Die Autoren möchten Bofan Wu und Christian Raithel für technische Hilfe und Michael Rieger herzlich für seine Einführung in die Live-Cell-Imaging. Unterstützt durch NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Department of Defense W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) Programm durch die National Research Foundation of Korea durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (R31-10069) finanziert (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Rodent Barrier Einrichtung Equipment) und NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopie und Imaging and Animal Freigegebene Ressourcen).

<html> Ein. Insgesamt Scheme <ol><li> Generieren Primärkulturen von präneoplastischen Brustepithelzellen aus Brustdrüsen von gentechnisch hergestellten und zu steuern Wildtyp-Mäusen. </li><li> Nehmen Sie live-cell Bilder alle 15 min mit Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) für bis zu 5 Tagen. </li><li> Erfahren Zeitraffer-Bilder direkt auf Timing und den Mechanismus der Epithelzelle Koloniebildung, Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen beurteilen. </li><li> Konvertieren Volocity generiert. TIFF Stacks. JPG-Dateien mit MetaMorph Microscopy Automation &amp; Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) und rename digitalen Bilddateien (THE Rename 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / System / File-Management / THE-Rename.shtml</a> ), um die Kompatibilität mit Tracking Tool Timm-Software (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Mit TTT erzeugen Zellschicksals Karten für die Ermittlung der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauer) und Muster der Zellteilung (symmetrischen gegenüber asymmetrischen). </li><li> Analysieren quantitative Daten aus den Stufen 3 und 5, um festzustellen, ob statistisch signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Mausmodellen gentechnisch und / oder Wildtyp-Steuerelemente sind. </li></ol> 2. Generation of Primary Brustepithelzellen Zellkulturen <ol><li> Bereiten Komplette Medien zur Isolierung von einzelnen Brustepithelzellen nach einer Variation des Herstellers (EpiCult-B Maus Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Kombinieren Sie 450 ml Epi-Cult-B-Medium, 50 ml Epi-Cult B Verbreitung Ergänzung, 5% Fetal Bovine Serum (FBS), 50 ug / ml Penicillin / Streptomycin (PenStrep) und 10 ng / ml Epidermal Growth Factor (EGF). </li><li> Bereiten Dissoziation Medien durch die Kombination von 1 Teil eines 10x Collagenase / Hyaluronidase Mischung mit 9 Teilen Komplett Media von 2,1. </li><li> Einschläfern Maus und sofort zur seziert. Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Styropor-Autopsie-Plattform und sichern Sie alle vier Gliedmaßen so ventrale Haut ist straff. Sättigen ventralen Haut und Haar, einschließlich, dass die über den Gliedern, mit 70% Ethanol. Expose # 2/3 (Thorax) und # 4/5 (inguinal) Brustdrüsen, indem Sie einen Medianschnitt durch die Haut (nicht in das Bauchfell), die in einer Y-Schnitt durch die mediale Haut jedes vorderen Gliedmaßen und wird verlängert eine umgedrehte Y Schnitt durch die mediale Haut jedes hinteren Extremität. </li><li> Mit stumpf, trennen die Haut vor underlyingperitoneum, ziehen wieder auf beiden Seiten der Haut, bis es gespannt ist, und befestigen Sie es an den Styropor-Sektion Plattform mit Pins. Ausgehend von der Außenseite, verwenden Sie stumpfe Dissektion mit gezielten Einsatz von dissection Schere zu isolieren die intakte inguinal und / oder Thorax Milchdrüsen aus den zugrunde liegenden Bindegewebe und Muskulatur. Nicht mehr als zwei Milchdrüsen in einem 10 cm sterile Petrischale und zu bewegen, um Gewebekultur Kapuze. </li><li> In Gewebekulturen Kapuze, untersuchen Verschraubungen für Mamma Lymphknoten, die als kleine, gut abgegrenzte Knötchen mit einer gelblichen Farbe identifiziert werden. Entfernen Lymphknoten aus der umgebenden Drüse mit sterilen Skalpell und Pinzette. Mince Brustgewebe in ~ 1 mm 3 Würfel mit zwei sterilen Skalpellen, ein in jeder Hand. </li><li> Ort zerkleinert Brustgewebe in 5 ml Dissoziation Media, Mischung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 2-3 mal mit einer 10 ml Pipette, und über Nacht (bis zu ~ 16 h) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 in einem 50 ml konischen Röhrchen mit gelockerten Kappe. </li><li> Am nächsten Morgen, bereiten eine kalte Mischung aus Balanced Salt 1 Teil Hanks &#39;Solution (HBSS) mit 2% FBS und 4 Teilen gepufferte Ammoniumchloridlösung auf rot bl fördernood Zelllyse (HFAmCl) sowie kaltem HBSS mit 2% FBS (HF) ergänzt. Pre-warm Trypsin-EDTA (0,25%), Modified 5 mg / ml Dispase in Balanced Salt Hank-Lösung, 1 mg / ml DNase I und Complete Media. </li><li> Nehmen Sie die konische Zentrifugenröhrchen mit dem Brustgewebe aus dem Inkubator und sanft pulsieren Vortex 2-3 sec zweimal. Zentrifugieren bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in einem Minimum von 10 ml HFAmCl und Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> 3 ml Trypsin-EDTA zu dem Pellet und mischen zuerst mit einer 5 ml-Pipette und dann mit einer Mikropipette bis P1000 fadenziehend (1-3 min). 10 ml HF, Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> 2 ml 5 mg / ml Dispase und 200 ul 1 mg / ml DNase I zu dem Pellet und mischen mit einem P1000 Mikropipette für 1 min. Die Probe sollte clo werdenudy aber nicht faserig. Wenn sehnig, mit 100 ul von DNase I und nochmals mischen. </li><li> 10 ml kaltem HF, Belastung durch ein 40 um Zellsieb und Zentrifuge bei 450 × g für 5 min (Raumtemperatur oder 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Endpellet in Complete Media. Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen (unter Verwendung eines Hämozytometers oder Coulter Counter). Zwei Milchdrüsen die ungefähr 1 x 10 6 bis 1 x 10 7 Zellen. Platte primären Epithelzellen in einem flachem Boden 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung. </li></ol> 3. Live-cell Imaging <ol><li> Unmittelbar nach Ausplattieren der Zellen, platzieren Sie den 6-Well-Platte sicher auf einem Mikroskoptisch in einem 5% CO 2 / gesättigte humidity/37 ° C Temperatur Inkubationskammer. Stellen Sie den Kondensator für Kohler Beleuchtung und in der Mitte die Phase Ringe. Für die Experimente hier vorgestellten Spinning eine invertierte Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Disc KonfokaleMikroskop-System in Weitfeld Phasenkontrast-Modus mit einem 10x Objektiv verwendet wurde. </li><li> Offene Bildaufnahme-Software, erstellen und benennen eine Bibliothek für die Zeitraffer-Aufnahmen, und speichern Sie an einen Ort mit ausreichend Platz für große Dateien. Die Experimente hier vorgestellten genutzt Volocity Bildaufnahme-Software (Version 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Damit die Platte im Mikroskop Inkubator für mindestens 15 min sich ausgleichen lassen. Senken Sie die Linsen auf die Bühne-lens Interferenzen zu vermeiden. Unter der &quot;Stage&quot; Überschrift, wählen Sie &quot;Kalibrieren Bühne.&quot; Rückkauf der Fokalebene, Set Z = Null unter den x, y, z Registerkarte und markieren Bildgebung Punkten durch Auswahl von &quot;Add point&quot; im Rahmen der &quot;Stage&quot; Überschrift. Platz Punkte in der Mitte jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen als zur Abbildung der Phasenkontrast-Abbildung kann in der Nähe der Peripherie des Kunststoffvertiefungen verzerrt. Vereinbaren Punkten auf einem Platz in 4 x 4 Felder (650 um x 700 um Felder), die jeweils mit einer kleinen Überlappung (ca. 5%). Speichern Sie die ausgewählten Punkte unter &quot;Stage &quot;. </li><li> Unter &quot;Stage&quot; &quot;Make Fokus map&quot; und folgen Sie den Anweisungen, um den Fokus von jedem Punkt zu setzen. Set Bildaufnahme Timing zu 4 Bilder pro Stunde (alle 15 min) zu erfassen. Dies kann eingestellt abhängig von den Anforderungen der spezifischen Experiment werden. Speichern Sie die Fokus-Karte unter &quot;Stage&quot;. </li><li> Rechts auf der rechten Seite tool bar &quot;Image Acquisition&quot; klicken und speichern Sie die Bildeinstellungen. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Abbildung zu beginnen. Nach 1 Stunde, überprüfen Sie den Fokus der Bilder, um zu sehen, ob eine Anpassung erforderlich ist. </li><li> Überwachen und weiterhin Live-Bildgebung für 5 Tage und endet, wenn die Zellen konfluent geworden. </li></ol> 4. Direkte Anzeige von Zeitraffer-Aufnahmen, um Timing und Mechanismus der Initial Epithelial Cell Colony Formation, Inzidenz von Apoptose, und Phasing von morphologischen Veränderungen zu beurteilen <ol><li> Direkte Anzeige von Zeitraffer-Aufnahmen kann die Durchführung mit einem kompatiblen Video-Wiedergabe-Software (zB <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer oder andere Freeware oder kommerziell erhältliche Software). Bilder können in der. TIFF-Format bei diesem Schritt oder nach der Umstellung auf. JPG-Dateien (siehe Schritt 5) eingesehen werden. </li><li> Mechanismus zur anfänglichen Koloniebildung zu bestimmen, mit einer ein-Bildstapels repräsentiert ein Abbildungsstelle auf der Platte zu beginnen. In ersten Frames werden Zellen zu schweben. Folgen seriellen Bilder, um zu bestimmen, wenn der erste Epithelzelle haftet an der Platte. Bei diesem Schritt kann Epithelzellen identifiziert und differenziert von Fibroblasten durch ihren mehreren quaderförmigen Morphologie. Folgen Sie dieser einzelnen Epithelzellen über serielle Bilder und folgen ihr Schicksal über die folgenden 24 Stunden. Aufnehmen, wenn es wird umgeben von zusätzlichen Epithelzellen oder erfährt Zellteilung oder Apoptose. Wenn von Epithelzellen umgeben, kann der Mechanismus der Koloniebildung durch Betrachten direkt bestimmt werden, wenn die umgebenden Zellen aus schwimmenden Zellen, die dann mit der anhaftenden ersten Zelle (n) oder aggregieren abgeleitetaus der Division des ersten adhärenten Zellen. Notieren Sie die Anzahl der Kolonien durch Zellaggregation gegenüber Zellteilung während der ersten 24 Stunden gebildet. </li><li> Um die Anzahl der anfänglich adhärenten Zellen, die Apoptose durchlaufen über einen bestimmten Zeitraum zu bestimmen, gehen seriellen Bilder für das Aussehen von klassischen Merkmale der Apoptose in einer Zelle die Entwicklung, die bereits adhärenten hat ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), und die Anzahl der apoptotischen Zellen während der ganzen Dauer der Bildgebung oder in bestimmten Zeitfenstern identifiziert aufgezeichnet. </li><li> Im Laufe der Zeit verändern Epithelzellen in Kultur ihre Morphologie von einer Anfangsposition zu einer Quaderform mehrere längliche Erscheinungsbild konsistent mit EMT. Folgen seriellen Bilder, um die Tag / Stunde nach der Beschichtung bestimmen, wann dies geschieht. </li></ol> 5. Image File Modification <ol><li&gt; Durch die Volocity Software, exportieren Sie die Bilddateien in das TIFF-Stacks. Hier MetaMorph Microscopy Automation &amp; Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) wurde verwendet, um die TIFF-Stack-Dateien zu öffnen und sie wurden dann in MetaMorph als Single. JPG-Bilder gespeichert. </li><li> Benennen Sie die Bild Ordner und Dateien gemäß den Anforderungen für Tracking Tool Timm-Software Verwenden Sie ein Freeware-Programm wie THE Rename 2.1.6 ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ), um Dateien in Gruppen umbenennen. Erstellen Sie einen Ordner mit allen Ordnern und Dateien des Experiments und nennen Sie den Ordner (z. B. </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Erstellen Sie einen Unterordner für jeden Punkt / Position, wo die Kultur wurde abgebildet. Benennen Sie die Unterordner: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Die Positionsnummer sollten 3-stellig. Beispiel: 072511RN_p001. Legen Sie alle Bilddateien dieser einzelnen Position in den Unterordner. </li><li> Fügen Sie den Zeitpunkt (mit 5 Ziffern) und Kanalnummer (da es nur ein Hellfeldkanal, verwenden Sie &quot;0&quot;) am Ende des Dateinamens in diesem Format: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Generieren Sie eine Protokolldatei für jede Position, indem Sie zuerst den Download der kostenlosen Programm TTTlogfileconverter aus dem TTT Website. Starten Sie den TTTlogfileconverter Programm und wählen Sie das Experiment Ordner. Eingang ein Bild Intervall (in Sekunden). Für ein Bild gemacht alle 15 min, geben Sie 900 sec. Dann drücken Sie die grüne verdeckte Protokolldateien Taste. </li></ol> 6. Generation of Cell Fate Karten von Einzelzellen mit TTT <ol><li> Create einen Ordner namens TTTexport und ein Unterordner mit dem Namen TTTfiles wo alle Zellen Tracking-Daten nach TTT Software-Anweisungen gespeichert werden </li><li> Starten Sie das TTT-Programm, wählen Sie den Benutzer Initialen, und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Drücken Sie die &quot;Set NAS&quot;, wählen Sie den Benutzer erstellt &quot;TTTexport&quot;-Ordner, und klicken Sie auf Ok. In den Browser, wählen Sie ein Experiment Ordner, wählen Sie eine Position Ordner, und drücken Sie dann &quot;Load Position&quot;-Taste. </li><li> Set okuläre Faktor &quot;10x&quot;. Legen Sie die Anzahl der Bilder erforderlich (Laden aller Bilder wird zum ersten Mal empfohlen). </li><li> In Zell-Editor-Fenster, wählen Sie &quot;New Kolonie&quot; im Datei-Menü. Im Filmfenster, drücken Sie die &quot;Track Zelle&quot; oder F2 zu beginnen Verfolgung einer Zelle. </li><li> Identifizieren einer Zelle, in der Movie Fenster und verwenden Sie die Maus, um den Cursor über die Zelle zu platzieren. Ein Kreis mit der Anzahl der Zelle erscheinen soll nach F2 geklickt wurde. Verwenden Sie die Taste &quot;0&quot; auf dem Ziffernblock der Tastatur, um die Platzierung der Zelle und zum nächsten Bild zu verfolgen. Bewegen Sie den Cursor, um die Platzierung der einzelnen Zelle durch jeden Frame folgen. Um einen Titel zu löschen und zum vorherigen Bild drücken &quot;Entf&quot; auf dem Ziffernblock. Um vorwärts Frames ohne Tracking die Zelle Presse zu bewegen &quot;3&quot; und rückwärts zu bewegen, ohne Tracking press &quot;1&quot; auf dem Ziffernblock. </li><li> So markieren Sie eine Zellteilung auf die &quot;Division&quot; in der Movie-Fenster. Zum Zelltod markieren klicken Sie auf den &quot;Cell death&quot;-Taste im Filmfenster. Sobald eine Division aufgetreten ist, können die Tochterzellen in der gleichen Zelle Schicksal Karte mit der rechten Maustaste auf den Kreis Symbol der benannten Tochter Zelle in der Zelle Editor-Fenster, um das Tracking automatisch verfolgt werden. </li><li> Drücken Sie F10, um den Baum zu retten. Jeder Baum wird in den dafür vorgesehenen Ausgang fach sparener (TTTExport). Um eine neue Zellschicksals Karte zu starten, wählen Sie &quot;Neu Kolonie&quot; im &quot;Datei&quot; und dann auf &quot;Öffnen&quot;-Menü in der Zelle Editor-Fenster. </li><li> Tabellieren Zelle Lebensdauer von Daten nach dem Sammeln von &quot;Cell Daten&quot; in der Zelle Editor-Fenster. </li></ol> 7. Statistische Analysen <ol><li> Verwenden Sie entweder Student-t-Test (falls Vergleich zweier Genotypen) oder ANOVA (beim Vergleich&gt; beiden Genotypen), um festzustellen, ob Unterschiede in der parametrischen Daten wie Anzahl der ersten Zellkolonien, Zell-Lebensdauer oder Stunden bis zum Erscheinen des EMT zwischen verschiedenen Genotypen sind statistisch signifikant. Apoptotische Frequenz kann als die Anzahl / Gesamtzahl plattierten Zellen unter Verwendung des Student-t-Test oder ANOVA oder mit Mann-Whitney oder Kruskal-Wallis als Prozentsatz von adhärenten Zellen abgeleiteten verglichen werden. </li><li> Leistungsmessung Tests unter Verwendung von Daten aus Analysen der anfänglichen Experimenten zu bestimmen, wie viele experimentelle repliziert müssen durchgeführt und das Schicksal der Zelle Karten aus jeder Wiederholung generiert für eine angemessene sTATISTISCHE Leistung anhand der verfügbaren Freeware (zB <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). In den Experimenten hier vorgestellten wurden Zellkulturen von drei Mäusen pro Genotyp abgeleitet ausreichend, um festzustellen, ob es statistisch signifikanten Unterschiede in der Zelle und Zelle Koloniebildung Lebensdauern wenn spezifische genetische Modifikationen vorgenommen wurden. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Kritische Schritte Es ist wichtig sicherzustellen, dass Brustdrüsen von Mäusen des gleichen Alters für altersbedingte Variabilität Brustepithelzellen Zellverhalten steuern geerntet. Wenn Ausplattieren der Zellen, sollte die gleiche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung zu jedem Experiment plattiert werden. Zellen sollten relativ spärlichen beim Plattieren, so dass Kulturen nicht zu schnell konfluieren die es ermöglichen, mehrere einzelne Zellen durch serielle Bilder folgen. Es ist wichtig,...

Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind Werkzeuge, um zu studieren und zu verstehen, wie verschiedene genetische Läsionen das Risiko an Brustkrebs zu erkranken beitragen. Beispielsweise wurden gentechnisch Mäusen gezeigt, dass die Kombination von drei Faktoren ab: Verlust des Volllängen-Brustkrebs 1, früher Ausbruch (BRCA1) Gens in Brustepithelzellen, Tumor Protein p53 (TP53) Keimbahn Haploinsuffizienz und Brustepithelzellen Zelle gezielt hochreguliert Östrogenrezeptor alpha (ERa) Expression zur Entwicklung von Brustkrebs in 100% der BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( Tet-op) -ER/MMTV-reverse Tetracyclin-Transaktivator (rtTA Mäusen durch Alter von 12 Monaten im Vergleich zu den niedrigeren Prozentsätzen in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 berichteten + / - Mäuse ohne ERa Überexpression (~ 50 - 60%) und BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre Mäuse ohne TP53 haploinsufenz (&lt;5%). 1 Dynamische Zeitraffer-Bildgebung des Verhaltens von präneoplastischen primäre Brustepithelzellen zeigt Unterschiede in Zellverhalten, die weniger leicht in statischen Gewebeschnitte sind erwünscht. Änderungen in der Proliferation und Differenzierung in der primären Mamma-Zellen aus menschlichen BRCA1-Mutation Träger beobachtet. 2 Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen von primären Brustepithelzellen von normalen und gentechnisch veränderten Mäusen durch enzymatische Dissoziation von resezierten Brustdrüsengewebe generiert werden. 3 Zeitraffer Bilder betrachtet werden, um den Mechanismus und den Zeitpunkt der Zellkolonie Aussehen und Auftreten von morphologischen Veränderungen in Zellen, einschließlich epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und Apoptose zu beurteilen. Erzeugung Zellschicksals Karten werden Quantifizierung der Länge der Zeit zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), und Bestimmung von Mustern der Zellteilung durch Verwendung von Single-Cell-Tracking erleichtert. Timm&#39;S Tracking Tool (TTT) ist öffentlich verfügbaren Software verwendet, um einzelne Zellen Schicksal Karten zu erzeugen. Ihre Nutzbarkeit in der Aufklärung der Mechanismen Zellschicksals wurde festgestellt 4,5 Prüfung normalen hämatopoetischen Stammzelle Entwicklung 6-9 und die Erzeugung von Neuronen. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> EpiCult-B Basal Medium Maus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B Proliferation Supplements Maus </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> rekombinanten humanen Epidermal Growth Factor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Disposable Scapels </td><td> Feder </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks &#39;Balanced Salt Solution </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um Zellsieb </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Zeitraffer-Aufnahmen verwendet werden, um das Verhalten von kultivierten primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus verschiedenen gentechnisch veränderten Mausmodellen von Brustkrebs ableiten zu vergleichen. Zum Beispiel kann zwischen Zellteilungen (Zelle Lebensdauern), apoptotischen Zellzahlen, Evolution von morphologischen Veränderungen, und der Mechanismus der Koloniebildung quantifiziert und verglichen werden Zellen, die spezifische genetische Läsionen. Primäre Brustepithelzellen Zellkulturen aus Milchdrüsen ohne tastbaren Tumor erzeugt. Drüsen sorgfältig mit klare Trennung von angrenzenden Muskels reseziert werden Lymphknoten entfernt, und Einzelzellsuspensionen von angereichertem Brustepithelzellen werden durch Zerkleinern Brustgewebe durch enzymatische Dissoziation und anschließender Filtration erzeugt. Single-Zellsuspensionen ausplattiert und direkt unter dem Mikroskop platziert innerhalb einer Inkubatorkammer für Live-Cell-Imaging. Sixteen 650 um x 700 um Felder in einer 4x4-Konfiguration von jedem well einer 6-Well-Platte werden alle 15 min 5 Tage lang abgebildet. Zeitraffer-Bilder untersucht direkt an zellulären Mechanismus Verhaltensweisen, und die Häufigkeit der Zellkolonie Bildung innerhalb der ersten 24 Stunden der Ausplattieren der Zellen (Aggregation gegenüber Zellproliferation), Auftreten von Apoptose und Auslaufen von morphologischen Veränderungen gehören zu messen. Single-cell-Tracking wird verwendet, um das Schicksal der Zelle Karten für die Messung der einzelnen Zelle Lebensdauer und Untersuchung der Zellteilung Muster zu erzeugen. Quantitative Daten werden statistisch ausgewertet, um auf signifikante Unterschiede im Verhalten mit spezifischen genetischen Läsionen korreliert beurteilen.

Epitheliale und Fibroblasten-Zellen können durch Zellmorphologie unterscheiden. Epithelialen Zellen eine Quaderform (1A-B) und Form Zellkolonien (1A). Fibroblasten, eine Art von Stromazellen, eine längliche Morphologie (Abbildung 1C). Zellen wurden gerundet und schweben zu Beginn der Bildgebung (2A-D). Nach der Befestigung an der Platte wurden sie flach und zeigte eine quaderförmige-Typ Aussehen (2E, H). ...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Aufrufe.  Georgetown University. Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Serie: Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Forschung

Medizin

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

Tracking der Brust architektonische Details und Erkennen von Brustkrebs mit Magnet-Resonanz-Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.