The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

Die Tiere wurden nach der Fazilität für Experimentelle Medizin (FEM, Charité, Berlin, Deutschland) gehalten wird, und alle Versuchsprotokolle wurden überprüft und durch das Landesamt für Gesundheit und lokale Angelegenheiten (LAGeSo, Berlin, Deutschland zugelassen; Reg. No. O 0365 / 11). 1. Liver Harvesting <ol><li> Präoperative Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie eine Korkplatte zur Fixierung. Setzen Sie ein medizinisches Tuch auf dem Teller. Mit vier Nadeln, fix eine Inhalationsmaske auf der Korkplatte zur intraoperativen Inhalationsnarkose. </li></ol></li><li> Vorbereitung des Portalvenenkanüle <ol><li> Anschluss eines peripheren Venenkatheters (G 20) mit einem Dreiwegehahn. Der Katheter sollte schräg abgeschnitten werden, mit einer Länge von rd. 1,5 cm. </li><li> De-Luft das System mit einem 10-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt. Es ist sehr wichtig, sorgfältig zu entlüften, da Gasembolie kann sich negativ auf die Durchblutung Dezellularisierung. </li></ol></li><li> Vorbereitungder Arterienkanüle <ol><li> Verwenden Sie ein Schmetterlingskanüle und schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 5 mm. Setzen Sie einen 5 cm Schlauch (ID 0,58 mm, AD 0,96 mm) auf die 5 mm Nadel setzen und mit Sekundenkleber. Legen Sie eine 2 cm lange Rohr (ID 0,28 mm, AD 0,61 mm) in das größere Rohr montieren und mit Sekundenkleber. </li><li> Gleiten Sie einen anderen Schlauch über diese Konstruktion als Anschlag montieren und mit Sekundenkleber. De-Luft die Arterienkanüle mit einem 5-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt. </li></ol></li><li> Anästhesie und Analgesie <ol><li> Induzieren Narkose der Ratte im Narkoseinduktionskammer um 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,5 L / min. </li><li> Um sicher zu Analgesie während des Betriebs zu gewährleisten, injizieren Metamizol (100 mg / kg Körpergewicht) und Niedrigdosis Ketamin / Medetomidin (10 mg / 0,1 mg pro kg Körpergewicht) intraperitoneal. </li><li> Liefern 1,5% Isofluran in 1 l / min Sauerstoff über der Inhalationsmaske für die spätere Wartung der chirurgischen Anästhesie. </li></ol></li><li> Präoperative Arrangements &lt;ol&gt; <li> Rasieren Sie den Bauch zügig mit einer elektrischen Schermaschine. Feuchten Sie die rasierte Einschnittstelle auf dem Bauch mit 70% Ethanol zur Desinfektion. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem vorbereiteten Platte, legen Sie den Kopf in die Inhalationsmaske und die Extremitäten mit medizinischem Klebeband und Stifte zu befestigen. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol und Fell mit einem Gazekompresse. </li></ol></li><li> Anästhesie-Bewertung <ol><li> Beurteilen Sie die Narkose Tiefe durch die Beobachtung der Atemfrequenz. Wenn die Betäubung scheint tief genug (40-60 Atemzüge / min), zu prüfen, ob Analgesie ist, indem Sie versuchen, um die Zehe Prise Reflex mit chirurgische Pinzette, um die Haut zwischen den Zehen beider Hinterbeine klemmen auslösen ausreichend. </li></ol></li><li> Bauch-Ansatz <ol><li> Machen Sie eine Medianschnitt in die Schwanzbauchdecke über der Blase. Von diesem Punkt an beiden seitlichen Rippenbögen in einer V-förmig geschnitten. Achten Sie darauf, in die Membran geschnitten. Ziehen Sie die Bauchdecke schneiden auf der Brust. </li&gt; <li> Befestigen Sie den Schwertfortsatz mit einem Overholt Klemme, ziehen Sie es nach kranial und fixieren Sie sie mit einem Gummiband. Verwenden nassen Wattestäbchen, um den Darm zu evakuieren. Wickeln Sie den Darm in einem feuchten Mullbinde. Darüber hinaus decken alle Bauchränder mit nassen Verband anlegen. </li></ol></li><li> Liver Vorbereitung <ol><li> Präparieren Sie die Ligamentum falciforme. Verwenden Sie einen feuchten Mullbinde auf die mediale und linken Leberlappen kranial unter der Kuppel der Membran zu halten. Setzen Sie das Ligamentum hepatoduodenale und die obere omental Leberlappen. </li><li> Verwenden Sie zwei microforceps und Frühjahr Schere sorgfältig sezieren das Band an der oberen omental Lappen angebracht, bis der Lappen ist mobil. Bewegen Sie den Lappen mit feuchten Wattestäbchen unter der Gazekompresse, halten die medialen und linken Lappen vorhanden. </li><li> Nach Mobilisation der oberen omental Leberlappen, bewegen Sie den Bauch auf der linken Seite. Befestigen Sie den Magen mit einer Klemme und sezieren die kleinere Netz mit microforceps und den Feder Schere. </li><li> Mobilisierung der unteren Omental Leberlappen, bis es ist mobil und anschließend die Lappen in seinem Hohlraum zu bewegen zurück. Benutzen Sie einen Haken, um den Backhaus Zwölffingerdarm zu behalten. Bewegen Sie den Zwölffingerdarm nach links zu dehnen und setzen den Ligamentum hepatoduodenale. Umschreiben den Gallengang in der gestreckten Ligamentum hepatoduodenale. </li><li> Präparieren Sie die Gallengang aus dem Fettgewebe und Pankreasgewebe. Schneiden Sie den Gallengang 1,5 cm aus dem Gallengang Bifurkation. Präparieren Sie die Pfortader aus dem umgebenden Fettgewebe. Setzen Sie das gastro-Vene. </li><li> Ligieren der gastroduodenalen Vene zweimal mit Seide 6-0 und teilen Sie die Vene zwischen 2 Ligaturen. Präparieren Sie die Zöliakie-Stamm und die gemeinsame Leberarterie aus dem umgebenden Gewebe, bis alle arteriellen rami enthüllt werden. </li><li> Befreiung der gastroduodenalen Arterie aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastroduodenalis zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die gastroduodenalen Arterie zwischen 2 Ligaturen. </li><li> Befreien Sie die Milzarterievon dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die Milzarterie zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Milzarterie zwischen den 2 Ligaturen. </li><li> Befreien Sie die A. gastrica sinistra aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastrica sinistra zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Arterie zwischen 2 Ligaturen. </li><li> Umgrenzen die Vena cava inferior zwischen der rechten Niere und der rechten seitlichen Leberlappen. Präparieren Sie die Vene aus dem Retroperitoneum. Expose der Aorta durch Befolgen des Truncus coeliacus. </li><li> Präparieren Sie die retroperitonealen Fettgewebe. Injizieren 1000 IE Heparin in 1 ml Kochsalzlösung in die untere Hohlvene. Ziehen Sie die Kanüle, und schließen Sie den Schnitt mit einem Wattebausch. Warten Sie 1-2 Minuten für die systemische Wirkung von Heparin. </li><li> Umschreiben die Aorta mit einer Pinzette. Präparieren Sie die Aorta und exsanguinate die Ratte. Weiterhin sezieren die untere Hohlvene sich distal von der Niere. </li></ol></li><li> Portal Venen-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.2 zubereitet) <ol><li> Machen Sie eine Fisch-Mund-Schnitt in der distalen Pfortader. Öffnen Sie die Schnittführung mit einer Pinzette und kanülieren die Pfortader. Spülen Sie die Leber mit 20 ml Ringer-Lösung, bis die Leber entfärbt und befestigen Sie die Kanüle mit Ligaturen (6-0 Seide). </li></ol></li><li> Arterien-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.3 zubereitet) <ol><li> Präparieren Sie die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus. Befreien Sie die Aorta Segment aus dem Retroperitoneum. Schneiden Sie die Aorta Segment in Längsrichtung, um einen Aorten-Patch zu erzeugen. Legen Sie die selbst gebauten Kanüle in einen statischen Halter. </li><li> Verwenden Sie 2 Pinzette, um die Aorta-Patch über der Kanüle gleiten. Ligieren die Leberarterie mit Seide 6-0 über die Kanüle und befestigen Sie den Patch auf den Anschlag. </li></ol></li><li> Liver Explantation <ol><li> Öffnen Sie die Blende, einen Zirkelschnitt und sezieren die Leber von den umgebenden Strukturen. </li></ol></li><li> Lagerung <ol><li> Store der Leber in einem sterilen 500 ml-Tank mit 350 ml Ringer-Lösung bis zur Verwendung gefüllt. </li></ol></li></ol> 2. Waschmittellösungen <ol><li> 10% Triton X-100-Stammlösung <ol><li> Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen Sie 100 ml Triton X-100 (99,9%). Verwenden Sie einen Rührer, die Triton X-100 zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist. </li></ol></li><li> 1% Triton X-100 <ol><li> 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000-ml-Flasche. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% Triton X-100-Lösung durch ein Sterilfilter. </li></ol></li><li> 10% SDS-Stammlösung <ol><li> Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen 66,99 g SDS (99,9%, Dichte 0,67). Verwenden Sie ein Rührwerk, das SDS zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist. </li></ol></li><li> 1% SDS <ol><li> 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000 ml bottle. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% SDS-Lösung durch ein Sterilfilter. </li></ol></li></ol> 3. Dezellularisierung <ol><li> Aufbau von Perfusionsvorrichtung <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Abb. 1: Schematische Darstellung der Perfusion Gerät zur Tiefen Arterielle und venöse Portal Perfusion von Four Rattenlebern unter oszillierenden Druckbedingungen (. Von Struecker et al modifiziert 14) <ol><li> Verknüpfen Sie die Drain mit einem Dreiwegehahn und einem Heidelberger Verlängerung, um den Füllstand zu regulieren und füllen den Reaktor mit 500 ml 0,9% NaCl. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Abb. 2: Schema der Perfusion Set-Up-Link-Perfusionskammer (1.400 cm 3) (1) zum distalen Ende (4) der Luftfalle (5) über die Pfortader Zugriff (2) oder über die arterielle acProzess (3). Die Blasenfalle (5) ist mit einem Verschließen (4) am distalen Ende und einer Entlüftungsöffnung (6) ausgestattet sein. Schließen Sie die Blasenfalle (5) zu einer Heidelberger Verlängerung (7). Verknüpfen Sie die Heidelberger Verlängerung der Pumpstrecke (8). Darüber hinaus schließen Sie das Pumpensegment (8) zu einem anderen Heidelberger Verlängerung (9). Legen Sie die letzten Heidelberger Verlängerung (9) in die Flasche Spülmittel-Lösung (10). Verbinden das Beatmungsgerät (11) an der Perfusionskammer (oder an den Druckverteiler in dem Fall von mehreren Infusionen). In den Reaktor Flüssigkeiten ablaufen, schließen Sie den Abfluss in die Abfallflasche (12). <ol><li> Setzen Sie die Pumpensegment in die Pumpe. Starten Sie die Pumpe, um den Zyklus mit PBS füllen, schließen Sie das distale Ende der Blasenfalle und öffnen Sie das Entlüftungs. Wenn der Boden der Blase fest mit PBS (2-3 cm) bedeckt ist, schließen Sie das Entlüftungs und öffnen Sie das distale Ende der Blasenfalle. </li><li> Liver Installations <ol><li> Verknüpfen Sie den Dreiwegehahn der Pfortader Kanüle dem Stand der Reaktorzugang. Cerbinden die Arterienkanüle mit dem arteriellen Zugang. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Systeme. </li></ol></li><li> Anwendung des oszillierenden Druckbedingungen <ol><li> Atemschutz mit einer Frequenz von 15 Schlägen pro Minute und einer Amplitude von 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Schließen Sie das Beatmungsgerät an die Druckverteilungskammer und schließen Sie die Kammer in den Reaktor. Starten Sie Druckanwendung. </li></ol></li><li> Dezellularisierung Protocol <ol><li> Zuführen Perfusion Stufen mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. Starten Sie die Dezellularisierung mit Perfusion der Leber mit 1% Triton X-100 für 90 min. Erlauben Abfall Ausfluß über den Abfluss der Perfusionsvorrichtung bis der Flüssigkeitsstand im Inneren der Perfusionskammer konstant und über der perfundierten Leber halten. Nach 90 Minuten, ändern Sie das Reinigungsmittel auf 1% SDS. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Abbildung 3: Perfusion Protokoll für alle Versuchsgruppen.

<ol>
	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors.">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li><li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats.">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li><li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid.">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li><li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+whole-organ+assembly:+moving+toward+transplantation+on+demand.">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement.">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li><li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization:+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool.">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li><li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats.">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li><li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering.">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions.">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions:+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process.">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Obwohl die hier beschriebene Methode zur Rattenleber Ernte und Dezellularisierung wird leicht reproduzierbar, gibt es bestimmte kritische Schritte zu berücksichtigen: Während der Herstellung von Leber Ernte, ist es wichtig, zu schweren Blutungen zu vermeiden, da es die Blutgerinnung aktiviert und kann zu der Bildung von Blutgerinnseln in der Leber führen. Unserer Meinung nach ist es vorteilhaft, um die Bauchaorta direkt einzuschneiden vor Kanülierung der Pfortader, um den Blutzufluss üb...

Dezellularisierung und Rezellularisierung kann die Erzeugung von funktionellen, transplantierbaren Organen in vitro 1 zu ermöglichen. Durch Entfernung von Zellen und antigenes Material (z. B. DNA, Alpha-Gal Epitope) von einem Organ, das nicht oder weniger immunogen extrazellulären Matrix (ECM), erhalten werden. Diese Matrix konserviert die dreidimensionale Mikroanatomie eines Organs und kann als ideal Biomatrix zur Repopulation mit Zellen einer anderen, möglicherweise xenogenen Ursprungs 2 dienen. Somit könnte eine dezellularisierte Rattenleber Matrix mit menschlichen Leberzellen wiederbesiedelt wird. Dieser humanisierte Mikro Leber könnte als Ex-vivo-Modell für die Erforschung von Krankheiten (z. B. angeborene Stoffwechselkrankheiten, Viruserkrankungen oder malignen Erkrankungen) oder für präklinische Arzneimittelprüfung 3 dienen. Mehrere verschiedene Protokolle für die Rattenleberdurchblutung Dezellularisierung wurden bereits veröffentlicht 13.04. In allen Protokollen decellularsierung wurde durch Perfusion von Alkali ionische oder nichtionische Detergentien über kanülierten Pfortader erreicht. Um das Beste aus unserem Wissen, wir waren die erste Gruppe, Rattenleber Dezellularisierung über die Pfortader und / oder dem Rattenleberarterie 14 zu melden durch selektive Perfusion. Aktivieren der selektiven Perfusion der verschiedenen Gefäßsysteme in der Leber besser Dezellularisierung Ergebnisse ermöglichen und darüber hinaus eine wichtige Rolle in der zellulären Wiederbesiedelung zu spielen. In der Studie detailliert hier wurden Lebern in einem maßgeschneiderten proprietären Perfusionsvorrichtung perfundiert, wodurch die Perfusion unter oszillierenden Druckbedingungen. Diese Druckbedingungen imitieren die physiologische Atemabhängigen Perfusion der Leber: in situ hängt der Leber unter dem Copula der Membran, deren Bewegung während der Atmung hat einen direkten Einfluss auf die Leberperfusion. Inspiration führt insbesondere zu einer Verringerung der Membran und Zusammendrücken der Leber, zu optimierenLeber-venösen Abfluss, führt in der Erwägung, Ablauf, um Höhe der Leber und der Absenkung der intraabdominellen Druck portal-venösen Zufluss 15 zu optimieren. Unser Ziel war es festzustellen, ob oszillierenden Druckbedingungen einen Einfluss auf die Homogenität der Rattenleber Perfusion Dezellularisierung durch die Nachahmung von intraabdominellen Bedingungen ex vivo haben. Die Homogenität der Dezellularisierung Prozess kann ein unterschätzter Faktor bei Perfusion Dezellularisierung sein. Alle bekannten Mittel verwendet für Leber Dezellularisierung Ursache Änderungen an der ECM. Zellen in schlecht durchbluteten Gebieten bleiben im ECM, während andere Bereiche bereits vollständig dezellularisiert. Um die restlichen Zellen zu lösen, muss der Perfusion Dauer oder Druck erhöht werden, was zu mehr Veränderungen an den gut durchbluteten Bereichen. Daher sollten Reinigungsmittel für Dezellularisierung homogen innerhalb des Organs verbreitet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self built arterial cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td>
			<td>SIMS Portex</td>
			<td>REF 800/110/100</td>
			<td>0,28mm ID 0,61mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td>
			<td>SIMS Portex</td>
			<td>REF 800/110/200</td>
			<td>0,58mm ID 0,96m OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venodrop Safe butterfly catheter</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>3275851</td>
			<td>21 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>portal vein cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periphereal Venous Catheter</td>
			<td>BD</td>
			<td>393224</td>
			<td>BD Venflon Pro 20G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>three-way stopcock</td>
			<td>smiths medical</td>
			<td>888-101RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Sticks</td>
			<td>Hecht-Assistent</td>
			<td>4302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Pads&#160;</td>
			<td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td>
			<td>13H118-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Bandage</td>
			<td>Hubei Haige&#160; Medical Instruments</td>
			<td>14388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ringer Solution</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>13 HKP022</td>
			<td>1000ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>10ml/ Luer Solo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606061V</td>
			<td>5ml /Luer Solo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (Silk 6/0)</td>
			<td>Resorba</td>
			<td>H1F</td>
			<td>LOT 105001.81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical drape</td>
			<td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td>
			<td>D0613011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>17570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-forceps</td>
			<td>Inox-Electronic</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-scissors</td>
			<td>Martin</td>
			<td>11-740-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-forceps</td>
			<td>S&#38;T&#160;</td>
			<td>112314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BH111R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td>F S T&#160;</td>
			<td>14501-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD 557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Decellularisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Respirator</td>
			<td>Resmed</td>
			<td>14.24.11.0004</td>
			<td>SmartAIR ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Device</td>
			<td>Charite, medical engineering laboratory</td>
			<td>custome-made device</td>
			<td>decellularisation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>ISM4408&#160;</td>
			<td>4-channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heidelberger extension 75 cm&#160;</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>2873</td>
			<td>75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS/CA pump-segment</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>IS 3510&#160;</td>
			<td>MS/CA/click&#39;n&#39;go/POM-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA 2-stopper tube</td>
			<td>Pharmed</td>
			<td>BPT NSF-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bubble trap&#160;</td>
			<td></td>
			<td>custome-made item</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock hose connector</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>No. 02-1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detergents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS pellets</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>CN30.4&#160;</td>
			<td>2,5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>3051.1&#160;</td>
			<td>10l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin 1%</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>10177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer hematoxylin</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gomori staining</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>11104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlcainBlue-PAS staining</td>
			<td>Morphisto</td>
			<td>11388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Red 80&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>365548</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Die Homogenität und damit die Wirksamkeit der verschiedenen Dezellularisierung Protokolle wurden durch makroskopische Beobachtung histologischen Analyse und Analyse der verbleibenden DNA-Gehalt innerhalb dezellularisierte Leber Matrizen ausgewertet. Darüber hinaus wurde Korrosionsgießtechnik geführt, um die intakte Mikroanatomie der Leber nach Dezellularisierung visualisieren. Makros Während Dezellularisierung, Leber geworden Lucent, was die Entfernung von Z...

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Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Serie: Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU can reversibly block the conduction of peripheral nerves without damaging the nerves while using an appropriate ultrasonic parameter. Temporary and partial block of the action potentials of nerves shows that HIFU has the potential to be a useful clinical treatment for pain relief. This work demonstrates the procedures for suppressing the action potentials of neuropathic nerves in diabetic rats in vivo using an HIFU transducer. The first step is to generate adult male diabetic neuropathic rats by streptozotocin (STZ) injection. The second step is to evaluate the peripheral diabetic neuropathy in STZ-induced diabetic rats by an electronic von Frey probe and a hot plate. The final step is to record in vivo extracellular action potentials of the nerve exposed to HIFU sonication. The method showed here may benefit the study of ultrasound analgesic applications.

This work presents the methodology of applying high intensity-focused ultrasound to block the action potentials of diabetic neuropathic nerves.

Ein Ultraschall Werkzeug für die Nervenleitung blockieren in diabetischen Ratten Modelle

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...