Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Zuschuss 088.419 in MDB und Sponsoring von Smith &amp; Nephew UK Ltd unterstützt

1. Beschichtung von Oberflächen mit Matrix-Ligand <ol><li> Ultraschall wird, um Zellen in 3,5-cm Brunnen angelegt werden, entweder als einzelne Gerichte oder als 6-Well-Platte. Für biochemische Assays, Ligand Mantel direkt auf dem Kunststoff. Für Immunfluoreszenz, Deckgläser aufkochen Glas dreimal in MilliQ Wasser und Platz 4 Deckgläser in den Boden jeder Vertiefung. </li><li> Glasflächen müssen derivatisiert werden, um eine effiziente Liganden Beschichtung zu gewährleisten. Man löst Sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide Ester in PBS mit 1 mM. 2 ml in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der derivatisierten Oberflächen 3-mal mit PBS. </li><li> Coat derivatisiert entweder Glas oder Kunststoff mit unbehandelten Integrin-Liganden. Auftragen von 2 ml 10 ug / ml Integrin ligand9, in PBS mit Ca 2 + und Mg 2 + gelöst, so dass jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht </li><li> Planen monopartikuläre BSA durch Erwärmen von 1% BSA in PBS gelöst, auf 85 ° C für 13 Minuten. Erlaubenabkühlen lassen und dann durch ein 0,45-um-Filter. </li><li> Waschen Liganden-beschichteten Oberflächen 3 mal mit PBS und mit dem Block monopartikulären BSA für 30 Minuten. </li></ol> 2. Herstellung von Zellen <ol><li> Um die Umgebung der Matrix während des Experiments zu steuern, sollte die Proteinsynthese durch Zugabe von 25 ug / ml Cycloheximid zu 80% konfluent Fibroblasten für 2 Stunden blockiert. </li><li> Spülen Cycloheximid-behandelten Zellen mit PBS und lösen sich vom Kulturgefäß unter Verwendung von 0,5 mg / ml Trypsin / EDTA. </li><li> Ernte abgelösten Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 Minuten. </li><li> Die Zellen in DMEM/25 mM HEPES, 25 ug / ml Cycloheximid. </li><li> Anzahl Zelldichte der Suspension unter Verwendung eines Hämozytometers und mit Wasser auf 105 ml-1. </li><li> Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 20 Minuten an die Oberfläche Integrin erholen. </li><li> Spülen Sie die Liganden-beschichteten, BSA-blockierten Vertiefungen 3mal mit PBS. </li><li> Seed 2 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung. </li><li> Allow Zellen für 2 Stunden bei 37 ° C verteilt, 5% CO 2. </li></ol> 3. Ultraschall-Stimulation <ol><li> Warm die Ultraschall-Emitter-Array und Kopplungsgel auf 37 ° C </li><li> Tragen Sie eine erbsengroße Klecks Kopplungsgel zu jedem Emitter. </li><li> Testen Sie, dass jeder Sender ist funktional mit einem Ultraschall-Indikator Diodendetektor. </li><li> Legen Sie die Vertiefungen auf der Emitter-Array. Zurück Arrays auf 37 ° C, 5% CO 2 und damit sich das Wasser für 10 min lang sich ausgleichen. </li><li> Schalten Sie den Ultraschall-Signal. </li><li> Das Ultraschallsignal wird nach 20 Minuten deaktivieren, imitiert das therapeutische Regime. Wenn kürzere Zeiten Stimulation erforderlich sind, sollten Platten aus dem Array zu gegebener Zeit-Punkte entfernt werden. In allen Fällen verwenden Platten als negative Kontrolle unstimulierten. </li></ol> 4. Focal Adhesion Analyse durch Immunfluoreszenz <ol><li> Für die Analyse von fokalen Adhäsionen, gelten die 20-minütige Ultraschallsignalund dann die Entstehung von Strukturen, um für weitere 40 Minuten durch die Aufrechterhaltung Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 zu entwickeln. </li><li> Saugen Medien und zu fixieren Zellen durch Anwendung von 2 ml 4% Paraformaldehyd in PBS. Inkubieren für 14 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Paraformaldehyd und spülen dreimal mit PBS, die Anwendung des PBS sanft den Rand des Brunnens, die Erzeugung von Scherkräften zu vermeiden. </li><li> Übertragen jedes Deckglas von den 3,5 cm und einer 24-Well-Platte für die nachfolgende Immunfluoreszenzfärbung. </li><li> Quench restliche Paraformaldehyd durch Aufbringen von 0,5 ml 0,1 M Glycin in PBS in jede der 24 Vertiefungen. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Glycin absaugen und spülen Sie drei Mal mit PBS. </li><li> Permeabilisieren Zellen durch Aufbringen von 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Inkubieren für 4 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Aspirieren Triton X-100 und spülen Sie drei Mal mit PBS. </li><li> Sperren, indem 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Inkubieren über Nacht bei 4 &amp; dz. B., C. </li><li> Stain Vinculin-haltige fokalen Adhäsionen mit hVIN-1-Antikörper verdünnt 1:400 in BSA-Block. Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie dreimal mit PBS. </li><li> Anwenden Fluorophor (DyLight 488)-konjugierten sekundären Antikörper (1:200 verdünnt) und Fleck Aktin mit TRITC-Phalloidin (1:200 verdünnt) in BSA-Block. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen dreimal mit PBS und einmal mit Wasser. </li><li> Montieren auf einem Glasträger in einer umgekehrten Position mit Gold-Deckfluessigkeit verlängern. </li></ol> 5. Die Quantifizierung der Rac1-Aktivierung durch Pull-down-Assay <ol><li> Für die Analyse von Rac1 Aktivierung gelten die 20-minütige Ultraschallsignal an Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2. Bei der Beurteilung Reaktionszeiten länger als 20 Minuten, gelten die Ultraschallsignal für 20 Minuten und zu halten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für die verbleibende Zeit, damit die Reaktion zu entwickeln. </li><li> Aspirieren Medien und Ort guts auf dem Eis. Spülen Sie die Taschen mit 2 ml kaltem PBS und saugen. Stellen Sie sicher, restliches PBS wird durch Verlassen Brunnen für 1 Minute durch sorgfältige Aspiration gefolgt gekippt entfernt. </li><li> Lyse-Zellen auf Eis mit 35 ul Lysepuffer (10% Glycerin, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × gesamte Protease-Inhibitor) pro Vertiefung. In diesem Beispiel sind 6 Vertiefungen pro Zeitpunkt verwendet zu 210 ul Zelllysat zu erzeugen. Mehr oder weniger Quellen können verwendet werden, aber insgesamt Lysat Volumen sollte insgesamt ~ 200 pl. </li><li> Scrape Zellen gründlich mit Zellenabstreifer um vollständige Lyse der Zellen zu gewährleisten und zu verlassen Vertiefungen geneigt für 1 Minute, bis Lysat zu bündeln. </li><li> Das Lysat zu einer eiskalten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Pooling Lysaten aus gleichen Behandlungsregime) und drehen sich mit 21.000 × g für 2 Minuten bei 4 ° C bis Pellet Zelltrümmer. </li><li> Übertragen Sie 180 ul Lysat zu eiskalter 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 130 ul Lysepuffer und 25 ul PAK-glutathione Agarosekügelchen 10. Halten verbleibenden Rohlysat bei -20 ° C für die anschließende Gel-Trennung. </li><li> Erfassen aktiven Rac1 auf die PAK-Glutathion-Agarose-Kügelchen durch Drehen Röhrchen für 40 Minuten bei 4 ° C </li><li> Ernte Agarosekugel Konjugate durch Zentrifugation bei 2000 × g für 1 Minute bei 4 ° C </li><li> Wash Wulst Konjugate dreimal mit 500 ul Lysepuffer, Ernte Kügelchen durch Zentrifugieren bei 2000 x g und Verwerfen Überstand nach jedem Waschen. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Lyse Waschpuffer mit einer 200 ul Pipette. </li><li> Eluieren jede Probe durch Zugabe von 35 ul SDS-PAGE-Ladepuffer und inkubieren bei 85 ° C auf einem Schüttler Heizblock für 5 Minuten. Entfernen Kügelchen durch Zentrifugieren bei 21.000 × g für 1 Minute. </li><li> Auflösen Wulst Eluat durch SDS-PAGE, auf Nitrozellulose und Sonde für Rac1 übertragen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse In diesem Protokoll beschreiben wir die Induktion von Vinculin-Flecked fokalen Adhäsionen und Rac1-Aktivität durch Ultraschall. Für die focal adhesion Experiment ist die Ausgangssituation, dass Fibroblasten auf einem Liganden von α 5 β 1-Integrin zu verbreiten bilden keine Vinculin-haltige Verwachsungen (Abb. 3A), es sei denn eine zweite Fibronectinrezeptor, Syndecan-4, wird durch Zugabe von engagiert löslichen Liganden (3B) 3,4. Allerdings induziert Stimulation mit Ultraschall Mittelpunkt Adhäsionsbildung im gleichen Umfang wie der Eingriff Syndecan-4 (3C), was anzeigt, dass Ultraschall-Stimulation kann für bestimmte Komponenten des Fibronectin-abhängigen Signalweg 5 ersetzen. Der Schlüssel Hürde mit diesem Protokoll wird die Beseitigung fokalen Adhäsionen in der Abwesenheit von Stimulanzien. Unvollständige Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid ermöglicht Matrixablagerung, die ausreicht, damit die Zellen automatisch zu stimulieren. Die Überbelegung der Zellen kann auch auf Low-Level-focal adhesion formatio führenn und ein schlechtes Ansprechen auf Ultraschall als Übersprechen zwischen Zell-Zell-und Zell-Matrix Kontakte werden erschwert ein Experiment, das entworfen, um einen einzigen Reiz isolieren wird. Als Entwicklungspartner der Grund-Test zeigen wir das gleiche Experiment, mit Fibroblasten fehlen Syndecan-4 (Abb. 4) wiederholt. Diese Fibroblasten noch Ultraschall (4C) zu reagieren, aber nicht an Syndecan-4-Liganden (4B) zu reagieren. Das Experiment mit SDC4 - / - Fibroblasten zeigt, dass Ultraschall kann in der Tat umgehen die Notwendigkeit bestimmter Fibronectin-Rezeptoren, und zeigt, wie die einfache Protokoll entwickelt werden, um zusätzliche Informationen über den Signalweg zu gewinnen. Für die biochemische Experiment zeigen, dass Ultraschall Aktivierung von Rac1 zu induzieren, unter Verwendung eines Pull-Down-Assay, der eine Anpassung des Verfahrens von Del Pozo et al. 10 beschrieben ist. Niederschlag der aktiven Rac1 0, 10, 30 und 60 Minuten nach der inirenzierung von Ultraschall Stimulation zeigt, dass Rac1-Aktivität Peaks bei 10-30 Minuten, vor der Rückkehr zur Basislinie (Abb. 5). Blot Rohlysaten für Vinculin sorgt äquivalente Belastung zwischen den Zeitpunkten. Das Ergebnis ähnelt Aktivierung von Rac1 durch den Eingriff des Syndecan-4 3, ist aber etwas langwieriger sein als die Aktivierung durch Fibronektin. Deshalb 8-10 Wiederholungen werden in der Regel erforderlich, um aussagekräftige Daten zu erzielen. Die Aktivierung von Rac1 ist verantwortlich für die Verpflichtung von Zellen zu fokalen Adhäsionen, und im Entstehen begriffenen Fokaladhäsionen beginnen bei 10-30 Minuten bilden, zeitgleich mit Rac1-Aktivierung. Einmal in Gang gesetzt, wird die Adhäsionen weiterhin in die große Adhäsionsplaques in den 3 und 4 gezeigt reifen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Ultraschallwelle Form. Ultraschall umfasst eine intermittierende 1,5 MHz-Signal, dass aufgrund einer geringen Amplitude (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, hat räumliche Mittelwert, zeitlichen Durchschnitt) keine Heizung Wirkung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Workflow für die Vorbereitung und Stimulation der Zellen mit Ultraschall. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ultraschall Induktion der fokalen Adhäsionen in Fibroblasten. Fibroblasten wurden auf der Integrin-bindendes Fragment von Fibronectin (A) vor der Stimulation mit dem Syndecan-4-bindendes Fragment von Fibronectin (B) oder Ultraschall (C) verteilt sind. Nach 60 Minuten Stimulierung wurden die Zellen fixiert, gefärbt und Vinculin Actin und abgebildet durch Epifluoreszenz. Bar = 10 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ultraschall Induktion der fokalen Adhäsionen in Fibroblasten fehlen Syndecan-4. <em&gt; SDC4 - / - Fibroblasten wurden auf der Integrin-bindendes Fragment von Fibronectin (A) vor der Stimulation mit dem Syndecan-4-bindendes Fragment von Fibronectin (B) oder Ultraschall (C) verteilt sind. Nach 60 Minuten Stimulierung wurden die Zellen fixiert, gefärbt und Vinculin Actin und abgebildet durch Epifluoreszenz. Obwohl SDC4 - / - Fibroblasten wurden Fibronektin-und Kleinschreibung, Ultraschall noch fokale Adhäsionen induziert, was darauf hinweist, dass Ultraschall umgeht Matrix-Rezeptor-Engagement. Bar = 10 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Abbildung 5. Aktivierung von Rac1 durch Ultraschall. Die Zellen wurden 0, 10, 30 und 60 Minuten mit 6 Vertiefungen pro Zeitpunkt verwendet stimuliert. Die Menge an GTP-Rac1 in Proben von einem Rac1 Pull-down-Assay Zeitverlauf visualisiert wurde durch Inkubation mit Anti-Rac1 Antikörper auf einem Western-Blot (oberes Bild). Quantifizierung der Bandenintensität (durchschnittlich 8-10 Wiederholungen) zeigt eine erhöhte Rac1ctivity aus Ultraschall-Signal bei 10 und 30 Minuten, bevor sie wieder auf das Ausgangsniveau bei 60 Minuten (Grafik). Fehlerbalken stellen SEM

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

Andrew Harrison ist ein Mitarbeiter von Smith &amp; Nephew UK Limited.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode, mit der eine Behandlung, die normalerweise an menschliche Patienten angewendet wird in zellbasierten Experimenten verwendet werden kann. Das ultimative Ziel ist es, den molekularen Mechanismus der Ultraschall-Aktion zu verstehen, so dass die Therapie kann verfeinert werden. In diesem Protokoll verwenden wir embryonale Maus-Fibroblasten (MEFs) als Modell Zellsystem, aber Ultraschall wurde auch gefunden, dass in primären humanen Vorhautfibroblasten 5, mesenchymalen Stammzellen, Osteoblasten und Chondrozyten 6 wirksam. Wir verwenden Rac1 Aktivierung als Beispiel biochemischen Test, aber das Verfahren kann genutzt werden, ebenso zur Regulierung der Protein-Phosphorylierung oder Bildung von Proteinkomplexen durch Immunpräzipitation zu testen. Für die Immunfluoreszenz-Beispiel zeigen wir eine Wirkung Ultraschall auf fokale Adhäsionen, aber Umverteilung von jedem Molekül untersucht werden konnte. Zum Beispiel könnte man die Einstellung von cytosolische Faktoren zur Plasmamembran zu testen, kolokalisiert proteIns im Handel Bläschen oder untersuchen die Wirkung von Ultraschall auf Mitosespindel Organisation. Bisher haben wir beschränkten uns auf Fibronektin-abhängige Signalwege Prüfung, durch die Wirkung von Ultraschall auf Zellen auf Kollagen, oder in Gegenwart von Wachstumsfaktoren könnte getestet, um sich ein Bild davon, wie Ultraschall wirkt sich das Verhalten der Zelle in einem komplexen Umfeld, dass mehr ähnelt einer in vivo Situation. Eine größere Herausforderung wird sein, die Wirkung des Ultraschalls mit Zeitraffer-Imaging, wo die Anwesenheit des Senders die Blockierung der Lichtweg und Vibrationen aus den Ultraschall vorhanden zusätzliche technische Hindernisse zu testen. Allerdings schlägt die Tatsache, dass therapeutische Anwendung nur 20 Minuten der Stimulation pro Tag verlangt, dass Analyse des Verhaltens von Zellen nach einem Ausbruch von Stimulation kann durchaus produktiv sein.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Sulfo-m-Maleimidobenzoyl-N-Ester hydrosuccinimide </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 mM in Wasser gelöst Bestände können bei -20 ° C gelagert werden </td></tr><tr><td> 6-Well-Gewebekulturplatte </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Kunststoff aus anderen Unternehmen beschichten können schlecht </td></tr><tr><td> 13-mm Deckglas </td><td> Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Glas von anderen Unternehmen beschichten können schlecht </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K Integrin-Liganden (Fibronektinfragment) </td><td> Konstruieren und Beschreibung vorbereitung in 9, 11 </td><td></td><td> Alternative Matrix Liganden verwendet werden, um andere Wege zu verhören werden </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Kann als Lager 10mg/ml in Wasser gelagert werden </td></tr><tr><td> DMEM/25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraschall-Gel-Kopplung </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS Indikator </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-konjugierten Anti-Maus </td><td> Stratech Scientific </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-markierte Phalloidin &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Sie Gold-Reagenz antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> komplette Protease-Inhibitor (EDTA frei) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × tanken von Tablet gemacht bei -20 ° C gelagert </td></tr><tr><td> PAK-Glutathion-Agarose-Kügelchen </td><td> Konstruieren Beschreibung und Vorbereitung in 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Scientific </td><td> BI8181 </td><td> Machen 1M Aktien-und pH-Wert auf 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fischer </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

In vielzelligen Organismen, wird das Verhalten der Zelle durch die Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix bestimmt. Folgen der Matrix-Engagements reichen von Regulierung von Zellmigration und Proliferation, die Sekretion und sogar Differenzierung. Die Signale jeweils zugrunde liegt dieser komplexen Prozesse ergeben sich aus den molekularen Wechselwirkungen von extrazellulären Matrix-Rezeptoren auf der Oberfläche der Zelle. Integrine sind die prototypischen Rezeptoren und eine mechanische Verbindung zwischen extrazellulären Matrix und Zytoskelett, sowie die Einleitung einige der Haftung-abhängige Signalkaskade. Es wird jedoch immer offensichtlicher, dass zusätzliche Transmembranrezeptoren neben den Integrinen funktionieren, um sowohl das Integrin selbst und Signale stromabwärts zu regulieren. Die eleganteste dieser Beispiele ist die transmembrane Proteoglykan Syndecan-4, die mit α 5 β 1-Integrin kooperiert während der Adhäsion an Fibronectin. In-vivo-Modellen, Einzelhandelaß die Bedeutung der Syndecan-4-Signalisierung, wie Syndecan-4-Knockout-Mäusen Heilung Retardierung aufgrund ineffizienter Fibroblastenmigration 1,2 aufweisen. In Wildtyp-Tieren, wird die Migration von Fibroblasten in Richtung einer Wunde durch das Auftreten von Fibronektin, dass Lecks aus beschädigten Kapillaren und durch Makrophagen in verletztem Gewebe abgelagert wird ausgelöst. Daher besteht ein großes Interesse an der Entdeckung Strategien, die Fibronektin-abhängige Signalgebung verbessern und könnte Reparaturprozesse beschleunigen. Die Integrin-vermittelten und Syndecan-4-vermittelte Komponenten Fibronectin-abhängige Signalgebung durch Stimulieren von Zellen mit rekombinanten Fibronektinfragmenten getrennt werden. Obwohl Integrin-Engagement ist wichtig für Zell-Adhäsion, werden bestimmte Fibronektin-abhängige Signale von Syndecan-4 reguliert. Syndecan-4 aktiviert den Rac1 vorstehenden Signal 3, bewirkt Integrin Umverteilung 1, Trigger Einstellung von Zytoskelett-Moleküle, wie Vinculin, um fokaleVerwachsungen 4, und führt somit zu gerichtete Migration 3. Wir haben für alternative Strategien zur Aktivierung von solchen Signalen gesucht und gefunden, dass niedriger Intensität gepulster Ultraschall (Lipuš) können die Wirkung von Syndecan-4 Verlobung 5 imitieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode, durch die 30 mW / cm 2, 1,5 MHz Ultraschall, bei 1 kHz (Abb. 1) gepulst, um Fibroblasten in Kultur (Abb. 2) angewendet werden können, um Rac1 Aktivierung und fokale Adhäsion zu induzieren. Ultraschall Stimulation für höchstens 20 Minuten angelegt, da diese Kombination von Parametern gefunden wurde, am wirksamsten für die Beschleunigung der klinischen Frakturheilung 6. Die Methode verwendet, um rekombinante Fibronektin-Fragmente α 5 β 1-Integrin, ohne Engagement von Syndecan-4 zu engagieren, und erfordert die Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid zur Ablagerung von zusätzlichen Matrix durch die Fibroblasten zu blockieren., Die positive Wirkung of Ultraschall auf Reparaturmechanismen ist gut dokumentiert, 7,8, und durch das Verständnis der molekularen Wirkung von Ultraschall in der Kultur sollten wir fähig sein, um die therapeutische Technik zu verfeinern, um die klinischen Ergebnisse verbessern.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound at JoVE.com

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Dieses Protokoll beschreibt die Stimulation der kultivierten Fibroblasten mit geringer Intensität gepulster Ultraschall, die privilegierte Adhäsionsbildung und Rac1 Aktivierung durch Nachahmen Eingriff des Transmembran-Rezeptor-Matrix, Syndecan-4 antreibt. Dieser Ansatz erlaubt die Untersuchung einer erfolgreichen klinischen Technik auf zellulärer Ebene, wodurch Möglichkeiten für die Verfeinerung der Therapie.

Die Induktion von Adhäsions-abhängigen Signale mit geringer Intensität Ultraschall

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Aufrufe.  University of Bristol. Dieses Protokoll beschreibt die Stimulation der kultivierten Fibroblasten mit geringer Intensität gepulster Ultraschall, die privilegierte Adhäsionsbildung und Rac1 Aktivierung durch Nachahmen Eingriff des Transmembran-Rezeptor-Matrix, Syndecan-4 antreibt. Dieser Ansatz erlaubt die Untersuchung einer erfolgreichen klinischen Technik auf zellulärer Ebene, wodurch Möglichkeiten für die Verfeinerung der Therapie.

Serie: Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

Contrast Ultrasound gezielte Behandlung von Gliomen in Mäusen über Drug-Bearing Nanopartikel Liefer-und mikrovaskuläre Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Forschung

Biotechnik

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Einführung in die Ultraschall-gezielte Mikroblasen Zerstörung Technik

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Optical Detector von Ultraschall für medizinische Imaging-Anwendungen

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Echtzeit-Überwachung von hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) Ablation<em&gt; In-vitro-</em&gt; Canine Livers Verwendung harmonische Bewegung Imaging für fokussierten Ultraschall (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the light distortion during the propagation within the fiber. Our methodology is based on digital optical phase conjugation employing only a single spatial light modulator, where the optical wavefront is individually modulated at different regions of the modulator, one region per light signal. Digital optical phase conjugation approaches are considered to be faster than other wavefront shaping approaches, where (for example) a complete determination of the wave propagation behavior of the fiber is performed. In contrast, the presented approach is time-efficient since it only requires one calibration per light signal. The proposed method is potentially appropriate for spatial division multiplexing in communications engineering. Further application fields are endoscopic light delivery in biophotonics, especially in optogenetics, where single cells in biological tissue have to be selectively illuminated with high spatial and temporal resolution.

We demonstrate the transmission of multiple independent signals through a multimode fiber using wavefront shaping employing a single spatial light modulator. By modulating the wavefront for each signal individually, spatially separated foci are transmitted. Potential applications are multiplexed data transfer in communications engineering and endoscopic light delivery in biophotonics.

Die Übertragung von mehreren Signalen über eine optische Faser Mit Wavefront-Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Herstellung von Bauchschlagader Hydrogel Gewebe-Nachahmung Phantome für Ultraschall-Elastographie-Validierung

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Funktioneller transkranialer Doppler-Ultraschall zur Überwachung des zerebralen Blutflusses

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

Kontrastmittelverstärkte subharmonische Druckschätzung (SHAPE) mittels Ultraschallbildgebung mit Schwerpunkt auf der Identifizierung portaler Hypertonie

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

Multi-Timescale-Mikroskopie-Methoden zur Charakterisierung fluoreszenzmarkierter Mikroblasen für die ultraschallgesteuerte Wirkstofffreisetzung

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...