Normotherme Ex-vivo-Lebermaschinenperfusion bei Mäusen. Die normotherme oxygenierte Leberperfusion ist eine vielversprechende Strategie zur Rettung marginaler Organe und wurde kürzlich in die klinische Praxis eingeführt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch nicht gut verstanden.
Ein Mausmodell wird benötigt, um die molekularen Signalwege weiter zu untersuchen, wobei genetisch veränderte Tiere, wie z.B. transgene Mäuse, genutzt werden, um auf die Etablierung eines normothermen sauerstoffhaltigen maschinellen Perfusionssystems für Mäuseleber zu warten. Hier ist ein Schema unseres gesamten Systems. Zunächst wird das gesamte System bei 37 Grad Celsius von einem thermostatischen Regler durch Wasserzirkulation gesteuert.
Das Perfusat wird aus dem Reservoir durch eine Peristaltikpumpe in einen Oxygenator gepumpt. Im Oxygenator befindet sich ein ununterbrochener Gasfluss von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Das Perfusat durchläuft dann eine Blasenfalle.
Das Perfusat mit Luftblasen wird unter Druck zurück in den Vorratsbehälter gepumpt. Das verbleibende Perfusat fließt in die Orgelkammer, wo der Schlauch mit der Pfortader verbunden ist. Das Perfusat wird aus der Leber durch den suprahepatischen Cava in die Organkammer abgeleitet.
Der Perfusatabfluss aus dem Orgelraum wird durch die Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet. Ein Gallendrainageschlauch ist mit der Orgelkammer verbunden, um die Galle aufzufangen. Das ist unser OP-Tisch.
Alle Operationen werden unter dem Mikroskop durchgeführt. Wir sorgen für halbsterile Betriebsbedingungen während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Halten Sie die französische Schlauchkanüle mit einer Pinzette fest.
Durchdringen Sie die Kanülenwand mit einer 30G-Nadel in einem Abstand von einem Zentimeter vom Ende der Kanüle. Schieben Sie die Nadel durch die Kanüle, bis die Nadelspitze sichtbar wird. Hier ist ein Vergleichsbild von 26G-Katheter und selbstgebauter Kanüle; Beide sind für die Mausportalkanülierung geeignet.
Bereiten Sie 25 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 2.500 internationalen Einheiten pro Milliliter vor und legen Sie die Spritze in einen Inkubator, der auf 40 Grad Celsius eingestellt ist. Hier sind die Hauptkomponenten des normothermen maschinellen Perfusionssystems ex vivo. Zu den Komponenten gehören hauptsächlich der Orgelraum, die Thermostatmaschine, die Rollenpumpe, der Oxygenator und das Reservoir.
Hier sehen Sie einen detaillierten Aufbau unseres Orgelraums. Grundsätzlich besteht es aus einem Orgelkammerkörper, einem Drucksensor, einem Wärmetauscher und einer Blasenfalle. Wir richten einen Perfusat-Einlass, einen Perfusat-Auslass und eine Gallenabflussöffnung ein.
Dies ist das ADI-Überwachungssystem, das wir zur Überwachung des Pfortaderdrucks verwenden. Das ADI-System besteht aus einem Drucksensor, einer zentralen Steuerung und Displays. Schalten Sie das LabChart-Programm für die Drucküberwachung ein.
Kalibrierung und Nullstellung sind vor jeder Verwendung des Drucksensors erforderlich. Verwenden Sie Null-Millimeter-Quecksilber und 20-Millimeter-Quecksilber als Markierungen, um den Drucksensor für die zweistufige Kalibrierung zu kalibrieren. Aufgrund der ständigen Überwachung des Portaldrucks können wir das Portal fluran entsprechend den Druckänderungen anpassen.
Bei gleichen Mengen an Perfusat für das Reservoir und die Orgelkammer zur Vorbereitung des Systems muss besonderes Augenmerk auf die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Füllprozesses gelegt werden. Verbinden Sie die Induktionskammer mit einer Steckdose. Drehen Sie den Sauerstoff auf 0,5 Liter pro Minute.
Verwandeln Sie Isofluran auf 3%Legen Sie das Tier in die Kammer, bis eine tiefe Betäubung erreicht ist. Verwenden Sie eine Mikrospritze, um eine an das Körpergewicht angepasste Dosis der Analgesie aufzutragen. Hier sieben Mikroliter Buprenorphin.
Jetzt beginnen wir mit der Operation. Machen Sie einen Querschnitt im Bauchbereich der Maus. Der Hautschnitt erstreckt sich beidseitig bis zur beidseitigen Fleischachsellinie.
Machen Sie vorsichtig einen Längsschnitt entlang der Linea alba. Durchtrennen Sie die Bauchmuskelschicht mit Elektrokoagulation und Schere. Legen Sie vorsichtig ein Stück nasse Gaze auf, um die Leber vor Elektrokoagulation zu schützen.
Legen Sie die Bauchhöhle der Maus vollständig frei. Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle, um den Hilus vollständig freizulegen. Hier ist ein schematisches Diagramm der Pfortaderkanülierung und Gallengangskanülierung dargestellt.
Grundsätzlich wählen wir die passende Kanüle entsprechend der Größe der Maus aus und verwenden für die Fixierung der Kanüle 6-0 Seidennaht. Befreien Sie den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette ohne Zähne. Der gemeinsame Gallengang wird sehr leicht beschädigt und bricht.
Sobald es bricht, kann es nicht mehr kanüliert werden. Durch die Richtung der anatomischen Position sind gebogene Pinzetten leichter zu bedienen. Legen Sie zwei 6-0 Seidenfadenschlaufe über den gemeinsamen Gallengang, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.
Durchstechen Sie den Gallengang vorsichtig mit einer 30G-Nadel. Verwenden Sie eine spitze, gebogene Pinzette, um die kleinen Löcher zu vergrößern, damit die Gallengangskanülierung gespeist werden kann. Verwenden Sie eine Gefäßkanülenzange über die Gallengangskanüle und schieben Sie sie in den Gallengang. Anmerkung.
Im Moment der Kanülierung werden Sie den Widerstand spüren, den die Galle mit sich bringt. Wenn die Kraft nicht gut kontrolliert wird, wird die Kanüle durch den Druck des Gallenabflusses aus den Gallenwegen gedrückt. Stellen Sie die Tiefe der Kanüle vorsichtig ein.
Wenn es zu tief ist, kann es den Gallengang beschädigen, und wenn es nicht tief genug ist, kann es herausrutschen. Der Gallenfluss in der Kanüle kann nach erfolgreicher Kanülierung beobachtet werden. Klemmen Sie die Pfortader mit einer flachen Pinzette ab und befreien Sie vorsichtig das Bindegewebe mit einer gebogenen Pinzette.
Ziehen Sie hier nicht zu stark, um ein Reißen der Pfortader zu vermeiden. Sobald die Pfortader beschädigt ist, ist es schwierig, die Pfortader zu kanulieren. Legen Sie zwei 6-0 Seidennahtschlaufe über die freie Pfortader.
Verwenden Sie eine arterielle Klammer, um die distale Pfortader zu verschließen. Punktieren Sie die Pfortader sehr vorsichtig mit einer der oben genannten Pfortaderkanülen. Der Blutfluss innerhalb der Kanüle ist nach einer erfolgreichen Punktion deutlich zu beobachten.
Nehmen Sie vorgewärmte Heparin-Kochsalzlösung aus dem Inkubator. Entfernen Sie alle Luftblasen. Befestigen Sie die Spritze mit der vorgewärmten heparinisierten Kochsalzlösung in der Spritzenpumpe.
Verbinden Sie den Verlängerungsschlauch der Spritzenpumpe mit der Kanüle der Pfortader. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf zwei Milliliter pro Minute ein und starten Sie die Leberspülung. Erhöhen Sie den Isoflurangehalt auf 5 % und euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation.
Beobachten Sie die Farbe der Leber am Ende des Spülvorgangs. Schneiden Sie die Leber heraus, sobald die Farbe ein homogenes Gelb angenommen hat. Übertragen Sie die Leber vorsichtig mit einer Petrischale in die Organkammer.
Bewahren Sie eine kleine Menge Kochsalzlösung in der Petrischale auf, um zu verhindern, dass eine Leber zerdrückt wird. Anmerkung. Pfortader und Gallengang können bei diesem Eingriff leicht verdreht werden, was die Leberdurchblutung und die Gallensammlung beeinträchtigen kann. Infundieren Sie mit einer Spritze langsam normale Kochsalzlösung in die Pfortaderkanüle, um die Luftblasen in der Kanüle zu entfernen.
Verbinden Sie die Pfortaderkanüle mit dem Perfusat-Abflussschlauch in der Orgelkammer. Die Gallengangskanüle der Maus wird durch ein Ventil der Organkammer geführt, das mit einer Gummikappe verschlossen wird. Dann wird der Gallenschlauch in ein vorbereitetes 0,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit einem kleinen Loch in der Elektrode eingeführt.
Nachdem alles angeschlossen ist, schalten Sie die Peristaltikpumpe ein. Überprüfen Sie den Pfortaderdruck, um die Durchflussrate anzupassen. Halten Sie den Pfortaderdruck zwischen sieben und 10 Millimeter Quecksilbersäule, indem Sie die Durchflussrate anpassen. Anmerkung.
Der Nenndurchfluss kann je nach Alter und Positionierung der Rohre leicht variieren. Dies ist die Auswahl des Perfusatmediums, des Perfusatvolumens und des Perfusionsdrucks auf der Grundlage einer Literaturaufarbeitung von normothermen sauerstoffhaltigen Rattenlebermaschinen-Perfusionsstudien. Dies ist ein Schritt-für-Schritt-Versuch zur Etablierung des Maus-Perfusionsmodells.
Es waren etwa 14 Experimente erforderlich, um die am besten geeigneten Katheter auszuwählen. In unseren Händen ist die Verwendung von zwei französischen Gummikathetern für die Pfortader zusammen mit einem französischen Gummikatheter für den Gallengang die beste Kombination, um eine homogene Perfusion mit allen Kathetern zu erreichen. pH-Wert und Kaliumspiegel waren während der 12-stündigen Perfusion stabil.
Der pH-Wert lag zwischen 7,26 und 7,71 und der Kaliumgehalt zwischen 5,9 und 6,8 Millimol pro Liter. Die HE-Färbung zeigt, dass nach 12 Stunden Perfusion die histologische Integrität der Mausleber relativ gut erhalten war. Zusammenfassend konnten wir hier die erfolgreiche Etablierung eines normothermen oxygenierten maschinellen Perfusionssystems für die Mausleber demonstrieren.
Die Perfusion einer Mausleber über 12 Stunden führte zu einer guten Erhaltung der Lebermorphologie, wenn auch nicht im gesamten Organ. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um eine vollständig homogene Perfusion über einen längeren Zeitraum zu erreichen. Sobald dies erreicht ist, kann der Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren in Betracht gezogen werden, wie z. B. der Einsatz von IL-2-Knockout-Mäusen, um die Rolle der Entzündung zu untersuchen.
