Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und Prostatakrebs bei Männern, als auch Veranlagung zu anderen Krebsarten 3,4. Trotz des erhöhten Risikos bei der Entwicklung von Krebs, BRCA2-Mutationen, die zu unterdrücken oder zu reduzieren BRCA2-Funktion können Krebszellen anfälliger für Chemotherapeutika, die DNA-Schäden verursachen 5-7 rendern. Sporadische Krebserkrankungen weisen eine niedrige Rate von BRCA2-Mutationen (&lt;3%), obwohl reduzierte Mengen an BRCA2-Protein wurden bei einigen Krebsarten festgestellt, was darauf hindeutet, dass die BRCA2-Proteinkann während der Tumorgenese in sporadische Krebserkrankungen durch nicht-Mutationsabhängige Mechanismen 7,8 verloren. Somit ist es wichtig, BRCA2 Funktionen im Zusammenhang mit der Krebsbiologie sowie in anderen biologischen Systemen vollständig verstehen. Ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Funktionen eines Gens in Säugetierzellen zu identifizieren, ist seine Expression unterdrücken. Als ein Beispiel hat Silencing BRCA2-Expression in einer Vielzahl von normalen Epithelzellen kürzlich zur Identifizierung eines neuartigen Funktion BRCA2 als Regulator der anoikis Beständigkeit ein wichtiger Schritt bei der Erfassung von Krebszell invasive und metastatische Fähigkeit 9 geführt. Gen-Silencing kann durch die Einführung in den Zellen entweder small interfering (si) RNA oder short hairpin (sh) RNA-Moleküle gezielt den spezifischen Gens erreicht werden. Die hohe Wirksamkeit der siRNA und seine Benutzerfreundlichkeit machen es die bevorzugte Werkzeug für Silencing-Experimente bei der Gewinnung neuer Erkenntnisse über kritische biologische Prozesse richtet einnd neue therapeutische Targets zu identifizieren. Jedoch kann effizient Zuschlags der Genexpression nicht für alle Gene leicht erreichbar sein und kann sehr unterschiedlich sein, je nach dem Zelltyp. Weil eine Abnahme der intrazellulären Proteinspiegel der relevanteste Phänotyp untersuchten, ist es wichtig, das Gen-Silencing durch Immunoblotting-Analyse des Genprodukts zu quantifizieren. In dieser Hinsicht stellt der BRCA2-Protein eine weitere Herausforderung: ein großes Protein (etwa 390 kDa), haben technische Schwierigkeiten bei herkömmlichen biochemischen Analyse, einschließlich Immunoblotting existieren. Wir berichten hier über ein Protokoll für die effiziente Silencing von BRCA2 in humanen epithelialen Zelllinien und für die schnelle und erfolgreiche Detektion von BRCA2-Protein durch Immunoblotting-Analyse Knockdown optimiert.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&amp;nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075&quot;&gt;13778075&lt;/a&gt;</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium for transfection procedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Prestained marker for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&amp;nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Skim Milk powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescence system</td></tr><tr><td>PNT1A cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td></tr><tr><td>Nthy cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit for cell proliferation assays</td></tr></tbody></table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins BRCA2 und seine Erkennung durch herkömmliche biochemische Analysen stellen eine große technische Herausforderung auf Grund der Größe des menschlichen BRCA2-Protein (etwa 390 kDa). Wir berichten Modifikationen von Standard siRNA-Transfektion und Immunoblotting Protokolle menschlichen BRCA2 endogenen BRCA2-Protein, bzw. in humanen epithelialen Zellinien auszuschalten und zu detektieren. Die wichtigsten Schritte sind, um eine hohe siRNA Transfektionsreagenz Verhältnis und zwei weiteren Runden von siRNA-Transfektion in demselben Experiment. Mit diesen und anderen Modifikationen an dem Standardprotokoll wir mehr als 70% Inaktivierung des menschlichen BRCA2 konsistent zu erreichen, wie durch Immunoblotting mit anti-BRCA2-Antikörpern beurteilt. Zusätzlich Denaturierung der Zelllysate auf 55 ° C anstatt der üblichen 70-100 ° C und anderen technischen Optimierungen des Immunoblotting Verfahren den Nachweis von intakten BRCA2-Protein selbst when sehr geringe Mengen an Ausgangsmaterial zur Verfügung stehen oder wenn BRCA2 Proteinexpressionsniveaus sehr niedrig sind. Effiziente Silencing von BRCA2 in menschlichen Zellen bietet eine wertvolle Strategie zur BRCA2-Funktion in Zellen mit intakten BRCA2, einschließlich Tumorzellen unterbrechen, um neue molekulare Signalwege und zellulären Funktionen, die durch pathogene BRCA2-Mutationen in Tumoren betroffen sein können, zu prüfen. Anpassung dieses Protokoll für die effiziente Schalldämpfung und Analyse von anderen &quot;großen&quot; Proteine ​​wie BRCA2 sollte leicht erreichbar sein.

Bevor mit einer biologischen / biochemischen Test fortfahren, um die Wirkung der BRCA2-Unterdrückung auf Zellfunktionen zu untersuchen, ist der erste Schritt, um die Spezifität des Silencing unter Verwendung eines verschlüsselten siRNA (Non-Targeting-siRNA) Seite an Seite mit BRCA2 siRNA (1A bestätigen ). Es ist wichtig, eine zweite Runde von siRNA-Transfektion mit einem hohen siRNA / Transfektion Verhältnis durchzuführen, um einen hohen Wirkungsgrad der BRCA2-Silencing zu erhalt...

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Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Silencing<em&gt; BRCA2</em&gt; Zum Novel BRCA2-regulierten Biologische Funktionen in kultivierten menschlichen Zellen zu identifizieren

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

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Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K Aufrufe.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Serie: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Forschung

Krebsforschung

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Medizin

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Funktionsbewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Biologie

Untersuchung des Ausmaßes von DNA-Brüchen während der DNA-Replikation 

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during genome duplication can stall replisomes and convert replication forks into double-strand breaks. If left unrepaired, these toxic DNA breaks can trigger chromosomal rearrangements, leading to heightened genome instability and an increased likelihood of cellular transformation. Additionally, cancer cells exhibit persistent replication stress, making the targeting of replication fork vulnerabilities in tumor cells an attractive strategy for chemotherapy. A highly versatile and powerful technique to study DNA breaks during replication is the comet assay. This gel electrophoresis technique reliably detects the induction and repair of DNA breaks at the single-cell level. Herein, a protocol is outlined that allows investigators to measure the extent of DNA damage in mitotically dividing human cells using fork-stalling agents across multiple cell types. Coupling this with automated comet scoring facilitates rapid analysis and enhances the reliability in studying induction of DNA breaks.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der Rolle von SNF2L bei der Stabilität von Replikationsgabeln und Genomduplikation

This protocol is designed to investigate the extent of DNA damage occurring during DNA replication. Under neutral conditions, the induction of DNA breaks can be readily assessed within a short time frame. Additionally, the protocol is adaptable to other cell types and various replication stress reagents.

Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

Silencing

Zusammenfassung

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Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Funktionsbewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-mediated Base Editors

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung

Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay

Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay