This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.

Alle hierin beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 durchgeführt. 1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Bereiten Sie zwei Edelstahl Labor Präparierscheren und zwei Edelstahl-Laborzangen. Autoklaven alle Instrumente und in eine Kultur Haube O / N unter ultraviolettem Licht (UV) Licht für die Sterilisation. </li><li> Bilden 500 ml Minimum Essential Medium (MEM) Kulturmedium (10% Fötales Rinderserum [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 6 &amp; mgr; g / ml Ampicillin) und Filter zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C für Monate. </li><li> Bereiten Sie 24 Well-Kulturplatten mit 14 mm, die Nummer 1 Dicke Deckgläser. Autoklaven werden die Deckgläser und Mantel in 100 mg / l Poly-D-Lysin (PDL), wie vorstehend beschrieben 3. UV-Licht sterilisiert O / N. </li></ol> 2. Herstellung von CGC Kulturlösungen <ol><li> Vorbereiten &quot;Lösung A&quot; (100 ml) in autoklavierten, UV-Licht behandelt, steriles dH &amp; sub2; O, enthaltend 250 mg Glukose, 300 mg Rinderserumalbumin [BSA], 955 mg phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] (Ca 2+ und Mg + free), und 1 ml 3,8% MgSO 4 · 7 H 2 O. </li><li> Vorbereiten &quot;Lösung B&quot; (10 ml), die 1 ml 5 mg / ml Trypsin in 9 ml Lösung A verdünnt </li><li> Vorbereiten &quot;Lösung C&quot; (10 ml), enthaltend 1.000 Einheiten DNase, 0,5 mg Sojabohnentrypsininhibitor, 100 &amp; mgr; l 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, 10 ml mit Lösung A. verdünnt </li><li> Vorbereiten &quot;Lösung D&quot; (20 ml), die 3,2 ml der Lösung C auf 20 ml mit Lösung A. verdünnt </li><li> Vorbereitung Balanced Salt Solution (EBSS) Lösung BSA / Earles enthaltende EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, und4% BSA, pH 7,4, wie zuvor beschrieben, 3. </li><li> Bereiten LME durch Zugabe von reinem LME in 5 ml MEM Kulturmedium, um eine Endkonzentration von 150 mM LME zu geben, zurück die Lösung auf pH 7,4 mit einem pH-Meter Tisch Modell und Filter-sterilisiert unter Verwendung eines 28 mm Polyethersulfon (PES) 0,2 um Spritzen Filter. </li></ol> 3. Kultivierung der BVKA <ol><li> Sammeln cerebella 4-7 Tage alten Rattenjungen, wie zuvor beschrieben 3. Platzieren Sie sofort in Petrischale mit 5 ml Lösung A auf Eis. </li><li> Gießen Sie überschüssige Lösung von Kleinhirne und Ort Gewebe in der Petrischale Deckel. </li><li> Zerhacken Gewebe fein mit einer gut geflammt Rasierklinge in mindestens drei verschiedenen Richtungen. </li><li> Gehackte Gewebe zu Lösung B (rinse Petrischale mit Lösung begrenzte Gewebe sicherzustellen geht verloren) und im Wasserbad bei 37 ° C für 5 min. Vorsichtig schütteln alle paar min. </li><li> In Lösung D (20 ml) zu dem Rohr, um das Trypsin, schütteln und Cent zu neutralisierenrifuge bei 65 × g für 5 min. </li><li> Überstand abgießen. </li><li> Resuspendieren in 4 ml Lösung C Man reibt gut (ca. 10 mal) mit je drei geflammten Glaspipetten mit abnehmendem Durchmesser, bis die Suspension so homogen wie möglich ist. </li><li> Langsam und vorsichtig ein paar Tropfen dieses Homogenats auf dem BSA / EBSS. Wenn es beginnt, durch die BSA / EBSS Spüle, verreiben mehr und / oder fügen Sie ein wenig mehr Lösung C. Das Homogenat sollten in einer Schicht auf der Oberseite des BSA / EBSS sitzen. Nicht schütteln. Spin bei 100 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet (weich) in 1 ml MEM-Medium. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei 800.000 Zellen / Deckglas in 500 &amp; mgr; l MEM-Medium. In einem Brutschrank bei 37 ° C unter 6% CO 2. </li><li> Ändern Sie den folgenden Tag (24 bis 36 Stunden nach der prep) des Mediums. Stellen eine Lösung von MEM-Medium mit 10 &amp; mgr; M des Zellzyklus-Inhibitors arabinofuranosyl Cytidin (AraC). <ol><li> Für jedenDeckglas, behalten 250 ul des alten Mediums in einem frischen 24-Well-Platte, saugen Sie den Rest, fügen Sie 250 ul normalen MEM-Medium und saugen Sie diese, um die Zellen zu waschen, dann die 250 ul alte Medium zurück in den Zellen und füllen mit 250 ul AraC enthaltenden Medium. Hinweis: Zellen kann von 6 Tagen in vitro (DIV) verwendet werden. </li></ol></li></ol> 4. Wahlweise zum Abbau der Mikroglia (Durchgeführt bei 6 DIV) <ol><li> Hinzuzufügen reinen LME bis 5 ml eines separaten Aliquot MEM-Medium auf eine Endkonzentration von 150 mM LME ergeben. </li><li> Rückkehr der Lösung auf pH 7,4 und mit einem Filter sterilisiert 28 mm Polyethersulfon (PES), 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter filtriert. </li><li> Verdünnte Lösung auf eine Konzentration von 50 mM (2 x LME) in MEM-Medium und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 10 min mit dem normalen MEM Medium für Kontrollkulturen. </li><li> Entfernen Sie die Hälfte (250 ul) der MEM-Medium von CGC Kulturen und bei 37 ° C zu halten. </li><li> Treat-Zellenmit MEM-Medium, das 2 x LME (250 ul), das heißt 1: 1 verdünnt hat ein schönes Konzentration von 25 mM oder mit vorgewärmter MEM-Medium ohne LME (250 ul) für Kontrollkulturen. </li><li> Zellen bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6% CO 2 für 1 Stunde. </li><li> Wash Zellen zweimal in frischem vorgewärmten MEM-Medium zu LME haltigen Medien zu entfernen, und ersetzen Sie dann den gehaltenen Kulturmedium und ein gleiches Volumen an frischem vorgewärmten MEM-Medium in die entsprechenden Wells. </li><li> Zurück Kulturen in den Inkubator (mit 6% CO 2 bei 37 ° C befeuchtet) ruhen lassen für 24 h vor der weiteren Behandlung. </li></ol>

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	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable,+yet+not+extraordinary,+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost.">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li><li>Evans, G. J., &amp;Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurotransmitter+release+by+dihydropyridine-sensitive+calcium+channels+involves+tyrosine+phosphorylation.">Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation.</a> Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).</li><li>Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. 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A., Hewett SJ, ., Winkler, S., Pfeiffer SE, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+expression+in+cultures+enriched+for+mature+oligodendrocytes+is+due+to+microglia.">Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia.</a> J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).</li><li>Jebelli, J., Hooper, C., &amp;Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+p53+activation+is+detrimental+to+neuronal+sysnapses+during+activaton-induced+inflammation:+implications+for+neurodegeneration.">Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration.</a> Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).</li><li>Frade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+release+of+glutathione+from+cultured+rats+astrocytes+&#8211;+a+possible+neuroprotective+mechanism.">Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes &#8211; a possible neuroprotective mechanism.</a> J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).</li><li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes.">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li><li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase,+phosphatidylinositol-3-kinase/Akt+and+delta-Notch+signalling+cascades.">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li><li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures.">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die wichtigsten Schritte, um die erfolgreiche selektive Elimination von Mikroglia CGC sichern und / oder Mischkulturen sind: 1) die Aufrechterhaltung einer sterilen und gesunde CGC Kultur; 2) Sterilfiltrieren der LME haltigen Medium und Rückführen der Lösung auf pH 7,4; 3) halten die beibehalten CGC Medien und LME haltigen Medien bei 37 ° C, um Hitzeschock zu vermeiden; und 4) schnell arbeiten, um die Zeit-Zellen werden außerhalb des Inkubators gehalten zu reduzieren. Wir h...

Das menschliche Gehirn enthält schätzungsweise 85 Milliarden Neuronen und eine weitere 85 Milliarden nicht-neuronalen Zellen, sowie Glia 1. Daher der griechischen Etymologie &quot;Glia&quot; übersetzt in englisch als - zum größten Teil von den letzten 100 Jahren haben Neurowissenschaftler überwiegend auf der neuronalen Zellpopulation konzentriert, zu glauben, Gliazellen auf wenig mehr als passive Stützzellen, die strukturelle Unterstützung für den Neuronen vorgesehen sein &quot;Leim&quot;. In jüngster Zeit wurde es jedoch zunehmend offensichtlich geworden, dass neuronale-glial Wechselwirkungen können weitaus Grund grundlegende Aspekte der Neurobiologie, Neurophysiologie und der Entstehung und Progression von vielen neurodegenerativen Krankheiten. Kleinhirn-Körnerzellen (BVKA), die am häufigsten vorkommende homogene neuronalen Population im menschlichen Gehirn, dominieren das Kleinhirn und machen mehr als 90% der Zellbestandteile. Folglich wurden diese Zellen ausgiebig in vitro als Modellsystem für T verwendeter studieren der neuronalen Entwicklung, Funktion und Pathologie 2-6. Allerdings enthalten CGC Kulturen noch Mikroglia und anderen Glia in wohl signifikante Anteile. Als Ergebnis CGC Daten mutmaßlich Anzeige direkten neuronalen Reaktionen auf verschiedene Zellen Behandlungen können in der Tat ergeben - teilweise oder insgesamt - aus dem indirekten sekundäre Antwort benachbarter Glia in der Kultur. Um dies zu beurteilen, haben wir selektiv abgespalten Mikroglia von CGC neuronalen Kulturen mit Hilfe von L-Leucinmethylester (LME). LME ist ein lysomotropic Mittel ursprünglich benutzt, um selektiv Makrophagen 7 zerstört und seit verwendet worden, um auch selektiv abzureichern Mikroglia aus neuralen, Astrozyten und gemischten Gliakulturen 8.9.10. LME wird von Makrophagen und Mikroglia verinnerlicht, bei dem es lysosomalen Unterbrechung und anschließender Apoptose 13,14 bewirkt. Makrophagen und Mikrogliazellen sind charakteristischerweise reich an Lysosomen, wodurch sie particula seinrly anfällig bei Exposition gegenüber LME Behandlung. Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke und dennoch einfache und einfache Möglichkeit, den Beitrag der Mikroglia in Experimenten unter Verwendung von CGC und andere neuronale / Gliazellen Kultursystemen zu ermitteln.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>The curved end facilitates removal of the cerebellum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146</td>
			<td>Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine methyl ester hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7517-19-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7510-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27964-99-4</td>
			<td>Coat coverslips 1 day before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ED1 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selective depletion of microglia from cerebellar granule cell cultures using l-leucine methyl ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Die Fähigkeit dieser Technik selektiv zu eliminieren Mikroglia CGC und / oder Mischkulturen beruht auf der nachfolgenden Fähigkeit des Untersuchers genau zu identifizieren und zu differenzieren Mikroglia aus ihrer umgebenden Zellen. Dies kann mit einer Mikroglia-spezifischen Zellmacher, wie isolectin-B4 erreicht werden, wie in 1 dargestellt. Wie in Figur 2 gezeigt, wurden keine beobachtbaren Änderungen in Astrozyten und neuronalen Dichte und Morphologie in Bezug auf jede Hauptbehandl...

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Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Aufrufe.  University of Washington. Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature. 