The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

1. Reinigung Zell Sonifier-System <ol><li> Reinigen Sie die Verbindung zwischen dem Horn und dem Wandler unter Verwendung von Chloroform und einem Tupfer aus Baumwolle. Tragen Sie eine dünne Öl oder Mineralöl auf das Gewinde des Horns und Konverter, um Ablagerungen von Metallspänen, Rost oder Oxidation weiter zu entfernen. </li><li> Verwenden Chloroform, um das Öl und andere Verunreinigungen aus der Union nach dem Wischen Sie die Gewinde mit Öl zu entfernen. </li></ol> 2. Zusammenbau des Zell Sonifier und Einrichten des Systems <ol><li> Bringen Sie die Hupe, um den Konverter. Richtig Drehmoment des Systems den montierten Wandler und das Horn aus der Becheranordnung durch Ziehen des Horns aus dem Boden der Schale (2A). Legen Sie einen Slot Schlüssel innerhalb einer der drei kleinen Öffnungen in der Nähe der Spitze des Wandlers (2B). Dann positionieren Sie einen Drehmomentschlüssel mit einem ½ Zoll Luft Fuß auf dem geschlitzten Teil des Horns (2B) ausgestattet. Ziehen Sie in standard Uhrzeigersinn, bis der Drehmomentmesser liest 54,23 N. m (2C), das Drehmoment durch den Hersteller 16 empfohlen. Den angezogen Wandler und Horn wieder in die Tasse, und montieren Sie die Hupe und Konverter, um einen Ring Stand in einer aufrechten Position. Bringen Sie den Konverter an das Netzteil, bevor Sie das System für die experimentelle Impuls Dosierung. </li><li> Stellen Sie das System für die Pulsdosierung mit 1 sec der Beschallung mit 1 s zwischen den Impulsen. Unterschiedlichen Dosierungs Modelle können für andere experimentelle Bedingungen verwendet werden. Viele Variablen, wie Wasservolumen und dem Horndurchmesser würde möglicherweise erfordern Änderungen an dieser Dosierung. Verwendung der vorgenannten Zellprobentypen, Volumen und Konzentration haben empirische Daten und Beobachtung der Formulierung dieser Dosierungsregime geführt. </li><li> Das System an der gewünschten Amplitude. In diesem Protokoll verwenden 33% und 50% Amplitude, um eine vollständige Zell-Zerstörung, die die Wirksamkeit sonosensit machen würde, zu verhindernstalter schwer oder gar nicht zu messen. HINWEIS: In dieser Studie wurden die Amplituden miteinander verglichen werden. </li></ol> 3. Bewertung Systemvoraussetzungen Intensität und Funktion <ol><li> Halten Sie die Kavitation Messer 1,5 cm, der die Höhe der Probe Beschallen ist. Beachten Sie die Messwerte in die Beurteilung der System bei einer erwarteten Intensität ausgeführt wird. Mit dem aktuellen System und Wasserstände, zwischen 100-110 W / cm 2 für 33% Amplitude und 115-125 W / cm 2 für 50% Amplitude erwartet. Beachten Sie die Kavitation Zählerstände aus dem Zähler-Display, das Kavitationsenergie in W / cm 2 direkt repräsentiert. Nehmen Sie diese Messwerte an der Oberfläche des Wassers, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen in das Gesicht des m-Sonde vorhanden sind. Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Verfahren ohne die Kappe für den Zugriff über das Horn getan. Sie brauchen nicht nach jeder Beschallung wiederholt werden. Vielmehr sollten sie nur nach der Reinigung, Zusammenbau und Einrichten des Systems durchgeführt werden. </li&gt; <li> Legen Sie das Hydrophon in einem Probengefäß mit 12,5 ml Wasser, um das Hydrophon-Sensor vollständig einzutauchen. Hängen Sie das Hydrophon mit dem Ringständer. </li><li> Befestigen Sie das Hydrophon an den Eingang des Oszilloskops, um die Wellenformeigenschaften zu bewerten. Untersuchen Sie das Oszilloskop für eine klare Sinuswelle, wie anomale Wellen können die Frequenz des Systems aus den Angaben des Herstellers zu verändern. Sowohl die Kavitation Meter Oszilloskop und geben einen Frequenzmesswert, sondern nur das Oszilloskop wird aberrant Wellen, die von guter fehlerhafte System oder unsachgemäße Montage sind zu zeigen. </li></ol> 4. Herstellung von Zellen und Medium <ol><li> Vorbereiten des Mediums unter Verwendung von 240 ml Iscove modifiziertem Dubecco-Medium (IMDM) und 50 ml fetalem Rinderserum. Auftauen nicht fötalem Rinderserum in einem heißen Wasserbad, da eine rasche Zunahme der Temperatur kann zu einem Kompromiss in Serumstabilität führen. 240 ul kombiniert Gentamicin 50 mg / ml und 5 ml Penicillin/ Streptomycin 100x in einer Standard-Kulturflasche, und fügen Sie dem Medium. Lagern Sie das Medium bei 4 ° C. </li><li> Samen U937 Zellen bei ~ 4 × 10 4 Zellen / ml in einem 25 cm 2 -Kolben unter Verwendung der hergestellten Mediums. Beurteilen Zellen für die Konzentration und die Lebensfähigkeit unter Verwendung eines Zellzählers TC20 und Trypanblau-Ausschluss, indem 15-20 ul Zellen und 15-20 ul Trypanblau in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Mischen des Inhalts. Pipette15-20 ul dieser Mischung in eine TC20 Probenahmerutsche, und initiieren zählt, indem Sie den Schieber in die TC20 Zellzähler. </li><li> Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2, und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypanblau-Ausschluss und die TC20 Zellzähler. Wenn die Zellen in einer geeigneten Konzentration und / oder die mit sonosensitizers für einen angemessenen Zeitraum, Transfer 3 ml von Zellen aus der Kulturflasche mit einer 20 ml Glasszintillationsröhrchen behandelt. In diesem Protokoll wachsen U937-Zellen für 48 Stunden und dann mit 0,5, 1 zu behandeln,oder 5 mM MeβCD 30 min ausreichend das Cholesterin, Zellen vor der Ultraschallbehandlung zum Abbau. </li></ol> 5. Zell Beschallung <ol><li> Degas entionisiertem destilliertem Wasser mit einem Staubsauger und Buchner-Kolben. Übertragen die Wasser der Schale Horn und füllen bis zu einem Niveau von 15 mm über der Oberseite des Horns. Beschallungsprozesses bewirkt eine weitere Entgasung des Wassers für eine Zeitdauer von wenigen Minuten und kann zu Inkonsistenzen im Laufe des Versuchs führen, wenn das System nicht laufen vor Beschallung abzutasten. Daher führen Sie das System für ca. 7 Min vor der Ultraschallbehandlung zu probieren. </li><li> Befestigen Sie die Szintillationsfläschchen mit den Zellen an der Haltevorrichtung. Befestigen Sie dann die Haltevorrichtung an der Oberseite der Schale Horn und auf eine Höhe von 15 mm von der Spitze des Horns (an der Wasseroberfläche mit Hilfe des Schiebemechanismus) eingestellt. </li><li> Die Zellen werden typischerweise mit Ultraschall behandelt unter Verwendung von drei 1 sec Impulse von Ultraschall mit 1 sec Abstand zwischen jedem dieser Impulse. DafürProtokoll Sonikat Zellen bei 33% und 50% Amplitude mit der oben genannten Stoßdosierung. </li></ol> 6. Die Beurteilung Cells für Schäden Post-Beschallung <ol><li> Beurteilen Sie die suspendierten Zellen auf Beschädigungen und die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau und das TC20 Zellzähler. Darüber hinaus analysieren die Probe unter Verwendung eines Zählers Z2. Für Z2 Zähler-Analyse, Pipette 100 ul Zellsuspension in 20 ml isotonischer Kochsalzlösung (200: 1-Verhältnis). Vor der Analyse, spülen Sie die Öffnung des Z2 Teilchenanalysator mindestens zweimal mit isotonischer Kochsalzlösung. Legen Sie die Z2 Probe in der Gegenhalter und die Plattform, um die Öffnung zu erhöhen vor Einleitung zählt. </li><li> Erwerben Sie die Daten aus den TC20 und Z2-Zähler unter Verwendung von Software, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Analysieren dieser Daten für eine Zellschädigung, die Lebensfähigkeit und die Schaffung von Zelltrümmern von Beschallung. </li></ol> 7. XTT Assay zur Zelllebensfähigkeit ermitteln und mitochondriale Aktivität der behandelten U937 und THP1 Cells <ol><li> Prior den XTT-Assays wachsen U937 und THP1-Zellen unter den gleichen Bedingungen. Vorzubehandeln Zellen mit dem gleichen Konzentrationsbereich von MeβCD für 30 min vor der Ultraschallbehandlung. Verwenden Sie dieselben Ultraschallparameter wie zuvor, außer dass Zellen werden jetzt mit einer Reihe von 1-3 sec ein Impulse beschallt Abstand einer Sekunde auseinander, um eine Reihe von Schäden für die XTT-Kit zu beurteilen, zu entwickeln. Hinweis: Viele dieser Schritte werden direkt aus dem Kit Handbuch XTT genommen und werden nur für die Bequemlichkeit der interessierten Laboratorien wiederholt. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 10 min. Resuspendieren Zellpellet in Wachstumsmedium zuvor beschrieben. Die Zellen bei ~ 1 x 10 5 Zellen / ml. Seed U937-Zellen mit 100 ul pro Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Mikrotiterplatte in dreifacher Ausfertigung, und wiederholen Sie dann für THP1 Zellen mit einem separaten 96-Well-Platte. Zählen 3 Kontrollvertiefungen, die 100 &amp; mgr; l von kompletten Wachstumsmedium allein als leere Absorptionswerte. Dann bebrüten die beimpften Platten für 24 Std. </li><li> Abzutauen zwei Aliquots des XTT-Reagenz und dem Aktivierungsreagenz bei 37 ° C vor der Verwendung. Swirl Teilmengen vorsichtig, bis klare Lösungen erhalten. 0,1 ml des Aktivierungsreagenz bis 5,0 ml der XTT-Reagenz, das ausreichend aktiviert XTT-Lösung für eine 96-well Mikrotiterplatte Assay bildet. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Platte. </li><li> Dann werden 50 ul der Aktiv XTT Lösung in jede Kammer. Gibt die Platte an der Zellkultur CO 2 Inkubator für 2 Std. Schütteln Sie die Platte vorsichtig nach der Inkubationszeit zu verteilen die orange Farbe in den positiven Vertiefungen. Die Extinktion der Testvertiefungen mit den Zellen und den leeren Hintergrund Kontrollvertiefungen bei einer Wellenlänge zwischen 450 bis 500 nm Wellenlänge mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät. </li><li> Entweder Null die Mikrotiterplatten-Lesegerät mit den leeren Kontrollvertiefungen oder subtrahieren ihr Mittelwert aus den spezifischen Ergebnisse. Die Absorption aller Testvertiefungen wieder auf einem wavelength zwischen 630-690 nm und subtrahieren Sie die Werte aus den 450-500 nm erhalten Werte. Hinweis: Diese zweite Absorptionsbestimmung hilft dabei, nicht-spezifische Messwerte von den Testergebnissen. Das XTT-Assay wurde viermal für beide Zelllinien wiederholt. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie besonders vorsichtig, sorgfältig zu positionieren, die Probe und reinigen Sie die Konverter-horn Union. Das Platzieren des Musters in dem Horn ist wichtig für den Erhalt von konsistenten Zellzerstörung als Veränderung des Abstands von der Hupe des akustischen Brennpunkten zu ändern, und deshalb verändern die Energie, die der Probe ausgesetzt ist. Die akustische Energie innerhalb des Bechers Horn kann mit der Kavitation Messer, um die Position der maximalen Kavitation finden abgebildet werden. Darüber hinaus sind die Kavitation Messer zusammen mit dem Oszilloskop von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der Schallintensität der Zellen, die zu belichtende sowie die Homogenität der Wellenform. Deshalb sollten diese Instrumente verwendet werden, um Probleme mit dem System zu erfassen, und um festzustellen, was zur Fehlerbehebung benötigt werden, um Systeminstabilität zu korrigieren werden. Wie bereits erwähnt, kann die Niederfrequenzsystem zur weiteren Entgasung während des Experiments, wenn nicht für das Wasser laufen zu handelnEinige Minuten vor der Ultraschallbehandlung zu probieren. Dieser Initiallauf durchgeführt werden muss, um eine relativ entgast Beschallung Medium und damit konsistente Ergebnisse bei Versuchen ergeben. Zusätzlich können Zellen, sollte nicht bei oder nahe der maximalen Amplitude bei der Beurteilung der Wirksamkeit von sonosensitizers, da das wahre Ausmaß der Sensibilisierung wäre schwierig zu beurteilen, beschallt werden. Verwenden von 33% Amplitude auf der 40 kHz-System ist ein idealer Ort, da es bemerkenswerte Schäden produziert, aber bietet sonosensitizers reichlich Platz, um ihre Wirksamkeit zu demonstrieren, wie mit MeβCD gegen U937 und THP1 Zellen (Abbildung 7) gezeigt. Diese Daten bestätigen, dass MeβCD sensibilisiert mehrere Leukämie Leitungen Niederfrequenz-Ultraschall in einer dosisabhängigen Weise. Es wurden eine Reihe von Experimenten mit einer höheren Frequenz im Bereich von 0,75 MHz bis 8 MHz die Anzeichen von Intra Kavitationsblasen geführt wird durch Beschallung 17-19 erzeugt. Allerdings questions immer noch in Bezug auf die genaue Mechanismus der Ultraschall-induzierte Zelllyse 18 verbleiben. Wir haben einen Zusammenhang zwischen Wirbel das Zytoskelett gezeigt und unter Verwendung niederfrequenter Ultraschall 15, ein Phänomen, das von anderen Laboratorien 20 zeigten erhöhte Schallempfindlichkeit 21. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Mikrofilament-stören Mittel wie Cytochalasin B potenzieren Ultraschallempfindlichkeit in mehreren Leukämie Linien, aber nicht hHSCs oder Leukozyten 22, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Aktin-Polymerisation kann ein sonosensitizing Mechanismus von besonderem Interesse sein. Wir haben auch beobachtet, dass Vincristin, ein Mikrotubuli-unterbrechenden Substanzen, die Tubulin-Polymerisation 23, 24 verhindert, deutlich erhöht die Ultraschallempfindlichkeit verschiedener Leukämietypen in vitro einschließlich akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie und akute lymphatische Leukämie. Dagegen Zytoskelett-gerichtete Mittel, die Zytoskelett-Komponenten zu stabilisieren (Paclitaxel eind Jasplakinolid) erscheinen Zellen resistent gegenüber Ultraschallbehandlung, durch niedrigere Zelllyse 22 reflektiert zu machen. Zusammengenommen zeigen diese Daten die Hypothese, dass die Komponenten des Cytoskeletts von neoplastischen Zellen Fluidisierung ist in der Tat ein wichtiger Faktor bei der Erhöhung der Wirksamkeit von SDT 25. Die vorliegende Studie zeigt auch, dass Cholesterinabbau kann ein anderes Verfahren, mit dem weiteren potenzieren die Ultraschall Empfindlichkeit neoplastischer Zellen, wie MeβCD behandelten U937 Zellen merklich zu 40 kHz Ultraschall sensibilisiert werden. Während unsere Beschallung Protokolle deutliche antineoplastische Aktivität in vitro gezeigt, wird die aktuelle Methode auf die Verwendung in der Kultur und kleinen Wirbeltiermodelle, die in der Lage, in den für die Beschallung verwendeten Phiolen passen zu arbeiten. Wir haben gezeigt, daß Zebrafisch kann sicher mittels gepulster niederfrequenter Ultraschall (20 kHz) mit Ultraschall behandelt werden gezeigt, und dass ihre Toleranz gegenüber Chemotherapeutika sind quantitativ vergleichbarDosen von murinen Modellen 26 toleriert, was darauf hindeutet, dass die Tumor-tragenden Zebrafisch in vorläufigen Untersuchungen verwendet, um die in vivo antineoplastische Aktivität dieser Protokolle zu beurteilen. Dennoch Verabreichung chemotherapeutische Mittel vor dem Beschallen von Säugetiermodellen hat im MHz-Bereich 1 berichtet worden, und solche Protokolle können wahrscheinlich erweitert niederfrequenter Ultraschall, sowie Cholesterin-abbauenden und Zytoskelett-gerichtete Mittel einzuarbeiten. Potentielle klinische Anwendungen dieser Form kann es sich um SDT extrakorporalen Blut Beschallung in dem antineoplastischen Mittel werden intravenös (iv) vor dem Blut, die für Ultraschallbehandlung 25 entfernt. Diese Methode entfernt potenziellen Lärmschutzwände durch die menschliche Anatomie gestellt und kann ein wirksames Mittel, um Leukämiezellen sowie Metastasen von soliden Tumoren zu beschädigen. Es ist auch möglich, dass Cholesterin abbauenden und Zytoskelett gerichtete Agenten könntenin HIFU-Protokolle, die bereits in der Klinik, in einem Versuch, um die Wirksamkeit dieser Behandlungsmodalität verbessern sucht werden, verwendet werden. Die in der vorliegenden Studie beschriebenen Verfahren sind in der Lage, der Bewertung von potenziellen sonosensitizers und weitere System Verfeinerung kann dieses Dienstprogramm zu verbessern. Allerdings gibt es viele Variablen, um bei der Verwendung solcher Ultraschall entwirft, einschließlich Stromversorgungsqualität, Akustik Brennpunkte, und individuelle Unterschiede zwischen den Wandlern zu berücksichtigen. Daher wird die zukünftige Forschung auf die Visualisierung der Schallwellen und das Verständnis ihres Einflusses auf Ergebnisse zu konzentrieren. SDT gezeigt Zelllyse in vitro zu verbessern und kann sich als klinisch brauchbare wenn mehr in-vivo-Daten in Säugermodellen erfasst werden zu können. Experimenten, die andere potenziell nutzbaren Eigenschaften von malignen Zellen, sowie verschiedene kombinierte Modalitäten mit mehreren Agenten und Ultraschall weiter in unserem Labor.

Ultraschall bezieht sich auf jedes oszillierende Schalldruckwelle mit einer Frequenz von mehr als der oberen Grenze des menschlichen Gehörs Kapazitäten (~ 20 kHz) 1. Niederfrequenz-Ultraschall im 20-60 kHz-Bereich wurde im Labor als Mittel zur Erzeugung von Emulsionen, die Vorbereitung Zellproben für die Nukleinsäureextraktion, zur Gewebezerstörung genutzt worden sind, und für eine Vielzahl von anderen Tests. Die Nützlichkeit von niederfrequentem Ultraschall wurde auch zur industriellen Umgebung zum Schweißen erweitert, Reinigen verschiedener Materialien und der Materialverarbeitung. Im Handel erhältliche Ultraschallgeneratoren kommen Frequenzen im Bereich von 18 bis 60 kHz, und Full-Scale-Wattagen von 100-1,200 W. Obwohl Ultraschall ist seit langem in der klinischen Einstellung für die diagnostische Bildgebung verwendet wurden, wurde es als ein therapeutisches Mittel erst kürzlich angewendet. Ultraschall ≥1 MHz ist in der Lage sicher zu stören Harnsteinen (Nierensteine) und Gallensteine ​​(Steine ​​in the Gallenblase oder in der Leber) in Patienten, um die Symptome zu 2,3 zu reduzieren. Dieser Ansatz als extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL) bekannt, ist nun weit verbreitet in der Klinik (mehr als eine Million Patienten werden jährlich mit ESWL in den Vereinigten Staaten allein 4 behandelt) aufgebracht wird, und bietet eine Modalität, durch die nicht-invasiv brechen Kalküle mit minimalen Kollateralschaden durch die Verwendung von extern angelegten, fokussiert, Hochintensitätsschallimpulse 2-4. Aufgrund der einzigartigen direkten Scherkräfte sowie Kavitationsblasen durch hochintensiven Ultraschall erzeugt wird, haben diese Methoden in der Krebstherapie für die Behandlung von kastrationsresistentem Prostatakarzinom und Adenokarzinom des Pankreas in einem Ansatz als hoher Intensität bekannt sucht fokussierter Ultraschall (HIFU ) 5-8. In einer sehr ähnlichen Weise ESWL verwendet HIFU mehreren Ultraschallstrahlen und fokussiert sie auf eine ausgewählte Fokusbereich auf Temperaturen von 60 ° C oder hig erzeugensie durch die Verwendung von Schallenergie und induziert Koagulationsnekrose in dem Zielgewebe 5. Obwohl auch andere Modalitäten der thermischen Ablation gibt es derzeit (Radiofrequenz-Ablation und Mikrowelle Ablation) bietet HIFU einen deutlichen Vorteil gegenüber diesen Verfahren, dass es das einzige nicht-invasive Hyperthermie Modalität 5. HIFU hat gemischte Ergebnisse in die Klinik erreicht und ist derzeit nur in klinischen Studien 8-11 zur Verfügung. Nichtsdestotrotz haben die begrenzten Erfolg erreicht hat, und die sehr vielversprechend in präklinischen Säugetiermodelle erworben vivo-Daten das Potenzial von Ultraschall in der Krebstherapie gezeigt. In dem Bemühen, HIFU verbessern, haben Forscher versucht, Ultraschall mit geeigneten antineoplastische Mittel zu kombinieren, um eine Form der sonochemotherapy generieren. Sonodynamischen Therapie (SDT) ist eine vielversprechende neue Behandlungsmethode, die beeindruckende antineoplastische Aktivität in in vitro und gezeigt hat, <em&gt; In vivo-Studien 1. Es hat sich gezeigt, dass Ultraschall bevorzugt Schäden malignen Zellen basierend auf der Größe Differenz zwischen solchen Zellen und denen der normale Histologie 1,5. SDT enthält spezielle Wirkstoffe wie sonosensitizers um das Ausmaß der durch Ultraschall gegen Tumorzellen ausgeübt Vorzugs Schäden erhöhen bekannt. Während therapeutische Anwendungen von SDT wurden zuvor untersucht worden, Ultraschallsystemen verwenden typischerweise höhere Frequenz Ultraschall (≥1 MHz), und die Auswirkungen der niedrigen kHz Frequenzultraschall ist noch nicht vollständig erforscht. Niedrigere Frequenzen von Ultraschall sind oft auf die Herstellung Inertial Kavitation, ein Phänomen, das in der Zerstörung von Zellen führt zu mehr beherrschen aufgrund der schnellen Kollabieren der Mikrobläschen, induzieren physikalisch Schaden 12-14. Dieser Unterschied in der Erzeugung des Inertial Kavitation zwischen MHz und niedriger kHz Ultraschall hat, dass untere Wellenfrequenzen ermöglichen Mikroblasen zugeschriebens mehr Zeit, um durch gleichgerichtete Diffusion in den Ausbau Halbzyklus während der folgenden Kompressionshalbwelle 12 wachsen, damit die Herstellung heftiger Zusammenbrüche. Wir haben zuvor gezeigt, dass U937 humanen monozytären Leukämie-Zellen empfindlich gegenüber niederfrequenten Ultraschall (23,5 kHz) ist, und dass diese Empfindlichkeit kann deutlich durch die Anwendung von antineoplastischen Mitteln, die das Zytoskelett 15 stören erhöht werden. Ferner haben wir gezeigt, dass Zellen beschädigt werden vorzugsweise anhand von Größe, mit größeren Zellen, die eine höhere Ultraschallempfindlichkeit. Außerdem sind normale menschliche hämatopoetische Stammzellen (hHSCs) und Leukozyten bei vergleichbaren Zellgrößen wesentlich beständiger gegen Beschallung als ihre Pendants neoplastischen 15 vorläufig darauf hindeutet, dass Niederfrequenz-Ultraschall kann verwendet werden, um bösartige Zellen zu beschädigen bevorzugt in Gegenwart von normalem Gewebe. Zur weiteren Untersuchung der einzigartigen propschaften von Niederfrequenz-Ultraschall für mögliche therapeutische Anwendung haben wir Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren entwickelt, um die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit einer unserer aktuellen Beschallungssystemen zu erhöhen, die Branson Modell SLPE 150 W, 40 kHz Zellaufschlussgerät, mit einem 20 mm Horn ausgestattet ausgestattet in einen 7,62 cm Tasse. Darüber hinaus haben wir in der Lage, genaue Proben Kavitation Energien sowie konsequente Wellenformen und Amplituden innerhalb der 40 kHz-Bereich mit einer Kavitation Meter und Oszilloskop mit Hydrophon zu bestimmen. Durch Raffination und Systematisierung unserer Protokolle, konnten wir die Konsistenz in unsere experimentellen sonications etablieren, so dass wir quantitativ vergleichen die sonic Empfindlichkeit von Tumorzellen und normalen Zellen verschiedener histogenetischen Abstammungslinien. Unser Protokoll für die 40 kHz-System wird in umfangreichen Detail, um für interessierte Laboratorien der Lage ist, vergleichbare Experimente zu sein und unsere Ergebnisse der antineoplastischen Wirkungen durch ausgelöst bewerten vorgestelltNiederfrequenz-Ultraschall. Außerdem prüfen wir die dosisabhängige Wirkung von Methyl-β-Cyclodextrin (MeβCD; Abbildung 1), einen Cholesterin-abbauende Mittel, auf die Erhöhung der Empfindlichkeit des Ultraschall U937 und THP1 menschliche monozytäre Leukämie-Zellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium w/ NaHCO3 &#38; 25mM Hepes&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3&#34; (25mm) Cuphorn</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>101-063-726</td>
			<td>sonication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater</td>
			<td>Brisk Heat</td>
			<td>SDCJF1A-GBH1000-1</td>
			<td>heater used for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&#174; Software</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL &#38; 25mL Vented Culture Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>&#160;A35473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuJet Pro Auto Pipet&#160;</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1840, 1126-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100uL Micropipette&#160;</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000uL Micropipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tektronix&#160; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO2002B</td>
			<td>used to measure the ultrasonic waveform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td>
			<td>PPB Megasonics</td>
			<td>PB-500&#160;</td>
			<td>used to assess the sound intensity in W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td>
			<td>Teledyne</td>
			<td>TC4013-1&#160;</td>
			<td>connects to the oscilloscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 250mL Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z364827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Glass Scintillation Vials&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>diluent for Z2 counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-1011K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplate Reader</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>&#160;EW-13055-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL&#173;1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

Ausfallsicherheit ist von größter Bedeutung bei der Beschaffung wiederholbare und zuverlässige Ergebnisse. Das korrekte Drehmoment Spezifikation 54.23 N. M erreicht richtige Kopplung des Wandlers und Sonotrode 2, wobei die Konsistenz der Wellenform durch die Verwendung eines Oszilloskops und Hydrophon (3A) beurteilt. 3B zeigt Messungen in der Probenampulle und 3C bewertet Stabilitäts innerhalb der Schale Horn. Wie erwartet, wurde die Amplitude etwas reduziert aufgrund einiger Energie durch das Glas absorbiert wird. Jedoch wurde die Wellenform nicht gestört oder in beiden Panel B oder C, die für eine zuverlässige Lieferung von Ultraschallenergie zu der Probe erforderlich ist, verzerrt. Eine Wellenform, die nicht als eine klare Singular Sinuswelle scheint zeigt eine fehlerhafte Wandler oder unsachgemäße Installation. Dies ist in Figur 3D der mehrere aberrant Wellen zeigt, klarer Abwesenheit einer Sinuswelle ausgedrückt, und eine Frequenz Lesung Nrt mit einem ordnungsgemäß funktionierenden System zu erwarten. Kavitation Zählwerk die Kavitationsenergie erzeugt (Figur 4) zu messen fanden die Schallintensität auf 100-110 W / cm 2 bei 33% Amplitude und 125-130 W / cm 2 bei 50% Amplitude. Sobald die 40 kHz-System wurde entsprechend kalibriert und in ihrer Gesamtheit (5) zusammengebaut wurde zuverlässige Zellzerstörung leicht erreicht, da sowohl von den TC20 und Z2-Zähler (6) bestimmt. Wie erwartet, wurde umfangreicheren Zellschäden in Zellpopulationen, auf 50% mit Ultraschall behandelt, anstatt bei 33% Amplitude beobachtet. Nichtsdestotrotz ist 33% Amplitude, die als Ausgangspunkt für potenzielle sonic sensibilisierende Wirkung der verabreichten Mittel zu erfassen, wie es sichtbare Schäden erzeugt, sondern lässt Raum für weitere Schäden festgestellt, wenn Mittel werden angewendet, um ihre Potenzierung der Ultraschallempfindlichkeit zu bewerten. Dies ist in 7A gezeigt, wo dasdosisabhängige Wirkung von MeβCD auf Potenzierung der Ultraschallempfindlichkeit von U937-Zellen präsentiert werden. Obwohl nicht-beschallte MeβCD behandelten Zellen wurden in Fähigkeit sehr ähnlich zu nicht-beschallte, unbehandelte Zellen, die Tragfähigkeit deutlich sank, nachdem drei Impulse von 1 s 40 kHz Ultraschall angewendet wurde. Darüber hinaus scheint die Abnahme der Lebensfähigkeit nach Beschallung dosisabhängig sein können, wie 5 mM MeβCD erzeugt das größte Abfall der Zellzahl, gefolgt von 1 mM, und 0,5 mM MeβCD. Ähnliche Wirkungen auf die Zelllebensfähigkeit und mitochondriale Aktivität wurden in beiden U937 und THP1-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an MeβCD vor Beschallung behandelt wurden, wie mit dem XTT-Kit (7B) beurteilt beobachtet. Obwohl THP1 Zellen zu sein scheinen etwas Schall resistenter als U937-Zellen werden beide menschlichen Leukämie-Linien in einer dosisabhängigen Art und Weise beschädigt wird. Höhere Konzentrationen von MeβCD und mehr Impulse von Ultraschall produced die niedrigste Reduktion von XTT zu einem löslichen, bunten Orangen derivative sowohl U937 und THP1 Zellen, was die Lebensfähigkeit der Zellen und mitochondriale Aktivität zu senken. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> Abbildung 1. Molekülstruktur methyl- β-Cyclodextrin ist. (A) vollständige Struktur methyl-β-Cyclodextrin (MeβCD). (B) ein Polymer ist MeβCD sieben Wiederholungseinheiten mit einer Gruppe R entweder für H oder CH 3 ist. Molekülformel: C 56 H 98 O 35. Molekulargewicht = 1331,36. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> Abbildung 2. Richtig Anziehhülse die 40 kHz-Ultraschallsystem. (A) Die Hupe und Wandler werden aus der Tasse pri entferntoder Anziehhülse. (B) Positionieren Sie den Schlitzschraubenschlüssel und Drehmomentschlüssel auf ihren jeweiligen Positionen. (C) Anwenden 54,23 N. M des Drehmoments im Uhrzeigersinn vor Wiederanbringen des Horns und Wandler in den Becher. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verwendung eines Oszilloskops, um die Wellenform des Ultraschallsystems zu charakterisieren. (A) Ein Oszilloskop mit Hydrophon kann zur Amplitude und Wellenform Konsistenz zu bewerten. (B) Eine Aufnahme mit der Tasse direkt über dem Horn bei 1,5 cm entnommen und bei 33% Amplitude eingestellt. (C) Die Wellenform hier dargestellt wird, aus der Lektüre erworben, wenn das Hydrophon in der 20 ml Glasszintillationsröhrchen platziert. Das Fläschchen wird bei 1,5 cm über dem Horn positioniert und erneut bei 33% Amplitude eingestellt. (D) ein Oszilloskop Bildschirm ofa-System mit abweichenden Frequenzen, wie es bei einem fehlerhaften System oder unsachgemäße Kopplung der Hornwandler Union erwarten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> Abbildung 4. Verwendung einer Kavitation Messer, um die Schallintensität der Ultraschallsystem zu charakterisieren. Die Kavitation meter hier gesehen wird verwendet, um Kavitation Energie in W / cm 2 darstellen. Dies ist ein sehr wichtiges Instrument zur Bestimmung der Konsistenz von Energie mit Bezug auf die Probe. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> Abbildung 5: Die wichtigsten Komponenten des 40 kHz-Ultraschallsystem. Das Ultraschall-System wird komplett mit Schale Horn gezeigt ( <strong&gt; A), Heizvorrichtung (B), der Wandler (C) und der Probenpositionierungsmechanismus (D). Dieses Design erlaubt eine einfache Positionierung der Probe (E) oberhalb des Horns (F). <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> Abbildung 6. Effekte der verschiedenen Ebenen der Amplitude auf der Ultraschall-Lyse von U937-Zellen mit den TC20 und Z2 Zähler. Zellen wurden mit dem 40 kHz-Zelle Dismembrator bei 33% Amplitude (100-110 W / cm 2) bzw. 50% Amplitude (125-130 W / cm 2) unter Verwendung von drei 1 sec Impulse von Ultraschall beschallt, mit 1 sec Abstand zwischen jedem dieser Impulse. (A) Ein Screenshot von der Z2-Zähler-Software zeigt die Wirkung von Ultraschall auf U937-Zellen. (B) Die Daten der TC20 Zähler wurden in einem Graphen kompiliert, um die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses zu demonstrierens. Diese Daten gehören die Gesamt und Live-Zellzahlen, sowie die Trypanblau beurteilt die Lebensfähigkeit der Zellen. Bars spiegeln die Standardfehler des Mittelwertes (SEM) für 4 unabhängige Zellpopulationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> Abbildung 7 Auswirkungen von methyl- β-Cyclodextrin auf Potenzierung der Ultraschallempfindlichkeit von U937 und THP1-Zellen. (A) U937-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von MeβCD 30 Minuten, bevor sie mit 40 kHz Ultraschall (105 W / cm 2 beschallt behandelten ) mit drei 1 sec Impulsen im Abstand von 1 Sekunde auseinander. Zellpopulationen wurden in ≥12 ≥17 um und um gruppiert. (B) oder THP1 U937 Zellen wurden erneut mit unterschiedlichen concent behandeltRationen MeβCD 30 Minuten, bevor es mit dem 40 kHz-System unter Verwendung von 1-3 Impulsen von 1 sec Ultraschall beschallt im Abstand von 1 Sekunde auseinander. Die Lebensfähigkeit der Zellen und Mitochondrien-Aktivität wurden mit dem XTT-Kit bewertet. 100 ul Zellen wurden pro Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Mikrotiterplatte ausgesät. Die Platte wurde 24 h vor der Zugabe von XTT-Lösung inkubiert. Zellen wurden dann für weitere 2 Stunden inkubiert, bevor die Wellenlänge gelesen wurde. Bars spiegeln SEM für 4 unabhängige Zellpopulationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

Generation und quantitative Analyse der Pulsed niederfrequenter Ultraschall, um die Sensitivität der Sonic Unbehandelte ermitteln und behandelten Tumorzellen

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Aufrufe.  Syracuse University. Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells. 

Serie: Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Forschung

Medizin

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Fetale Echokardiographie und Pulsed-Wave-Doppler-Ultraschall in einem Kaninchen-Modell von Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI-Analyse zur Bewertung des dynamischen Knochenumsatzes bei Patienten mit facetogenen Rückenschmerzen

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...