Wir sind dankbar, unterstützt vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) und Gesundheit und das Wohlergehen Zuschlag von Tabakwaren - MOHW106-TDU-B-212-144001 bis S-Y C.

Hinweis: Alle Protokolle und Methoden der tierische Themen wurden von institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) von Taipei Medical University genehmigt (Protokoll Zahlen: LAC-2014-0387)
1. Vorbereitung des Micro-osmotischen Pumpe Infusionssysteme
Hinweis: Bereiten Sie die Pumpe, künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Puffer und Medikament (Met-CCL5/RANTES Proteinlösung (10 ng/mL im ACFS)) unter sterilen Bedingungen mit Puffer mit 0,2 µm-Filter filtriert und führen Sie die Verfahren unter der Haube Kultur mit Handschuhen. Die Eingriffe werden wie folgt durchgeführt:
<ol>
	<li>Bereiten Sie die Mikro-osmotische Pumpen einen Tag vor der Operation: füllen Sie die Gehirn Mikro-osmotischen Pumpe mit künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) mit einer 1 mL Spritze und Nadel stumpf-Leiter zusammen mit dem Kit. Tauchen Sie die Mikro-osmotischen Pumpe in ACFS und legen Sie es auf einen Shaker und schütteln Sie es über Nacht. Achtung: Die Pumpe sollte voller ACFS und Luftblasen im Inneren der Pumpe (Abbildung 1A) vermieden werden.</li>
	<li>Bereiten Sie vor Beginn der Operation die rekombinante Met-CCL5/RANTES Proteinlösung (10 ng/mL, verdünnt in ACFS) in das Experiment verwendet werden. Entfernen Sie ACFS aus der Pumpe und füllen Sie die Pumpe mit der Wirkstofflösung langsam bis Übermaß austritt. Hinweis: 15 mL ACFS oder Met-CCL5/RANTES Lösung ist ausreichend für 5-8 Pumpen. Achtung: Wiederholen Sie den Vorgang, um sicherzustellen, dass die Pumpe mit dem Medikament ohne Luftblasen im Inneren vollständig gefüllt ist.</li>
	<li>Die Katheter-Rohre in die gewünschte Länge geschnitten und mit der stumpfen Ende Gehirn Infusion Nadel im Gehirn Infusion Kit beifügen. Füllen Sie die Infusion Kit und Rohre mit dem Medikament.</li>
	<li>Zu guter Letzt montieren Sie und befestigen Sie das Gehirn Infusion Kit zur Mikro-osmotischen Pumpe. Achtung: Keine Bläschen sollte in den Schlauch oder die Pumpe (Abbildung 1A) gebildet werden.</li>
	<li>Tauchen Sie die gesamte osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion inmitten ACFS in eine sterilisierte 50 mL-Tube, die Pumpe vor dem Austrocknen zu verhindern. Das osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion-Set ist nun bereit für Chirurgie verwendet werden. Hinweis: Die Mikro-osmotischen Pumpensysteme für langfristige Infusion der Droge einsetzbar. Dies sorgt für eine sichere und bequeme Art der Drug-Delivery in das Gehirn der Maus.</li>
</ol>
2. Intrazerebrale ventrikuläre Chirurgie-Implantation des osmotischen Mikropumpe
Achtung: Sterilisieren Sie der chirurgische Umgebung mit 75 % Ethanol zu und sicherzustellen Sie, dass die Menschen, die an der Studie beteiligten sterile Handschuhe und einen sauberen Kittel tragen. Chirurgische Instrumente / Instrumente autoklaviert und vor Gebrauch getrocknet und anschließend sterilisiert mit 75 % igem Ethanol dazwischen Mäuse Operationen sein müssen.
<ol>
	<li>Wiegen die Maus und betäuben sie mit Intra peritoneale Injektion (IP) mit Ketamin/Xylazin (Ketamin 50 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg). Achtung: Mäuse Körpergewicht niedriger als 24 g sind nicht für die osmotischen Pumpe Implantation Operation empfohlen.</li>
	<li>Montieren Sie und befestigen Sie den Maus-Kopf auf die stereotaktische Apparatur (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Verwenden Sie ein paar Chirurgische Scheren und Zangen die Außenhaut über den Schädel aufzuschneiden. Verwenden Sie Jod um zu den peripheren Schädel zu reinigen.</li>
	<li>Trennen Sie die äußerste Schicht der Haut von der subkutanen Haut mit Hilfe eines Paares von stumpfen Kopf Scheren in der Nähe von der Hals-Bereich für die osmotischen Pumpe-Gehirn Fusion Set Implantation (Abbildung 1).</li>
	<li>Markieren Sie den Punkt Infusion mit Bezug auf die Gehirn-Karte (Abbildung 1) mit der stereotaktische Apparatur. In diesem Experiment muss die Nadel in der Region 3rd Herzkammer implantiert werden (Bregma: 0.0 mm seitlichen, hinteren 1,3 mm, ventralen 5,7 mm).</li>
	<li>Bohren Sie ein Loch mit einem Nagel-Bohrer in der Umgebung auf den Schädel (Abbildung 1E) markiert. Achtung: Achten Sie darauf, die Maus Hirnhäute und Blutgefäße, wodurch die Störung von Mikro-Blutgefäßen im Gehirn zu brechen.</li>
	<li>Legen Sie die Mikro-osmotischen Pumpe-Gehirn-Fusion-Set mit ACFS (als Kontrolle) oder Medikamenten (Met-CCL5/RANTES Proteinlösung) unter die Haut hinter den Halsbereich und einfügen die Gehirn-Infusion Nadel in das Bohrloch, das Medikament in das Gehirn der Maus ( einfließen Abbildung 1E). Die Nadel wird der Hirnhäute eindringen und bekommen in den Ventrikel. Fixieren Sie die Nadel auf den Schädel mit Oberfläche desensibilisierende Gel (Abb. 1F) und warten Sie 1 – 2 min., bis der Leim trocknet. Als Nächstes schneiden Sie den überstehenden Teil auf die Nadel (Abbildung 1- H).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Gewebe Klebstoff Leim, um den Betrieb, die Wunde am Kopf zu heilen. Gelten 50 µL des Klebers auf die Wunde, ziehen Sie beide Seiten der Haut zusammen und halten Sie für 30 s auf der Haut (Abb. 1I) versiegeln lassen. Achtung: Verwenden Sie 100 % Alkoholtupfer reinigen die Wunde nach der Operation und 100 Ul Penicillin mit Streptomycin, Infektion zu verhindern. Hinweis: Maus Haut wird Narbengewebe zu bilden und heilen in wenigen Tagen nach der Verabreichung des chirurgischen Klebers. Der Hauptvorteil des Klebers ist die Vermeidung von chirurgische Nähte die Reizung der Haut oder Entzündungen hervorrufen können.</li>
	<li>Statt die Maus in einem sauberen Käfig auf einem warmen Teller gehalten (bis zu 37 ° C erhitzt) und warten Sie, bis die Maus erholt sich von dem betäubenden Effekt. Achtung: Es ist entscheidend für die Maus Körpertemperatur um die Chance des Überlebens nach der Operation zu erhöhen.</li>
	<li>Nach einer einwöchigen Erholungsphase werden die Mäuse bereit für weitere Experimente, wie der orale Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) sein.</li>
</ol>
(3) oralen Glukosetoleranztest (OGTT)
Hinweis: Führen Sie den oralen Glukosetoleranztest 7 Tage nach der Infusion der ACFS und MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Pflegen Sie einen 6 h schnell für die Mäuse vor OGTT mit ausreichender Wasserversorgung. Halten Sie die Tiere auf der gleichen Werkbank, wo die Experimente durchgeführt werden, so dass sie für die Umwelt zur Verringerung der Belastung während des Verfahrens akklimatisieren können.
<ol>
	<li>Vorbereitung der Glukose-Lösung: vor der Durchführung des Experiments, bereiten Sie die Glukoselösung durch Auflösen von 3,75 g Glukose in 15 mL destilliertem H2O.</li>
	<li>Richten Sie einen Zeitplan zum Aufzeichnen der Messwerte während der Versuchsdurchführung (Tabelle 1). Hinweis: Es ist wichtig, einen Zeitplan mit richtigen Abstände zwischen jeder Blutuntersuchung erlaubt genaue Aufzeichnung während des Experiments einzurichten.</li>
	<li>Wiegen Sie jede Maus nach dem Fasten und berechnen Sie die entsprechende Menge an Glukose injiziert werden.</li></ol>Wenn die Maus 30 g wiegt, sollte die Menge der Glukoselösung verabreicht werden beispielsweise 300 µL.
	<li>Die folgenden Instrumente an der Werkbank vorbereiten:<ol>
		<li>Blutzuckermessgerät (drücken Sie die Schaltfläche "Start" um den Akkuladestand, stellen Sie sicher, dass es funktioniert, bevor der Test.)</li>
		<li>Glukose-chip</li>
		<li>Insulin Spritze (0,3 mL Insulin Spritze)</li>
		<li>Rasierklingen</li>
		<li>Timer</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sobald die Bank eingerichtet, Messung und Aufzeichnung den Blutzuckerspiegel wie folgt: eine saubere und neue Glukose chip in das Blutzuckermessgerät und drücken Sie die Schaltfläche "Start" zu Null.</li>
	<li>Heben Sie die Maus von der Rückseite des Halses und streichle die Rute ein paar Mal um ausreichenden Blutfluss in die Heck-Region zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit einer neuen Rasierklinge, ein kleines Stück der Schwanz abgeschnitten und einen kleinen Tropfen Blut auspressen (ca. 10-20 µL) in den Glukose-Chip. Das Blut sollte den Chip um genaue Messungen zu ermöglichen füllen. Das Blutzuckermessgerät wird die Glukose sofort angezeigt. Wenn die Maschine "Error" angezeigt wird, wiederholen Sie den Vorgang mit einem neuen Glukose-Chip. Hinweis: Der Glukose-Chip erfordert nur einen Tropfen Blut. Wenn die Blutprobe mehr als einmal gesammelt werden muss, Druck einfach durch Ausführen Ihre Finger entlang der Maus Rute mehrmals halten Sie das Ende der Rute direkt auf den Chip, um Blut zu sammeln. Es ist nicht notwendig, am Ende jedes Mal beim Sammeln von Blutproben schneiden.</li>
	<li>Als nächstes füttern Sie die Mäuse Glukose (0,25 g/mL) oral mit eines-Magensonde Technik. Die Menge an Glukose verabreicht werden sollte mithilfe der Formel berechnet werden: 10 X Körper Gewicht (BW) µL Glukoselösung (z. B., wenn die Maus wiegt 30 g, die Menge der Glukoselösung verabreicht werden 300 µL werden). Der Timer gestartet wird sofort nach der Verabreichung oraler Glukose.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Glukose-Messverfahren auf 15, 30, 60, 90 und 120 min.</li>
	<li>Nachdem alle Lesungen auf Glukose aufgenommen haben, verwerfen die Rasierklingen und Glukose-chips in einem Risikostoffe. Legen Sie die Lebensmittel wieder in die Mäuse Käfige und wieder in den Tierraum.</li>

4. Insulin-Toleranz-Test (ITT)
Hinweis: Toleranztest Insulin und oralen Glukosetoleranztest sollte mindestens 7 Tage auseinander geplant werden, um das Fasten Wirkung auf Tiere zu reduzieren. Für die Insulin-Toleranz-Test (ITT) wird Humaninsulin (0,75 U/Kg) durch IP-Injektion verabreicht werden.
<ol>
	<li>Vorbereitung von 0,25 U Insulinlösung: 100U Humaninsulin, das Verhältnis von 1: 400 in Kochsalzlösung zu verdünnen.</li>
	<li>Wiegen jeder Maus nach dem Fasten, und entsprechend die eingespritzte Menge an Insulin berechnen: Volumen (µL) von 0,25 U Insulin sein injiziert IP = 3 X BW (0,75 U Insulin/Kg Körpergewicht). Zum Beispiel: für eine Maus mit einem Gewicht von 28,8 g, injizieren: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 U verdünnt Insulin) (Tabelle 2). Achtung: Die gleichen Tiere möglicherweise unterschiedliche Körpergewichte nach 6 Stunden an verschiedenen Tagen Fasten. Daher ist es notwendig, das Körpergewicht zu messen, vor und nach dem Fasten und Verhalten, die die OGTT und ITT zu testen. Maus des Körpergewichts konnte je nach Spezies, Geschlecht und Fasten Dauer gelöscht werden. Höhere Dosen von Insulin Insulin Schock verursachen könnte und würde bis zum Tod des Tieres führen.</li>
	<li>Einrichten einer Tabelle (Tabelle 2) zum Aufzeichnen der Messwerte während der Versuchsdurchführung. Wiederholen Sie die Schritte 3.4. auf 3.8. für die Messung des Blutzuckerspiegels.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Mechanismus der chronischen Entzündung und damit verbundenen Chemokine wie CCL5 und seinen Rezeptor – unklar CCR5 bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes. Chronischer Entzündung verursacht Makrophagen Eindringen in Fettgewebe und wirkt sich auf die Regulierung der Adipokine; in der Zwischenzeit außerdem zieht β-Zellen und beeinträchtigt die Insulin-Sekretion von Langerhans-Inseln in Reaktion auf den Blutzucker. Hypothalamus im Gehirn spielt eine wichtige Rolle als ein Control-Center bei der Koordinierung von Insulin und Adipokine Signale aus dem systemischen peripheren Gewebe bei der Regulierung der Appetit, periphere Blut-Glukose-Stoffwechsel und Insulin-Reaktion. Viele Studien zeigen auch, dass Hypothalamus Entzündung zu mangelhaften Regulierung der Energiehomöostase sowie defekte Pankreas Inselchen und Leberfunktion2,3,9,10 führt. CCL5 im Gehirn trägt zur Aufnahme und Körper Temperatur Lebensmittelverordnung in den Hypothalamus11,12; die Korrelation von CCL5, Hypothalamus und systemische Insulin-Signal ist jedoch unklar. CCL5 Ganzkörper Knockout Maus (CCL5- / -) wurde erstellt, um die ein Insulin Widerstand Phänotyp mit höheren Insulinspiegel und hohe Blutzuckerwerte im Blut8zeigt mit dieser Frage beschäftigen. Allerdings erfordert es eine lange Zeit den T2DM-Phänotyp zu entwickeln und es ist schwierig, die Rolle und CCL5 im Hypothalamus Insulin-Signal durch mögliche Langzeitwirkungen kompensatorische Mechanismus zu untersuchen. Daher ist eine direkte Manipulation der CCL5 signalisieren in den Hypothalamus Neuronen der beste Ansatz. Allerdings gibt es mehrere Arten von Neuronen im Hypothalamus Region und es ist ziemlich teuer und zeitaufwendig, Zelle spezifische Knockout-Mäusen zu generieren. Unter Verwendung einer ICV kann Infusion System so sparen Sie Zeit und einen konkreteren Ansatz um CCL5 Funktion direkt in das Gehirn unter Umgehung mögliche peripheren Entzündungsreaktionen zu manipulieren.
Studien unter Verwendung osmotische Pumpen wurden bereits zuvor veröffentlicht bietet großartige Beispiele und Demonstrationen von Techniken die Implantation der osmotische Pumpen in Nagetieren13beteiligt. Allerdings standen wir ein paar Herausforderungen während im Anschluss an diese Protokolle in unserer Studie. Erstens ist ein Teil der Ausrüstung benutzt im Protokoll recht teuer, einschließlich (1) die elektrische Anlage zu erreichen, zeichnen und einsetzen der Nadel ins Gehirn der Maus, (2) das Thermo-System für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur Maus und (3) die Sauerstoff-Isofluran System für die Verwaltung der Anästhesie zu Mäusen zu liefern. Zweitens waren die Techniken, die in anderen Artikeln beschrieben schwer nachzuahmen, da wir nur Tiere innerhalb eines kleinen Bereichs von Körpergewicht und in bestimmten Altersstufen für unsere Studie nutzen konnten. Wir sind uns bewusst, dass größere Mäuse für Chirurgie und Implantation besser geeignet sind. Allerdings mussten wir in unserer Studie, kleinere und jüngere Mäuse verwenden Sie zur Vermeidung von Übergewicht und Alterungseffekte auf Insulin und Blut-Glukose-Verordnung: nur männliche Mäuse mit Körper 25 ± 2 g und Alter Gewicht ca. 2 Monate alt wurden in der Studie ausgewählt. Daher ist es schwierig zu operieren und Naht die Wunde auf den Maus-Kopf. Drittens muss die entzündliche Reaktion nach der Operation minimiert werden, da eine entzündliche Cytokine das Ziel dieser Studie ist. Mäuse und Ratten können Naht zu entfernen und offenen Wunden leicht nach der Operation, die führt zu Entzündungen und Chemokin Reaktionen zu erhöhen. Daher ist eine Strategie, die Position erreichen und ziehen und stechen die Nadel ins Gehirn der Maus, der Sekundärinfektion vermeidet notwendig. Daher haben wir die zuvor beschriebenen Protokolle, um diese Technik kostengünstiger, einfacher und weniger schädlich für die Tiere machen, wie im folgenden Absatz beschrieben geändert.
Erstens haben wir einen Nagel bohren um manuell ein Loch um den Zielbereich markiert auf dem Schädel zu bohren, wie unter Punkt 2.6 beschrieben. Diese Methode ist kostengünstig und ermöglicht es uns, das gesamte Verfahren um nicht zu beschädigen die Maus Hirnhäute und Blutgefäße zu überwachen. Blut-Glukose-Verordnung wird nach akutem Schlaganfall, wie z. B. eine Blutung im Gehirn beeinträchtigt. Akuten Hyperglykämie und Diabetes-ähnliche Syndrome wurden auch nach einem Schlaganfall im klinischen Umfeld14,15beobachtet. Ebenso fanden wir auch wertgemindert Glukose-Ebene und Insulin-Reaktion bei Mäusen mit Blutungen und Eiter im Gehirn. Wir sind uns bewusst, dass bessere Kontrolle der Handbuch-basierte Chirurgie zur Sicherstellung der Konsistenz der Ergebnisse notwendig ist. Zweitens, nutzten wir eine neu entwickelte medizinische Biomaterial allgemein verwendet in Kliniken, Gewebe Klebstoff Leim (Schritt 2,8), um die Haut zu versiegeln auf den Maus-Kopf nach der Operation, daher Stiche zu vermeiden und die Rate der Heilung zu beschleunigen. Dies erleichtert chirurgische Eingriffe durchführen und verringert die Gefahr von sekundären Entzündung. Drittens ist der Zeitaufwand für das gesamte chirurgische Verfahren durchzuführen vergleichsweise kürzer, das erhöht die Chance des Überlebens für die Mäuse und senkt die Dosierung der betäubende Droge injiziert intraperitoneal. Wir beobachteten eine hohe Überlebensrate (95 %) und relativ genaue Ergebnisse durch Anschluss an diese geänderte Protokoll erhalten.
Die Einschränkung dieser Technik ist die relativ kurzen Zeitrahmen der Drug-Delivery. Obwohl eine osmotische Pumpe in den Körper der Maus Alternativ platziert werden kann ohne erneute Öffnung des Gehirns, unsere Studie nur konzentriert sich auf die entzündlichen Chemokin-Wirkung auf das Gehirn, die peripheren systemischen Insulin Signalisierung zu regulieren. Zusätzliche Operation in peripheren Geweben könnte möglicherweise eine Entzündungsreaktion in peripheren Geweben, induzieren, die dann entzündliche Chemokin Ausdruck zu erhöhen und die Ergebnisse beeinflussen. Zweitens, die Halbwertszeit des Medikaments schränkt auch die Dauer der Studie. Rekombinante Proteine wie Chemokin haben in der Regel eine kürzere Halbwertszeit, die ihre Tätigkeit im Laufe der Zeit verliert, obwohl es auch erlaubt, die Wirkung von blockierenden CCL5 Signalisierung im Gehirn kurzfristig zu untersuchen. Unsere früheren Studien haben auch einen genetische Veränderung Ansatz zur Generierung von CCL5 Knockout Maus, bietet ein Modell mit langfristigen Auswirkungen8beschrieben.
Es gibt einige neue Techniken und alternative Methoden, Drogen ins Gehirn zu liefern. Nanotechnologie ist eine leistungsstarke Technik, die verwendet werden können, um Drogen in das zentrale Nervensystem zu liefern. Viele Medikamente sind wärmeempfindlichen jedoch und können zerstört werden, wenn Sie versuchen, sie in Nanopartikel16zu verpacken. Darüber hinaus Nanopartikel können BBB durchlaufen und werden Uptaken von Zellen, die für SiRNA oder am häufigsten verwendeten Medikamente geeignet sind, aber es ist keine ideale Methode für Ligand-Rezeptor-Bindung.CCL5 erfordert Bindung an seinen Rezeptor CCR5, in den Hypothalamus ARC Neuronen zu Effekt8, und die Lieferung von CCL5 Antagonist MetCCL5 in Neuronen durch Nanopartikel könnten dazu führen, dass einen Verlust der Fähigkeit zu binden und CCR5 auf der Zelle blockieren Oberfläche.
Der Blutzuckerspiegel war signifikant höher bei Mäusen in der oralen Glukosetoleranztest mit CCL5-Antagonist MetCCL5 im Vergleich zu den Steuerelementen (Mäuse mit ACFS verabreicht) verabreicht. Zusätzliche Insulingaben (Insulin-Toleranz-Test) war auch nicht in der Lage, den Blutzuckerspiegel in MetCCL5 erhalten Mäuse (Abbildung 4 b), zu senken, was darauf hindeutet, dass endogene und externe Insulin den Blutzuckerspiegel senken können beim Hypothalamus CCL5 Signalisierung blockieren. Mäuse wurden Insulin resistent ohne CCL5 Aktivität im Hypothalamus. Erhöhte serine302 Phosphorylierung des IRS-1 wurde bei den Mäusen, die Met-CCL5 im Vergleich zu Kontroll-Mäusen erhalten ACFS (Abbildung 5A-B) Eingang gefunden. Serin 302 Phosphorylierung des IRS-1 hat gezeigt, dass eine physikalische Dissoziation des IRS-1 aus der Insulinrezeptor, induzieren, die eine der Hauptursachen der Insulin-Resistenz-6; Insulin ist nicht nachgelagerten Signale wie der PI3K-Akt-Signalweg aktivieren. Eine ex-Vivo -Insulin-Stimulation-Studie bestätigt das Insulin, die nachgeschalteten Signalmolekül Akt (p-AktS473) nicht durch Insulin im Hypothalamus Gewebe Maus aktiviert wurde angereichert mit Met-CCL5 und stattdessen die Serin 302 Phosphorylierung erhöht. Insgesamt zeigen physiologische Daten (OGTT und ITT) und molekulare Studie, dass Hypothalamus CCL5 Signalisierung die Hypothalamus Insulin-Signal-Verordnung, vermittelt die systematische Insulin-Resistenz und Glukose-Stoffwechsel beiträgt.
Die Rolle und die Mechanismen der CCL5 und CCR5 bei Adipositas-assoziierten Diabetes bleibt unklar. Kitade Et Al. berichteten, dass CCR5-Mangel von Fettleibigkeit bedingte Entzündung, Makrophagen Rekrutierung und Insulin-Resistenz-17Mäusen geschützt. Jedoch haben andere Studien von Kennedy Et Al. entgegengesetzte Ergebnisse darauf hinweist, dass CCR5-Mangel beeinträchtigt systemische Glukosetoleranz sowie Adipocyte und Muskel Insulin Signalisierung18gefunden. Beide Studien angewendet eine fettreiche Ernährung, Übergewicht, induzieren die Ganzkörper chronische Entzündung und kompensatorische Reaktion führt. Diese Studien haben keine saubere und klare Mechanismen von CCL5 und CCR5 in Insulin Signalisierung Verordnung vorgelegt. Auf der anderen Seite die osmotischen Pumpe-Technik ermöglicht eine Gehirn-spezifische-Infusion und vermeidet kompensatorische Reaktion mit der zeitlich befristeten Lieferung.
Zusammenfassend, obwohl die osmotische Pumpe mit dem Gehirn Infusion System eine "altmodische" Technik zu sein scheint, bietet es eine billigere, einfachere und weniger schädliche Methode der Drug-Delivery und hilft untersuchen die Funktion des Ligand-Rezeptor Signalgebung der Gehirn.

Insulin wirkt sich eine Vielzahl von Geweben, einschließlich des Gehirns. Insulin führt durch die Blut - Hirn-Schranke, tritt in das zentrale Nervensystem (ZNS) und bindet mit Insulin-Rezeptor (IR) im Hypothalamus, Nahrungsaufnahme, Aktivität des sympathischen Nervensystems und periphere Insulin-Reaktion zu regulieren. Chronische Entzündungen im peripheren Fettgewebe soll dazu beitragen, Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM), aber wie diese Entzündungsreaktionen Insulin beeinflussen, systemische Insulin-Reaktion und Glukose-Intoleranz vermitteln im Hypothalamus Signale bleibt unklar. Einige Chemokine Teilnahme an Appetit Verordnung und Regulierung der Körpertemperatur im Hypothalamus1 wie Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF), Interleukin (IL) -6, IL-1β, Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und CCL5 (C-C Motif Ligand 5 ). Darüber hinaus führt die Entzündung im Hypothalamus zu einer Insulinresistenz bei T2DM2,3.
Unter diese Chemokine, die Änderung der Ausdruck Niveaus der Chemokin CCL5 und seinen Rezeptor wurde CCR5, in Fettgewebe mit Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz in T2DM im Menschen als auch Tiere in Verbindung gebracht. CCL5 hat auch neuroendokrine Funktionen, einschließlich der Regulierung von Essen-Aufnahme und die Körpertemperatur, im Hypothalamus. Es ist daher wichtig zu untersuchen, ob CCL5 an Insulin Signal Aktivierung innerhalb der Hypothalamus oder der peripheren Geweben beteiligt ist.
Insulin-Signal ist streng in den Zellen reguliert. Die Bindung von Insulin, Insulin-Rezeptoren (IR) aktiviert Insulin Rezeptorproteine Substrat (IRS), gefolgt von Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Protein Kinase B (PKB/AKT) Aktivierung und Glukose-Transporter-4 (GLUT4) Membran Translokation4 . IRS-Proteine sind die wichtigsten Regulatoren in dieser Signalweg: sie haben mehrere Tyrosin und Serin Rückstände, die als Reaktion auf Positive phosphoryliert werden können oder negative Insulin signalisiert5. Zum Beispiel kann Serin 302 Phosphorylierung von IRS-1 führen zu die physische Trennung von IRS-1 von IR und Insulin-Signaltransduktion, führt zu Insulin-Resistenz-6zu blockieren. Die Aktivität Beeinträchtigung der IRS Proteine im Hypothalamus hat sich gezeigt, Insulin-Resistenz und Glukoseintoleranz in Mäusen7zu induzieren.
Eine gängige Methode, um die Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen ist die Manipulation des Ausdrucks der Zielgene verteilt über den gesamten Körper des Organismus. Dies kann jedoch einige Nachteile haben: (1) es könnte im Laufe der Zeit verschiedene Rückkopplungseffekte regulatorischen oder kompensatorische erzeugen und (2) diese Methode nicht hilft uns die Rolle des Zielproteins in bestimmten Gehirnregionen zu veranschaulichen. Auch Gewebe und zellspezifische gen Knockout Tiere sehr lange dauern, zu züchten und sind teuer. So verwenden wir eine kurzfristige Infusion osmotischen Pumpe Hirnsystem - eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, stören die Signalisierung des Zielproteins in das Gehirn der Antagonist Droge verwenden, um die genannten Probleme zu überwinden. Stereotaktische Injektionen verwendet, um komplizierte chirurgische Kompetenz und umfangreiche Investitionen in Instrumentierung und Zeit erfordern. In diesem Protokoll bieten wir eine einfache und sichere Möglichkeit, stereotaktische Injektion und eine schnell, weniger schädlich und momentane Methode, um die Konzentration von Glukose im Blut zu erkennen und untersuchen die Rolle von CCL5 im Hypothalamus Insulin Signalisierung Verordnung durchführen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>#1049SB</td>
			<td>The glue used to seal the lesion site on the mouse head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LOCTITE 454 instant adhesive</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#8670</td>
			<td>The glue used to fix the needle on the mouse skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet Micro- Osmotic Pump</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#9922</td>
			<td>0.11 &#956;l per hour, 28 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain infusion system</td>
			<td>Durect Corporation</td>
			<td>#8851</td>
			<td>1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucometer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#06870244001</td>
			<td>Used to measure the blood glucose level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose chip</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#06454011020</td>
			<td>Used to load the blood sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#MKBK0523V</td>
			<td>To demonstrate the drug infusion area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>#3232145 C</td>
			<td>Used to administer insulin intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIO NE116 CONTROL UNIT 
			(nail drill)</td>
			<td>Mio System</td>
			<td>#E235-015</td>
			<td>To drill a hole in the skull of the mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL5/Met-RANTES Protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>#ADB0111081</td>
			<td>Recombinant Human CCL5, E-coli derived</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF formula</td>
			<td>119 mM NaCl 
			26.2 mM NaHCO3 
			2.5 mM KCl 
			1 mM NaH2PO4 
			1.3 mM MgCl2 
			10 mM glucose</td>
			<td></td>
			<td>Filter sterilize with a 0.22 &#956;m filter apparatus, and store at 4&#176;C. 
			aCSF is stable for 3-4 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS-1 Serine302 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12879</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRS-1 (D23G12) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12879</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt Serine 473 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9916</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt (pan) (C67E7) antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#9916</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals: C57BL/6</td>
			<td>NAR Labs</td>
			<td></td>
			<td>Wild type mice strain used in the study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain

Insulin reguliert den Stoffwechsel systematisch in den Hypothalamus und die peripheren Insulinreaktion. Eine Entzündungsreaktion im peripheren Fettgewebe trägt zu Typ-2 Diabetes Mellitus (T2DM) Entwicklung und Appetit Verordnung im Hypothalamus. Chemokine CCL5 und C-C-Chemokin-Rezeptor Typ 5 (CCR5) Stufen vorgeschlagen worden, um Arteriosklerose und Glukose-Intoleranz bei Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) zu vermitteln. Darüber hinaus Rolle CCL5 eine neuroendokrine im Hypothalamus geregelt Essen Einnahme und die Körpertemperatur, so fordert uns, seine Funktion im Hypothalamus Insulin-Signal und die Regulierung der peripheren Glukose-Stoffwechsel zu untersuchen.
Das Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System ist eine schnelle und präzise Weise zu manipulieren CCL5 Funktion und seine Wirkung im Gehirn zu studieren. Es bietet auch eine bequeme alternative Herangehensweise zur Erzeugung einer transgenen Ko-Tieres. In diesem System wurde CCL5 Signalisierung von Intracerebroventricular (ICV) Infusion von seinen Gegenspieler, MetCCL5, mit einem Mikro-osmotischen Pumpe blockiert. Die peripheren Glukose-Stoffwechsel und Insulin Reaktionsfähigkeit wurde durch den oralen Glukose-Toleranz-Test (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) festgestellt. Insulin Signalisierung Aktivität wurde dann durch Protein-Blot aus Gewebeproben, die von den Tieren abgeleitet analysiert.
Nach 7-14 Tagen von MetCCL5 Aufguss, den Metabolismus von Glukose und Insulin wurde bei Mäusen, Reaktionsfähigkeit beeinträchtigt, wie in den Ergebnissen der OGTT und ITT gesehen. Die IRS-1 serine302 Phosphorylierung wurde erhöht und die Akt-Aktivität wurde in Mäusen Hypothalamus Neuronen nach CCL5 Hemmung reduziert. Insgesamt zufolge unsere Daten blockieren CCL5 in das Gehirn der Maus erhöht die Phosphorylierung des IRS-1 S302 und unterbricht Hypothalamus Insulin-Signal, führt zu einem Rückgang der Insulinfunktion in peripheren Geweben sowie die Beeinträchtigung der Glukose Stoffwechsel.

Chirurgische Implantationen von osmotischen Infusionspumpen, enthalten entweder ACFS als Kontrolle oder CCL5 Antagonist MetCCL5 (zu CCL5 Wirkungen im Gehirn blockieren) wurden an den Mäusen durchgeführt. Bei 7 bis 14 Tage nach der Operation wurden die peripheren Glukosetoleranz und Insulin Reaktionsfähigkeit von Mäusen mit OGTT (nach 7 Tagen) und ITT (nach 14 Tagen), wie im Protokoll erwähnt analysiert. Die oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT) von Mäusen waren nach 6 Stunden Fasten durchgeführt. Mäuse wurden mit Glukose oral, mit dem Betrag anhand ihrer jeweiligen Körpergewicht verabreicht. Die Änderungen in den Blutzuckerspiegel wurden aufgezeichnet, wie in Abbildung 3dargestellt. Die Insulin-Empfindlichkeit-Test wurde von intraperitoneal (IP)-Insulin-Injektion in Mäusen durchgeführt und die Änderung des Blutzuckerspiegels wurde sofort gemessen. Die Veränderungen der Blutzuckerwerte nach Insulin-Stimulation bei Mäusen mit verschiedenen Infusion Medikamente wurden aufgezeichnet, wie in Abbildung 4dargestellt. Der Blutzuckerspiegel wurde nach Glukose-Verwaltung (Abb. 3 b) und Insulininjektion (Abbildung 4 b) bei Mäusen mit CCL5 Antagonist (MetCCL5) Infusion im Vergleich zu Mäusen mit ACFS Infusion nur geringfügig reduziert. Diese Ergebnisse zeigen Beeinträchtigungen der Insulinfunktion auf periphere Glukosestoffwechsel bei Mäusen mit MetCCL5 in das Gehirn verabreicht.
Als nächstes haben wir die Aktivierung der Insulin-Signal durch die Auswertung der IRS-1 Phosphorylierung und Akt Aktivierungsniveaus im Hypothalamus Gewebe analysiert. Die Serin-Phosphorylierung auf 302 des IRS-1 wurde hochreguliert bei Mäusen mit Antagonisten (MetCCL5) behandelt (Abbildung 5 b-C) als Mäuse normal gefüttert wurden. In der Kontrollgruppe wurde an Mäusen Hypothalamus ACFS verwaltet und die Insulin-Herausforderung aktiviert das nachgeschaltete Signalmolekül Akt (phosphorylierten Akt Serin 473) (Abbildung 5, F) ohne Erhöhung der IRS-1 (serine302) Aktivierung Abbildung 5 -E) und Akt serine473 Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu das Akt-Signal wurde nicht erhöht, bei Mäusen mit MetCCL5 infundiert, aber stattdessen gab es eine Zunahme der Phosphorylierung des IRS-1 Serin 302. Unterdessen unterbrochen, blockiert das CCL5 Signal im Gehirn Maus Insulin Aktivität im Hypothalamus und beeinträchtigt peripheren Insulinfunktion. Von unserer generellen Feststellungen, z. B. die Ergebnisse von ITT, OGTT und ex Vivo Insulin Herausforderung schlossen wir, dass CCL5 im Hypothalamus zu Insulin Signal Aktivierung und peripheren Glukosestoffwechsel nach Insulin Stimulation beiträgt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Osmotischen Pumpe Vorbereitung und Implantation chirurgischen Eingriff in Maus. (A) die Gehirn-Infusion Kit und Pumpe Vorbereitung mit Wirkstofflösung durchblutet. Rote Pfeile zeigen die Katheter-Röhrchen mit Flüssigkeit gefüllt. (B) Fix und montieren den Maus-Kopf auf die stereotaktische Apparatur. (C) trennen die äußerste Schicht der Haut von der subkutanen Haut für die Implantation von Mikro-osmotischen Pumpe-Gehirn-Infusions-Set; Strich-Linien geben den Standort der osmotischen Pumpe Implantate. (D) den Pfeil zeigt die Aufguss-Seite. (E) Bohrer ein Loch um den markierten Bereich auf dem Schädel. (F) Ort der osmotischen Pumpe-Gehirn-Infusion in der Rückseite der Maus und Nadel Gehirn Infusion in das gebohrte Loch (Strich eingekreist). (G) die Nadel auf den Schädel mit Gewebe-Klebeband Klebstoff befestigen und lösen die Spitze der Nadel (Schere spitz in G), wie in (H) gezeigt. (ich) die Wunde mit Klebstoff Gewebekleber. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig2.jpg"> 
Abbildung 2. Repräsentative Bilder des Bereichs Verbreitung Droge, wenn das Medikament in der ventrikulären Region mit der osmotischen Pumpe verabreicht wird. Evan blau ist das repräsentative Medikament in der osmotischen Pumpe Medikament Infusion Abbildung in der ventrikulären Region (A) und Diffusion in Seiten- und dritten Ventrikel (B) verwendet. Maßstabsleiste = 0,5 cm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Glukose-Stoffwechsel der Mäuse nach der Operation durch den oralen Glukosetoleranztest (OGTT) gemessen. Die Verteilung der Blutzuckerspiegel verändert folgt die orale Verabreichung von Glukose im WT Mäuse mit ACFS (A) und Antagonist, MCCL5 infundiert (B). Angaben als Mittelwert ± se. (Abbildung modifiziert aus:8). * p &#60; 0,05, durch zwei-Wege-ANOVA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Insulinfunktion in Mäusen den Blutzucker - Insulin-Toleranztest (ITT). Die Verteilung der Blutzuckerspiegel verändert nach Insulininjektion bei WT-Mäusen mit ACFS (A) infundiert und infundiert mit Antagonist, MCCL5 (B). Angaben als Mittelwert ± SE (Abbildung modifiziert aus:8). p &#60; 0,001, durch zwei-Wege-ANOVA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56410/56410fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Insulin-Signal Aktivität bei Mäusen nach der Operation. (A) westliche Beflecken der hemmenden Serin 302 Phosphorylierung Form der IRS-1 (Insulin Antwort Substrat-1, pIRS1S302) in Mäusen Hypothalamus Gewebe mit ACFS oder CCL5 Antagonist, MetCCL5 behandelt (MCCL5) Infusionspumpe. (B) damit verbundenen Ebenen der Phosphor-IRS-1S302 nach der Infusion in Mäusen Hypothalamus mit der normalen Fütterung.(C) westliche Beflecken der S302 Phosphorylierung des IRS-1 und Akt Aktivierung (Phosphor-Akt S473, pAktS473) mit oder ohne Insulin Stimulation im Hypothalamus Gewebe nach ACFS oder METCCL5 Infusion. (D-E) Relativen Pegel der pIRS-1S302, pS6KT421und pAktS473. ("2" in jeder Bar Graph steht für: n = 2 für alle Quantifizierungen). (Die leere Balken 5D-e, Links: die Streifen-Bars in 5D-E, ohne Insulin; rechts: mit Insulin). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56410/56410fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Maus-ID</td>
			<td>Körper</td>
			<td>Glukose</td>
			<td>Start</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gewicht</td>
			<td>Μl = 10xBW</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>25,8 g</td>
			<td>258</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>253</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Zeitplan für oraler Glucose-Toleranz-Test (OGTT) Aufnahme
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>Maus-ID</td>
			<td>Körper</td>
			<td>Insulin 0,25 IU</td>
			<td>Start</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>30</td>
			<td>60</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gewicht</td>
			<td>Μl = 3xBW</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
			<td>min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>501</td>
			<td>28,8 g</td>
			<td>86,4</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:00</td>
			<td>09:15</td>
			<td>09:30</td>
			<td>10:00</td>
			<td>10:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>502</td>
			<td>25,3 g</td>
			<td>75,9</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:07</td>
			<td>09:22</td>
			<td>09:37</td>
			<td>10:07</td>
			<td>10:37</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2. Zeitplan für die Insulin-Toleranz-Test (ITT) Aufnahme

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Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

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Unit 1

Insulin and Hypoglycemic Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

10.1K Aufrufe.  Taipei Medical University and National Health Research. Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.

Serie: Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to stimulate microcirculation. The choice of delivery method for these agents is important because the route of administration profoundly affects the bioactivity and efficacy of these agents1,2. In this article, we demonstrate how to locally administer a substance in ischemic hindlimbs by using a catheterized osmotic pump. This pump can deliver a fixed volume of aqueous solution continuously for an allotted period of time. We also present our mouse model of unilateral hindlimb ischemia induced by ligation of the common femoral artery proximal to the origin of profunda femoris and epigastrica arteries in the left hindlimb. Lastly, we describe the in vivo cannulation and ligation of the infrarenal abdominal aorta and perfusion of the hindlimb vasculature with Microfil, a silicone radiopaque casting agent. Microfil can perfuse and fill the entire vascular bed (arterial and venous), and because we have ligated the major vascular conduit for exit, the agent can be retained in the vasculature for future ex vivo imaging with the use of small specimen micro-CT3.

We show here the in vivo insertion of an osmotic pump for constant local drug delivery and the creation of hindlimb ischemia in a mouse model. Moreover, the hindlimb vasculature is perfused with Microfil, a silicone radiopaque agent, to prepare for micro-computed tomography (micro-CT) imaging.

Osmotic Drug Delivery zu ischämischen Hinterbeine und Perfusion von Blutgefäßen mit Microfil für Mikro-Computertomographie

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Forschung

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A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

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Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Mit Saccadometry mit Deep Brain Stimulation Normale und Pathologische Funktion des Gehirns zu studieren

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among the most important players in the development and evolution of stroke-evoked brain edema is the hormone arginine-vasopressin and its receptors, V1a and V2. Recently, the V1a and V2 receptor blocker conivaptan has been attracting attention as a potential drug to reduce brain edema after stroke. However, animal models which involve conivaptan applications in stroke research need to be modified based on feasible routes of administration. Here the outcomes of 48 hr continuous intravenous (IV) are compared with intraperitoneal (IP) conivaptan treatments after experimental stroke in mice. We developed a protocol in which middle cerebral artery occlusion was combined with catheter installation into the jugular vein for IV treatment of conivaptan (0.2 mg) or vehicle. Different cohorts of animals were treated with 0.2 mg bolus of conivaptan or vehicle IP daily. Experimental stroke-evoked brain edema was evaluated in mice after continuous IV and IP treatments. Comparison of the results revealed that the continuous IV administration of conivaptan alleviates post-ischemic brain edema in mice, unlike the IP administration of conivaptan. We conclude that our model can be used for future studies of conivaptan applications in the context of stroke and brain edema.

Our studies have revealed that the beneficial effects of conivaptan are dependent on the method of delivery after experimental stroke in mice. We have developed a research protocol for delivery of the receptor blocker via IV catheter on stroke-evoked brain edema formation in mice.

Kontinuierliche intravenöse Infusion ist die Wahl Behandlung Weg für Arginin-Vasopressin-Rezeptorblocker Conivaptan bei Mäusen Stroke-evozierte Hirnödem zu studieren

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Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantation in die Maus Ovarian Fat Pad

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Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The goal of computational methods for drug repurposing is to enable solutions for safer, cheaper and faster drug discovery. Towards this end, we developed a novel method that integrates genetic and clinical phenotype data from large-scale GWAS and PheWAS studies with detailed drug information on the concept of transitive Drug-Gene-Disease triads. We created "RE:fine Drugs," a freely available, interactive dashboard that automates gene, disease and drug-based searches to identify drug repurposing candidates. This web-based tool supports a user-friendly interface that includes an array of advanced search and export options. Results can be prioritized in a variety of ways, including but not limited to, biomedical literature support, strength and statistical significance of GWAS and/or PheWAS associations, disease indications and molecular drug targets. Here we provide a protocol that illustrates the functionalities available in the "RE:fine Drugs" system and explores the different advanced options through a case study.

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the &quot;RE:fine Drugs&quot; System

Here we describe a protocol using the web-based drug repurposing hypothesis generation tool: "RE:fine Drugs." This protocol can be modified to a user's preferences at the level of the query type (gene, drug or disease) and/or the range of available advanced options.

Drug Repurposing Hypothesengenerierung Mit der &quot;RE: Fein Drugs&quot; System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

Pankreasgang-Infusion: Eine effektive und selektive Methode der Medikamenten- und Virusabgabe

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Dosisabhängige Induktion von Endotoxämie bei Schweinen mittels LPS-Infusion

Lipopolysaccharide Infusion as a Porcine Endotoxemic Shock Model

Sepsis and septic shock are frequently encountered in patients treated in intensive care units (ICUs) and are among the leading causes of death in these patients. It is caused by a dysregulated immune response to an infection. Even with optimized treatment, mortality rates remain high, which makes further insights into the pathophysiology and new treatment options necessary. Lipopolysaccharide (LPS) is a component of the cell membrane of gram-negative bacteria, which are often responsible for infections causing sepsis and septic shock. 
The severity and high mortality of sepsis and septic shock make standardized experimental studies in humans impossible. Thus, an animal model is needed for further studies. The pig is especially well suited for this purpose as it closely resembles humans in anatomy, physiology, and size. 
This protocol provides an experimental model for endotoxemic shock in pigs by LPS infusion. We were able to reliably induce changes frequently observed in septic shock patients, including hemodynamic instability, respiratory failure, and acidosis. This will allow researchers to gain valuable insight into this highly relevant condition and evaluate new therapeutic approaches in an experimental setting.

Autor im Rampenlicht: Induktion eines experimentellen endotoxämischen Schocks bei Schweinen zur Untersuchung von hämodynamischer und respiratorischer Insuffizienz

We provide a protocol for an experimental endotoxemic shock model in pigs by infusion of lipopolysaccharide.

Lipopolysaccharid-Infusion als endotoxämisches Schockmodell für Schweine

Sepsis and septic shock are frequently encountered in patients treated in intensive care units (ICUs) and are among the leading causes of death in these ...