The authors thank Dara Frank and Carrie Harwood for their generous contribution of strains. University of Wisconsin Milwaukee Research Foundation holds patent no. 8,354,451; with claims broadly directed to treating or inhibiting the progression of infection of a microorganism in a patient by administering a 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-inhibiting compound such as 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). Inventors are Graham Moran and Pang He. This research was supported by the National Institutes of Health (R00-GM083147). The University of Washington P. aeruginosa transposon mutant library is supported by NIH P30 DK089507.

1. Herstellung von Kulturmedien, Antibiotika, und 2- [2-Nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexandion (NTBC) <ol><li> Machen LB-Brühe (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl in H 2 O) und Aliquot in angemessenen Mengen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Auf 100 ml LB-Agar (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,25% NaCl, 1,5% Agar in H 2 O) in 250 ml-Kolben. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Stellen Sie sicher, dass der Agar wird vor dem Gießen in Platten geschmolzen. HINWEIS: Kolben, die 100 ml LB-Agar-Platten werden 4 ergeben. Die Menge des LB-Agar kann verändert werden, um der Anzahl von Platten für den Assay benötigt entsprechen. </li><li> Machen PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren oder Filtration und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Bereiten Sie die Antibiotika-Stammlösungen für Gentamicin, Kanamycin, eind Tobramycin. <ol><li> Bereiten entsprechenden Antibiotikum stock Konzentrationen für P. aeruginosa-Stämme, die 100 mg / ml Gentamicin, 30 mg / ml Kanamycin und 10 mg / ml Tobramycin. Lösen Sie den Antibiotika in Wasser, Filter zu sterilisieren (0,2 um), und bei 4 ° C. Ändern Sie die Antibiotika und Konzentrationen je nach Bakterium untersucht. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die NTBC Stammlösungen. Auflösen 10 mg NTBC in 400 ul DMSO. Dies ergibt eine Konzentration von 75,9 mM NTBC. Shop NTBC Stammlösungen bei -20 ° C. Tau-Lösungen bei Raumtemperatur nach Bedarf. HINWEIS: Verschiedene Quellen von NTBC haben Unterschiede in der Löslichkeit. Bestimmen Sie das passende Fahrzeug, in dem die NTBC basierend auf den Empfehlungen des Herstellers zu lösen und anpassen Schritt 1.5 entsprechend. </li></ol> 2. NTBC Titrationen von Bakterienstämmen <ol><li> Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme zu testen. 2 ml LB-Brühe zu 16 x 150 mm Teströhrchens (einer pro-Stamm) und zu impfen mit 1 isoliert Kolonie aus jedem Stamm. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Belüftung auf einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator. </li><li> Am folgenden Tag vorzubereiten Titrationen von NTBC in LB-Brühe. Starten Sie mit einem Bereich von 0 bis 900 um NTBC da verschiedene Stämme haben Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber NTBC. <ol><li> 1 ml LB-Medium auf 4 bis 5 Teströhrchen (16 x 150 mm) pro Stamm. </li><li> Fügen Sie den NTBC Stammlösung (75,9 mm), um die Teströhrchen (16 x 150 mm) in einem Bereich von Konzentrationen. Siehe Tabelle 1 für NTBC Konzentrationen und entsprechende Aktienvolumen auf 1 ml LB-Brühe hinzufügen. </li></ol></li><li> Messen Sie die OD600 der Übernachtkulturen. Kulturen vor der Einnahme von OD 600 Lesungen zu beseitigen in den Medien präsent pyomelanin waschen. <ol><li> Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand und keine lose pelletierten Zellen miteine Mikropipette und Resuspendieren der festen Zellpellet in 1 ml LB </li></ol></li><li> Impfen Titration Röhrchen bei OD 600 0.05. Berechnung der Menge der Kultur gewaschen erforderlich, um die Rohre anzuimpfen. HINWEIS: Verwenden Sie die gewaschenen Kulturen für Impfungen seit pyomelanin sollte nicht vorhanden sein. </li><li> Die Titration Rohre etwa 24 h bei 37 ° C inkubieren mit Belüftung unter Verwendung einer Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator. </li><li> Fotografieren Sie die Titration Rohre und vergleichen Pigmentproduktion innerhalb und zwischen den Stämmen, die Menge an NTBC bestimmen, die für MIC und oxidativer Stress-Tests zu verwenden. Verwenden OD 600 Lesungen, die Menge an pyomelanin in zellfreien Kulturüberstand zu bestimmen, und um die Zelldichte zu bestimmen. HINWEIS: Der OD 600-Verhältnis von pyomelanin in Kulturüberstand von Zellen berechnet werden kann, um Unterschiede in pyomelanin Produktion nach Behandlung mit NTBC quantifizieren. </li></ol> 3. Antibiotika Mindest InhibiTory-Konzentration (MIC) Assay in 96-Well-Platten <ol><li> Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC getestet werden. HINWEIS: Dieses Protokoll wird mit dem repräsentativen Niveau von 300 um NTBC beschrieben. Die angemessene Höhe der NTBC verwendet werden in Schritt 2.6 festgelegt. <ol><li> In 300 um NTBC bis 2 ml LB Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB für die kein NTBC Zustand. </li><li> Mit einer sterilen Zahnstocher, zu impfen Rohre mit einem isolierten Bakterienkolonie. Es wird eine Kultur mit NTBC und einer Kultur ohne NTBC für jeden Stamm sein. Inkubieren über Nacht bei 37ºC unter Belüftung mit einem Gewebekultur-Rotator in einem Luft-Inkubator. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag machen LB + NTBC und LB + DMSO Stammlösungen für die Einrichtung des MIC-Assay. Hinzufügen NTBC bei einer Konzentration von 600 &amp; mgr; M, wie dies zweifach verdünnt, als Impfmaterial zugesetzt werden, wodurch man eine Endkonzentration von 300 uM. <ol><li> Einem antibi testenOhr für einen Stamm, fügen 600 um NTBC bis 2 ml LB und mischen, um den NTBC Stammlösung zu machen. Fügen Sie eine gleichwertige Menge von Vehikel (DMSO) auf 2 ml LB und mischen, die keine NTBC Stammlösung zu machen. Mit diesen Lösungen für die Erstellung Antibiotikum Stammlösungen als auch für den Aufbau der Verdünnungsreihe in 96-Well-Platten. HINWEIS: Die Stammlösung Formulierungen zusätzliche Lösung für Pipettierfehler-Konto zu erhalten. Die Stammlösungen kann nach oben oder unten skaliert, wie abhängig von der Anzahl von Antibiotika und getesteten Stämmen erforderlich. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Antibiotika-Lösungen in den LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen. HINWEIS: Die Konzentration des Antibiotikums in diesen Lösungen sollte das Doppelte der gewünschten Endkonzentration sein. Genug Lösung sollte, um 100 &amp; mgr; l bis vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen übertragen. <ol><li> Bereiten Gentamicin +/- NTBC Stammlösung bei 64 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen Sie 0,288 &amp; mgr; l von Gentamicin Lager (100 mg / ml) auf 450ul LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung. HINWEIS: Die maximale Konzentration von Gentamicin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 32 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Machen Sie das Kanamycin +/- NTBC Stammlösung bei 256 ug / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 3,84 &amp; mgr; l Kanamycin Lager (30 mg / ml) und 450 &amp; mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen. HINWEIS: Die maximale Konzentration von Kanamycin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 128 ug / ml. </li><li> Bereiten Tobramycin +/- NTBC Stammlösung bei 8 &amp; mgr; g / ml. Um diese Lösung zu machen, fügen 0,36 &amp; mgr; l von Tobramycin Lager (10 mg / ml) und 450 &amp; mgr; l LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösungen. HINWEIS: Für P. aeruginosa PAO1, die maximale Konzentration von Tobramycin beträgt 4 &amp; mgr; g / ml. HINWEIS: Die Antibiotika und Konzentrationen eingestellt, damit das Bakterium getestet werden kann. </li></ol></li><li> Füge 100 ul je 2x Antibiotikalösung zu vier Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Legen Sie diese Lösungen in der Reihe A. Für example sollte Gentamycin in den A1 bis A4 platziert werden sollte Kanamycin in A5 bis A8 angeordnet werden und Tobramycin sollte A9 bis A12 gelegt werden. Siehe 1A für ein Schaltbild einer 96-Well-Platte einzurichten. HINWEIS: Mehrere Antibiotika kann in einer Platte getestet werden, aber nur ein Stamm sollte pro Platte getestet, um das Risiko einer Kreuzkontamination von anderen Stämmen zu beseitigen. </li><li> In 50 ul der LB + NTBC oder LB + DMSO Stammlösung, um Zeilen B bis H der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass eine Platte LB + NTBC und eine Platte LB + DMSO. Siehe 1A. <ol><li> Verwenden Sie LB + NTBC für die Antibiotika in LB + NTBC. Verwenden Sie LB + DMSO für die Antibiotika in LB + DMSO. </li></ol></li><li> Mit einer Mikroführen zweifachen Reihenverdünnungen der Antibiotika durch die Übertragung von 50 ul der Lösung von Reihe zu Reihe A B. Mischen Sie die Lösung, ändern Sie die Pipettenspitzen, und übertragen Sie 50 ul der Lösung von Reihe B C. Wiederholen Sie zum zu rudern die remaining Zeilen. Nach Verdünnen Reihe G, entfernen Sie 50 ul der Lösung aus dieser Reihe und entsorgen. Verwenden Reihe H als ohne Antibiotika-Steuerung für das Bakterienwachstum. Siehe Abbildung 1B. HINWEIS: Jedes der gut in den Reihen A bis G enthält nun 50 ul von Antibiotika in LB + NTBC oder LB + DMSO bei 2X die endgültige gewünschte Konzentration. Row H enthält LB + NTBC oder LB + DMSO ohne Antibiotika. </li><li> Messen Sie die OD600 der Übernachtkulturen. Alle Kulturen vor der Einnahme von OD 600 Lesungen in den Medien präsent pyomelanin beseitigen waschen. <ol><li> Die Kulturen durch Zentrifugieren von 1 ml der Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 2 min waschen. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und Zellpellet in 1 ml LB </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Übernachtkulturen zu 2.75x10 5 CFU / ml in LB. HINWEIS: Es sei angenommen, dass eine OD 600-Einheit ist das Äquivalent von 1x10 &amp; sup9; CFU / ml von P. aeruginosa. OD, um CFU / ml Umwandlungen können d werdenifferent in anderen Bakterien. </li><li> Dann werden 50 ul der verdünnten Bakterienkultur zu dem geeigneten gut. HINWEIS: Kulturen in NTBC wachsen sollten an die Vertiefungen, die NTBC und Kulturen in DMSO wachsen sollten an die Vertiefungen, die DMSO hinzugefügt werden, hinzugefügt werden. Siehe Abbildung 1B. <ol><li> In Bakterien drei Brunnen für jeden Stamm und Antibiotikakonzentration. Dann werden 50 ul LB dem vierten gut, um als Kontrolle für die bakterielle Kontaminierung zu handeln. Siehe Abbildung 1B. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um die Brunnen zu impfen. Sicher, dass die Pipettenspitzen sich in der Nähe der Boden der Vertiefungen beim Hinzufügen Inokulum um eine Kontamination benachbarter Vertiefungen zu verhindern. HINWEIS: Durch Hinzufügen Bakterienkultur in die Vertiefungen wird der Antibiotikum und NTBC Konzentrationen zu verdünnen zweifach. </li></ol></li><li> Decken Sie die 96-Well-Platten mit Parafilm und Inkubation etwa 24 Stunden bei 37 ° C. Inkubieren Platten mit 96 Vertiefungen statisch in einem Luft Inkubator. </li><li> Untersuchendie Platten für das Bakterienwachstum in den Vertiefungen. Die MHK ist die niedrigste Konzentration des Antibiotikums in der kein Bakterienwachstum wird für alle drei Wiederholungen jedes Stammes gesehen. <ol><li> Optisch prüfen Sie die Platte für das Wachstum oder lesen unter Verwendung eines Plattenlesegerät-Set bis zu einer OD 600. </li></ol></li></ol> 4. Spot-Platten-Assay für die oxidative Stressreaktion <ol><li> Eingerichtet Übernachtkulturen der Stämme in LB mit und ohne NTBC wie in Schritt 3.1 beschrieben, getestet werden. </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten LB-Agarplatten, die H 2 O 2 als oxidative Stressor. Eine Reihe von H 2 O 2 -Konzentrationen von 0 auf 1 mM ist ein guter Ausgangspunkt. <ol><li> Schmelzen Sie die LB-Agar-Kolben. Kühles Medium auf etwa 50 ° C bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzuzufügen H 2 O 2 direkt an den gekühlten Medien in den gewünschten Konzentrationen. Swirl Flaschen zu mischen. Siehe Tabelle 2 für die Konzentration von H 2 O 2und Volumina konzentrierter H 2 O 2 zu. Diese Werte beziehen sich auf 100 ml LB-Agar basiert. </li><li> Platten gießen unmittelbar nach Zugabe von H 2 O 2 und Flamm der Oberfläche, um Blasen zu entfernen. Die Ausbeute beträgt 4 Platten pro 100 ml LB-Agar. Markieren die Platten mit dem H 2 O 2 -Konzentration. </li><li> Legen Sie die Platten in einer biologischen Flow-Haube mit dem Lüfter läuft für 30 Minuten unbedeckt, um überschüssige Feuchtigkeit aus den Platten zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie die Platten am selben Tag sie hergestellt werden. Bei Nichtbeachtung kann zu inkonsistenten Daten führen. HINWEIS: Oxidativer Stressfaktoren wie Paraquat für H 2 O 2 in diesem Test ausgewechselt werden. Die für andere oxidative Stressoren verwendeten Konzentrationen kann anders als die für H 2 O 2 verwendet wird. </li></ol></li><li> Waschen Sie und Messen der OD 600 der Übernacht-Kulturen wie in Schritt 3.7 beschrieben. </li><li> Normalisieren die OD 600 von der ganzen Nacht cultures auf den niedrigsten Wert für die Menge der Stämme getestet. P. aeruginosa hat im allgemeinen eine OD 600 von etwa 2,5, wenn über Nacht in LB + NTBC oder LB + DMSO gewachsen. <ol><li> Bestimmung der Kulturvolumen benötigt wird, um die Kultur auf die niedrigste OD 600 in einem Gesamtvolumen von 1 ml zu verdünnen. Zum Beispiel, wenn eine Kultur eine OD 600 von 3 und der niedrigste OD 600 für die Menge der Stämme ist 2.5, die folgende Rechnung aus: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert werden. </li><li> Berechnung der Menge an LB + NTBC (300 uM) oder LB + DMSO benötigt, um das Kulturvolumen auf 1 ml zu bringen. Zum Beispiel in Schritt 4.4.1 wird die Menge an LB + NTBC oder LB + DMSO zu der Kultur gegeben wäre 0,167 ml (1 ml Gesamtvolumen - 0.833 ml Kultur) sein. Machen Stammlösungen LB + NTBC und LB + DMSO für diese Verdünnungen auf der Basis des zum Verdünnen aller Stämme benötigte Volumen zu verwenden. </li><li> Mischen Sie die Kultur und LB + NTBC oder LB + DMSO durch Vortexen. </li></ol></li><li> Kulturen in einer konstanten Konzentration von NTBC oder DMSO zu erhalten, auszuführen zehnfache serielle Verdünnungen der normalisierten Übernachtkulturen in PBS + NTBC oder PBS + DMSO. <ol><li> Machen Stammlösungen von PBS + NTBC und PBS + DMSO. Für einen Satz von Verdünnungen für einen Stamm, mix 300 um NTBC oder eine gleichwertige Menge von DMSO mit PBS auf ein Gesamtvolumen von 720 &amp; mgr; l zu ergeben. Skalieren Sie diese Aktien nach oben oder unten, je nachdem, wie viele Stämme getestet. </li><li> Label-Mikrozentrifugenröhrchen für 10 -1 bis 10 -7 Verdünnungsreihen. Werden 90 &amp; mgr; l PBS + NTBC oder PBS + DMSO in die entsprechenden Tuben. Verwenden PBS + NTBC für die Stämme in LB + NTBC gewachsen und benutzen PBS + DMSO für die Stämme in LB + DMSO gewachsen. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l der Kultur in die entsprechende 10 -1 Verdünnungsröhrchen. Vortexen und übertragen 10 ul der 10 -1 Verdünnung auf 10 -2 Verdünnungsröhrchen. Wiederholen, bis alle Verdünnungen wurden perfoRMED. Ändern Pipettenspitzen zwischen Verdünnungen. </li></ol></li><li> Spot 5 ul der 10 -3 bis 10 -7 Verdünnungen auf LB + H 2 O 2 Platten in doppelter Ausführung für jeden Stamm. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, wenn Flecken überzogen von den meisten zu verdünnen, um mindestens verdünnter (10 -7 bis 10 -3). Nicht kippen oder neigen Sie die Platte, bis die Flüssigkeit in die Platte getrocknet. </li><li> Die Platten für 24-48 h bei 37 ° C (Luftinkubator) in Abhängigkeit von der Belastung. HINWEIS: P. aeruginosa PAO1 wird recht großen Kolonien auf LB nach 24 Stunden Inkubation haben. Stämmen inkubieren, bis sie Kolonien etwa die gleiche Größe wie PAO1. </li><li> Fotografieren Sie die Platten unter Verwendung einer CCD-Kamera über einem transluminator. Bearbeiten Sie optional die Fotos für Kontrast und Ernte auf die gleiche Größe. Zählen die Anzahl der Kolonien in jedem Spot zu Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress zu bestimmen. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates12 (Figure 2). The...

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway10. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin11. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)12, which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway13. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin11. 
We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.
The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa12. Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction. 
The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent12. Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.
Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions14. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.
Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time1, or oxidative stress disc diffusion assays15. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H2O2 and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Also called nitisinone.&amp;nbsp; Soluble in DMSO.</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. % in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Stabilized.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Soluble in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&amp;nbsp; Filter sterilize.</td></tr></tbody></table>

methods to inhibit bacterial pyomelanin production and determine the corresponding increase in sensitivity to oxidative stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

NTBC Titrationen Die NTBC Titrationen wurden verwendet, um festzustellen, ob NTBC konnte pyomelanin in P. reduzieren aeruginosa, und auch die Konzentration von NTBC, die eliminiert oder reduziert pyomelanin Produktion für die Verwendung in weiteren Assays identifizieren. Es können Variationen in der Höhe der pyomelanin in verschiedenen Replikationen hergestellt sein, aber allgemeine Trends konstant bleiben. Die NTBC Titrationsassay könnte auch modifiziert werden, um and...

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Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K Aufrufe.  University of Wisconsin Milwaukee. Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Serie: Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

Forschung

Krebsforschung

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Biochemie

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1 receptor, a Gs-coupled signaling protein found on the surface of melanocytes. Mc1r stimulates adenylyl cyclase and cAMP production which, in turn, up-regulates melanocytic production of melanin in the skin. In order to study the mechanisms by which Mc1r signaling protects the skin against UV injury, this study relies on a mouse model with "humanized skin" based on epidermal expression of stem cell factor (Scf). K14-Scf transgenic mice retain melanocytes in the epidermis and therefore have the ability to deposit melanin in the epidermis. In this animal model, wild type Mc1r status results in robust deposition of black eumelanin pigment and a UV-protected phenotype. In contrast, K14-Scf animals with defective Mc1r signaling ability exhibit a red/blonde pigmentation, very little eumelanin in the skin and a UV-sensitive phenotype. Reasoning that eumelanin deposition might be enhanced by topical agents that mimic Mc1r signaling, we found that direct application of forskolin extract to the skin of Mc1r-defective fair-skinned mice resulted in robust eumelanin induction and UV protection 1. Here we describe the method for preparing and applying a forskolin-containing natural root extract to K14-Scf fair-skinned mice and report a method for measuring UV sensitivity by determining minimal erythematous dose (MED). Using this animal model, it is possible to study how epidermal cAMP induction and melanization of the skin affect physiologic responses to UV exposure.

Epidermal melanin is induced by topical application of forskolin in a murine model of the fair-skinned UV-sensitive human. Pharmacologic manipulation of cAMP levels in the skin and epidermal darkening strongly protect against UV-mediated inflammation (sunburn) as measured by the minimum erythematous dose (MED) assay.

Pharmakologische Induktion der epidermalen Melanin und Schutz vor Sonnenbrand in einem humanisierten Mausmodell

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Medizin

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as UV protective agents, skincare, cosmetics etc. A marine Pseudomonas stutzeri produces melanin without the addition of tyrosine. The feedback inhibition was observed by melanin in the culture of a melanin-producing marine bacterium, Pseudomonas stutzeri. Melanin also demonstrated microbial growth inhibition. The Han-Levenspiel model-based analysis identified uncompetitive type product inhibition of melanin on the cell growth. Tyrosinase enzyme, which produces melanin, was inhibited by melanin. The double reciprocal plot of the enzymatic reaction in the presence of different melanin concentrations revealed uncompetitive product inhibition. An adsorbent-based adsorptive bioprocess was developed to reduce the feedback inhibition by melanin. Different adsorbents were screened to select the best adsorbent for melanin adsorption. Dosage amount and time were optimized to develop the adsorptive bioprocess, which resulted in an 8.8-fold enhancement in melanin production by the marine bacteria Pseudomonas stutzeri (153 mg/L to 1349 mg/L) without supplementation of tyrosine and yeast extract.

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Here we present a protocol on adsorptive bioprocess to produce a biological product, especially a pigment that inhibits its own biosynthesis and inhibits the growth of the microorganism that produces it.

Melanins are natural pigments, and the presence of indole ring and numerous functional groups makes melanin an ideal choice for many applications such as ...

Ingenieurwesen

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Biotechnik

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Biologie

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Minimum Erythematous Dose Assay: A Method for Measuring UV Sensitivity in Mouse Models

Source: Amaro-Ortiz, A. et al. <a href="https://www.jove.com/v/50670"> Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model</a>. J. Vis. Exp. (2013)
This video describes a method to measure UV sensitivity in a humanized mouse model&#8212;a mouse model that mimics human skin. We determine the minimal erythematous dose (MED) of UV radiation that can cause erythema or edema on the skin. The method can help to find out the efficacy of drugs used to reduce UV sensitivity.

Minimaler erythematöser Dosis-Assay: Eine Methode zur Messung der UV-Empfindlichkeit in Mausmodellen

Source: Amaro-Ortiz, A. et al.  Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Skin Cancer

Animal model studies

A Spot Plate Assay for Evaluating Oxidative Stress Responses in Bacterial Strains

Source: Ketelboeter, L. M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53105">Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates a spot plate assay tailored to assess the oxidative stress responses of bacterial strains. Some strains produce pyomelanin, an antioxidant pigment. Conversely, strains treated with a test agent, leading to reduced pyomelanin production, exhibit increased susceptibility to oxidative stress, resulting in decreased cell viability compared to pyomelanin-producing strains.

Ein Spot-Plate-Assay zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen in Bakterienstämmen

1. Preparation of Culture Media, Antibiotics, and 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)

	Make Luria-Bertani (LB) broth (1% ...

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

Pharmakologische Induktion der epidermalen Melanin und Schutz vor Sonnenbrand in einem humanisierten Mausmodell

Adsorptive Bioprocess Improves Yield of Melanin from Pseudomonas stutzeri

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

Minimaler erythematöser Dosis-Assay: Eine Methode zur Messung der UV-Empfindlichkeit in Mausmodellen

Ein Spot-Plate-Assay zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen in Bakterienstämmen