This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.

여기에 설명 된 모든 실험은 영국의 동물 (과학적인 절차) 1986 년 법에 따라 수행 하였다. 악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비 <ol><li> 두 스테인레스 스틸 실험실 해부 가위와 두 개의 스테인레스 스틸 실험실 집게를 준비합니다. 문화 후드 O의 모든 악기와 장소를 압​​력솥 / N 살균 자외선 (UV) 빛 아래. </li><li> 최소 필수 매체 (MEM) 배지 (500 mL로 10 % 태아 소 혈청 [FBS, 20 mM의 KCl을 25 mM의 NaHCO3를, 30 mM의 D- 글루코오스, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 6 μg의 / ㎖ 암피실린) 및 필터 소독. 달 동안 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 14mm, 번호 1 두께 된 커버를 포함하는 24 잘 배양 플레이트를 준비합니다. 이전에 3 설명한 바와 같이 100 ㎎ / ℓ 폴리 D 라이신 (PDL)의 커버 슬립과 코트를 압력솥. 자외선은 O / N을 소독. </li></ol> CGC 문화 솔루션 2. 준비 <ol><li> 처리 된 오토 클레이브, UV 광, 멸균 DH에서 &#39;용액 A&#39;(100 ㎖)를 준비 포도당 250 ㎎, 소 혈청 알부민 [BSA] 300 mg을 인산염 완충 염수 [PBS (칼슘 및 955 ㎎을 함유하는 2 O 마그네슘) + 무료, 3.8 %의 1 ml의 황산 4 · 7H 2 O </li><li> A. 용액 9 ㎖에 희석 / ㎖ 트립신 5 mg을 1 ㎖를 함유하는 &#39;용액 B&#39;(10 ㎖)를 준비 </li><li> &#39;용액 C&#39;1000 유닛의 DNase, 대두 트립신 억제제의 0.5 ㎎, A. 용액 10 mL로 희석하여 3.8 % 황산 · 7H 2 O 100 ㎕를 함유하는 (10 ㎖)를 준비 </li><li> A. 용액으로 20 ㎖로 희석 용액 3.2 ml의 C를 함유 &#39;용액 D&#39;(20 ㎖)를 준비 </li><li> · 7H 2 O EBSS, 25 mM의 NaHCO3를, 3 mM의 황산을 포함 BSA / 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) 솔루션을 준비하고,4 % BSA, pH를 7.4으로 이전에 3을 설명했다. </li><li> 150 mM의 LME의 최종 농도를 수득 MEM 배지 5 ㎖에 순수한 LME 추가하여 LME 준비 벤치 탑 pH 미터를 사용하여 pH를 7.4까지 용액을 복귀하고, 필터는 28mm의 폴리 에테르 설폰 (PES), 0.2 μm의 주사기를 사용하여 소독 필터. </li></ol> 3. CGCs을 배양 <ol><li> 이전에 3 설명한대로 4-7 일 된 쥐 새끼에서 소뇌를 수집합니다. 얼음에 5 ml의 솔루션을 포함하는 배양 접시에 바로 배치합니다. </li><li> 페트리 접시 뚜껑에 소뇌와 장소 조직에서 과잉 솔루션을 붓고. </li><li> 적어도 세 개의 서로 다른 방향에서 잘 골조 면도날 미세 조직을 잘라. </li><li> 5 분 동안 37 ℃에서 물을 욕조에 솔루션 (손실 제한 조직을 위해 솔루션 페트리 접시를 씻어) B와 장소에 다진 조직을 추가합니다. 분의 부드럽게 모든 커플을 흔들어. </li><li> 트립신, 흔들림 센트를 중화하기 위해 튜브에 용액 D (20 ml)에 추가5 분 동안 65 XG에 rifuge. </li><li> 상층 액을 붓는다. </li><li> 현탁액 가능한 균질해질 때까지, 직경을 감소시키는 세 골조 유리 피펫으로 잘 용액 C. 씹다 4 ㎖ (약 10 회)에 재현 탁. </li><li> 천천히 부드럽게 BSA / EBSS 위에이 균질 몇 방울을 추가합니다. 이 BSA / EBSS를 통해 싱크 시작하면, 더 씹다 및 / 또는 균질는 BSA / EBSS의 상단에 레이어에 앉아 있어야 좀 더 솔루션 C를 추가 할 수 있습니다. 흔들지 마십시오. 5 분 동안 100 XG 스핀. </li><li> 상층 액과 MEM 배지 1 ㎖에 재현 탁 펠릿 (소프트)를 제거합니다. </li><li> MEM 배지 500 μL에 80 만 셀 / 커버 슬립에서 혈구와 플레이트를 사용하여 세포를 계산합니다. 6 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에있는 장소. </li><li> 매체에게 다음 날 (준비 후 24 ~ 36 시간)을 변경합니다. 세포주기 억제제 아라 비노 푸라 노실 시티 딘 (ARAÇ) 10 μM을 함유하는 MEM 배지 용액을 제조. <ol><li> 각각커버 슬립은 다시 세포와 정상까지 오래된 매체의 250 μl를 추가, 신선한 24 웰 플레이트에서 기존 매체의 250 μl를 유지 나머지를 대기음, 정상 MEM 배지 250 μl를 추가 한 다음, 세포를 씻어이 대기음 ARAÇ 함유 매체의 250 μL와. 참고 : 세포는 체외 (DIV)에서 육일에서 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 선택적으로 미세 아교 세포 고갈 (6 DIV에서 수행) <ol><li> 150 mM의 LME의 최종 농도를 수득 MEM 배지 별개 분취 량 5 ml의 순수한 LME 추가. </li><li> pH 7.4의 용액으로 돌아가서 필터 28mm 폴리 에테르 술폰 (PES), 0.2 μm의 주사기 필터를 이용하여 멸균. </li><li> 제어 배양 정상적인 MEM 배지와 함께 10 분 동안 37 O C에서 수욕 MEM 배지 자리에 50 mM의 (2 × LME)의 농도로 용액을 희석. </li><li> 반 (250 μL) CGC의 문화 MEM 배지를 제거하고 37 ℃에서 유지한다. </li><li> 취급 세포또는 제어 문화에 대한 LME없이 미리 예열 MEM 배지 (250 μL) 25 mm의 잘 농도를주는 1 : 즉, 2 × LME (250 μL)를 포함하는 MEM 배지로 1 희석. </li><li> 1 시간 동안 6 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 두번 신선한 미리 예열 MEM 배지에서 세척 세포 LME - 함유 배지를 제거하고 배양 배지를 유지 및 해당 웰 신선한 미리 예열 MEM 매체의 동일 부피를 대체한다. </li><li> (37 ° C에서 6 % CO 2 가습) 인큐베이터에 문화를 반환하고 추가 처리하기 전에 24 시간 동안 나머지 둡니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable,+yet+not+extraordinary,+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost.">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li><li>Evans, G. J., &amp;Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+neurotransmitter+release+by+dihydropyridine-sensitive+calcium+channels+involves+tyrosine+phosphorylation.">Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation.</a> Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).</li><li>Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways+mobilized+in+microglia+and+neurones+as+a+consequence+of+chromogranin+A-induced+microglial+activation.">Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation.</a> J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).</li><li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro.">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li><li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells.">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+rat+cerebellar+granule+neurons+and+application+to+identify+neuroprotective+agents.">Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents.</a> Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).</li><li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood:+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent,+L-leucine+methyl+ester.">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li><li>Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+glia+release+factors+with+opposing+actions+upon+neuronal+survival.">Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival.</a> J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).</li><li>Guillemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtention+and+characterization+of+primary+astrocyte+and+microglial+cultures+from+adult+monkey+brains.">Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains.</a> J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).</li><li>Hewett, J. A., Hewett SJ, ., Winkler, S., Pfeiffer SE, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+nitric+oxide+synthase+expression+in+cultures+enriched+for+mature+oligodendrocytes+is+due+to+microglia.">Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia.</a> J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).</li><li>Jebelli, J., Hooper, C., &amp;Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+p53+activation+is+detrimental+to+neuronal+sysnapses+during+activaton-induced+inflammation:+implications+for+neurodegeneration.">Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration.</a> Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).</li><li>Frade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+release+of+glutathione+from+cultured+rats+astrocytes+&#8211;+a+possible+neuroprotective+mechanism.">Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes &#8211; a possible neuroprotective mechanism.</a> J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).</li><li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes.">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li><li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase,+phosphatidylinositol-3-kinase/Akt+and+delta-Notch+signalling+cascades.">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li><li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures.">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

가장 중요한 단계는 CGC에서 미세 아교 세포의 성공적인 선택적 제거를 보장하기 위해 및 / 또는 혼합 된 문화가있다 : 1) 멸균 및 건강한 CGC 문화를 유지하는 단계; 2) 필터 LME 함유 배지를 살균하여 pH 7.4 용액을 복귀; 3) 유지 CGC 미디어를 유지하고 37 미디어 LME이 함유 열 충격을 방지하기 위해 C를 °; 4) 세포를 배양기 밖에 유지되는 시간을 줄이기 위해 빨리 작동. 이?...

인간의 두뇌는 추정 850 억 뉴런 및 아교 세포를 포함 하나 85000000000 다른 비 신경 세포를 포함한다. 영어로 번역 &#39;아교 세포&#39;의 따라서 그리스 어원 - 신경 과학자가 신경 세포 인구에 주로 초점을 맞추고있다 지난 100 년간의 큰 부분을 위해, 아교 세포를 믿는 것은 뉴런 구조 지원을 제공하는 수동적 인 지원 세포보다 조금 더 할 수 &#39;접착제&#39;. 최근에, 그러나, 신경 - 아교 상호 작용이 신경 생물학, 신경 생리학, 많은 신경 퇴행성 질환의 기원과 진행의 기본 측면에 훨씬 더 근본적인 될 수 있다는 것을 점점 더 분명되고있다. 소뇌 과립 세포 (CGCs), 인간의 두뇌에서 가장 풍부한 균일 신경 인구는 소뇌를 지배하고 세포 구성 성분의 90 % 이상을 차지한다. 따라서, 이러한 세포는 t위한 모델 시스템으로 in vitro에서 광범위하게 사용되어왔다그는 신경 발달, 기능, 병리 2-6의 연구. 그러나, CGC의 문화는 여전히 논란의 여지 상당한 비율의 미세 아교 세포 및 기타 아교 세포가 포함되어 있습니다. 그 결과, 추정되는 다른 세포 치료법에 직접 신경 반응을 표시 CGC 데이터가 실제로 발생할 수 - 부분적 또는 전체로 - 배양에서 신경교 이웃 간접 보조 응답으로부터. 이를 평가하기 위해, 우리는 선택적으로 L-류신 메틸 에스테르 (LME)의 도움으로 CGC의 연결을 문화에서 미세 아교를 제거. LME 원래 선택적 식세포 7을 파괴하는데 사용 lysomotropic 에이전트이며, 이후 선택적 신경, 성상 세포, 및 신경 교세포의 혼합 배양에서 8,9,10 미세 아교 세포를 고갈하는 데 사용되어왔다. LME는 리소좀 파쇄 및 후속 13,14 아폽토시스를 유발하며, 대 식세포와 미세 아교 세포에 의해 내재화된다. 대 식세포와 미세 아교 세포는 그들이 particula로 발생 리소좀에서 특징적으로 풍부LME 처리에 노출시 RLY 취약합니다. 이 프로토콜은 CGC 및 다른 신경 / 아교 세포 배양 시스템을 이용한 실험에서 미세 아교 세포의 기여를 확인 할 수있는 강력하면서도 간단하고 쉬운 방법을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>The curved end facilitates removal of the cerebellum&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3146</td>
			<td>Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine methyl ester hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7517-19-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7510-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27964-99-4</td>
			<td>Coat coverslips 1 day before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-ED1 antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selective depletion of microglia from cerebellar granule cell cultures using l-leucine methyl ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

선택적으로 CGC 및 / 또는 혼합 된 문화에서 미세 아교 세포를 제거하기 위해이 기술의 능력을 정확하게 파악하고 자신의 주변 세포에서 미세 아교 세포를 분화하는 연구자의 후속 능력에 의존한다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 이것은, 예컨대 동종 렉틴-B4 같이, 소교 특정 셀 머신을 사용하여 달성 될 수있다.도 2에서 설명한 바와 같이, 성상 세포 및 신경 세포의 밀도 및 형?...

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Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

소뇌 과립 세포 배양에서 미세 아교 세포의 선택적 고갈 L - 류신 메틸 에스테르를 사용하여

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K 조회수.  University of Washington. Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature. 