Wir sind dankbar, dass Dr. Karl-Heinz Krause und Vincent Jaquet um Hilfe und Rat, diese Protokolle einzurichten, und danke auch Christoph Bauer und Jérôme Bosset vom Bioimaging Plattform des NFS und Dr. Navin Gopaldass für ihre technische Unterstützung. Die Forschung wird von einem ProDoc Erteilung des Schweizerischen Nationalfonds unterstützt.

1. Visualisierung und qualitative Messung der ROS-Produktion in Phagosomen Die OBG-beschichteten Kügelchen sollten im Voraus vorbereitet werden. Die Perlen Beschichtungsverfahren und Agar Overlay-Technik werden die veröffentlichten Referenzen 5,14 angepasst. <ol><li> 1 ml Suspension von 3,0 um carboxylierten Silica-Kügelchen (ca. 1,8 x 10 9 Perlen) in ein 1,5-ml-Röhrchen, waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 25 mg / ml Cyanamid (die carboxylierten Silicakügelchen aktivieren kovalent vormarkiert BSA zu binden), Inkubation auf einem Rad 15 min. </li><li> 3x Waschen mit 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,0) durch schnelle Runde (Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für Mini 5 Sekunden oder alternativ Zentrifuge bei 2000 g für 1 min in einer Tischzentrifuge) und Vortexen, um überschüssige Cyanamid zu entfernen. </li><li> Mischen Sie die gewaschenen Perlen mit 500 ul coupling Puffer mit 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas aus einer Standard-Gas-Dose vor der Deckelung und Inkubation auf einem Rad 14 Stunden (über Nacht) bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Beads 2x mit 1 ml Löschpuffer (250 mM Glycin in PBS), um nicht umgesetzte OBG zu entfernen, und zweimal mit Kupplungspuffer, um den Löschpuffer durch schnelle Drehung und Verwirbelung zu entfernen. </li><li> 1 ml Kopplungspuffer, enthaltend 50 &amp;mgr; g des Alexa Fluor 594 Succinimidylester an BSA konjugiert. Das Rohr wird vor dem Verschließen mit Stickstoff und Inkubieren auf einem Rad für 1,5 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml Puffer Abschrecken durch schnelle Drehung und Wirbeln, um die Reaktion zu stoppen, dann waschen die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex. </li><li> Schließlich Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 2 &amp;mgr; l 10% w / v Azid für langfristige Lagerung. Messen Sie die concentration der Raupen in der Suspension mit einer Zählkammer (in der Regel etwa 1-2 x 10 9 Perlen / ml), füllen Sie das Rohr mit Stickstoff vor der Deckelung, und bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Beschichtungseffizienz des OBG Fluorescein kann durch Prüfen des Emissionsspektrums mit einer Anregung bei 500 nm getestet werden. Wenn H 2 O 2 in Gegenwart von Meerrettichperoxidase (HRP) oxidiert, die Fluoreszenzintensität des oxidierten Perlen, bei Emissionspeaks (538 nm), ist die 11-12-fach höher als die der nicht-oxidierten beschichteten Perlen. </li><li> Ernte exponentiell wachsenden Dictyostelium-Zellen aus einer 10 cm Petrischale, Platten unterschiedlicher Dichte der Zellen auf 3 cm Gerichte mit einer optisch klaren Kunststoff-oder Glasboden, und wachsen sie über Nacht. Wählen Sie die Gerichte, die etwa 80% konfluent für das Experiment sind. Ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung von Dictyostelium-Zellen wurde veröffentlicht 15. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturmedium mit LoFlo Medium (LF-Medium), Inkubation2 h vor dem Experiment, um die extrazellulären und intraendosomal Autofluoreszenz des HL5C Kulturmedium zu verringern. </li><li> Parallel Schmelze 10 ml 1,5% Bacto Agar in LF Medium, gießen Sie die Agar auf eine flache Oberfläche (dh eine Glasplatte von 10 cm x 10 cm), um eine Agar-Schicht etwa 1 mm Dicke zu bilden, warten Sie 10-15 min verfestigt. Schneiden Sie die Agar-Schicht in 2 cm x 2 cm große Quadrate und in LF Medium für die spätere Verwendung. </li><li> Unterdessen bereiten die Spinnplatte oder Weitfeldmikroskop, stellen Sie die Temperatur der Klimakammer bei 22 ° C und die Einstellungen für dieses Experiment. (Siehe weitere Kommentare in der Diskussion). </li><li> Nach 2 Stunden Inkubation absaugen LF Medium von der 3 cm Schale, aber die Zellmonoschicht sollte noch mit einem dünnen Film des Mediums erfasst werden. Verdünnen Sie die beschichteten Kügelchen bis 1,5 x 10 7 Perlen / ml, und fügen Sie 10 ul auf die Zellschicht. </li><li> Nehmen Sie ein Quadrat Agar Blatt, abtropfen überschüssige Flüssigkeit aber feucht halten. Sanft legte the-Agar Quadrat auf der Oberseite der Zellschicht. Den Agar-Quadrat nicht, wenn er sich auf den Zellen liegen. Die Agar-Overlay wird verwendet, um den Kontakt zwischen Perlen und Zellen zu erhöhen, wodurch die Verbesserung der Aufnahme, und es auch leicht komprimiert die Zellen, halten sie besser in der Brennebene des Objektivs. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf die Schüssel, legen Sie es auf den Mikroskoptisch, und automatisch Bilder in den Rot-, Grün-und Phasen Kanäle alle 1 min für 2 Stunden oder länger. </li><li> Wählen und konzentrieren sich auf die zelluläre Ereignisse, die den gesamten Prozess der Phagozytose enthalten. Zusammenführen der drei Kanäle optimiert und montieren Sie die Bilder in einen Film mit professionellen Bildbearbeitungssoftware. Quantifizieren Fluoreszenzintensitäten von jeweils ausgewählten Perlen in rot und grün-Kanälen, und das Verhältnis von Grün / Rot wird die dynamische phagosomalen ROS-Produktion der Zellen reflektieren. </li></ol> 2. Quantitative und Medium-Throughput-Messung der intrazellulären Superoxid-Produktion <ol><li> Sammeln one 80% konfluent Gericht aus Dictyostelium in 10 ml HL5C Medium. Centrifuge Dictyostelium-Zellen bei 850 g für 5 min, sorgfältig und vollständig absaugen überschüssiges Medium. Die Zellen in SS6.4 Puffer [0,12 M Sorbitol in Sorensen-Puffer (14,69 mM KH 2 PO 4 und 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], zählen Zellen und zu verdünnen, um eine endgültige Dichte von 6 x 10 6 Zellen / ml (siehe weitere Kommentare in der Diskussion). </li><li> In 50 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer undurchsichtigen weißen 96-Well-Platte (siehe zusätzliche Kommentare in der Diskussion). </li><li> Verdünnen DHE Lager (30 mM in DMSO) 500-fach mit SS6.4, Pipette 50 ul verdünnte DHE in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Die Endkonzentration von DHE 30 uM. Die Reaktion beginnt sofort. </li><li> Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten. </li><li> Verwenden Sie den Endpunkt &quot;top Lesen &amp; #34; Modus eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 522 nm nm/605, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C </li></ol> 3. Quantitative und High Throughput Messung der extrazellulären H 2 O 2-Produktion <ol><li> Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. </li><li> Bereiten verdünnten HRP durch Zugabe von 5 ul HRP Lager (100 U / ml in destilliertem Wasser) in 10 ml SS6.4, Vortex oder das Röhrchen gut mischen und auf Eis für die spätere Verwendung zu halten. Die verdünnte Lösung ist HRP bei 0,05 U / ml. </li><li> Bereiten Sie die AUR Reaktionsgemisch durch Mischen der AUR Lager (10 mM AUR in DMSO) und die verdünnte Lösung in HRP SS6.4 Puffer, um die endgültigen Konzentrationen von 6,25 uM und 0,005 U / ml. Als ein Beispiel, um das Reaktionsgemisch für 40 Reaktionen vorzubereiten, mischen Sie 1600 ul SS6.4 mit 400 ul der verdünnten HRP und 2,5 ul AUR-Stammlösung. </li><li> In 50 ul AUR-Mixtur in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Nun ist die Reaktion beginnt. </li><li> Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten. </li><li> Verwenden Sie den Endpunkt &quot;top Lesen&quot;-Modus eines Fluoreszenz-Mikroplattenleser, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 530 nm nm/590, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C </li></ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li><li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. 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A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species.">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li><li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes.">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Verfahren, das OBG-Assay visualisiert dynamisch den Prozess der phagosomalen ROS auf Einzelzellebene, anstelle der Messung einer durchschnittlichen ROS Signal von einer Population von Zellen. Solche Bevölkerungs-Mittelungsverfahren neigen dazu, wichtige Informationen von nicht-synchronen Phagozytose verursacht verschleiern. Wir haben erfolgreich DHE und AUR Assays Dictyostelium angepasst und optimiert die Protokolle. Am wichtigsten ist, wir die angegebenen Typen und subz...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in einer Vielzahl von biologischen Prozessen wie der Wirtsabwehr, Signalisierung, Gewebeentwicklung und Reaktion auf eine Verletzung und Bluthochdruck und Krebs beteiligt. Die gut untersuchten phagosomalen NADPH-Oxidase-Maschinen, um eine schnelle ROS Generation, wie die oxidative burst bekannt gewidmet, um Bakterien in Neutrophilen &#39;Phagosomen 1 aufgenommen zu töten. Darüber hinaus wurde eine Leckage von Elektronen als ein Nebenprodukt der mitochondrialen Atmungskette bisher angenommen lediglich für eine ungeregelte Quelle von ROS sein. Aber vor kurzem wurde es als ein wichtiger Mechanismus, um intraphagosomal Abtötung von Bakterien in Maus-Makrophagen 2 beitragen identifiziert. In den letzten Jahren, die soziale Amöbe Dictyostelium, hat sich zu einem leistungsstarken und beliebten Modell zu Zelle intrinsischen Mechanismen der angeborenen Immunantwort zu untersuchen. Tatsächlich Dictyostelium und Menschenfresszellen teilen sich eine überraschend hohe Niveau der Erhaltung in molecular Maschinen für Bakterien erfassen, Einwirkung und Tötung 3,4 verantwortlich. Die Homologen von Proteinen und Enzymen, um die ROS-Produktion oder Entgiftung, wie NADPH-Oxidase, Katalase, Superoxiddismutasen stehen, kann sowohl in der Human-und Dictyostelium gefunden werden. Als die am besten untersuchten Amöbe Dictyostelium stellt mehrere einzigartige Vorteile gegenüber Säugermodellsystem. Sie wachsen bei Raumtemperatur ohne die Notwendigkeit für CO 2, mit einer Verdopplungszeit von 8-10 Stunden. Sie können leicht als adhärente oder Suspensionskulturen gehalten werden. Darüber hinaus dank ihrer vollständig sequenziert und annotierte haploiden Genom, und einfach genetische Manipulation, Dictyostelium hat sich zu einem sehr attraktiven experimentellen Modellorganismus. In früheren Studien verschiedene chlorierte und fluorierte Derivate von Fluorescein-Fluoreszenz, die nach der Oxidation durch ROS emittieren (kollektiv als OxyBurst Grün, OBG bekannt), wurden als ROS-Reporter verwendet. Handy-permeant esterified Derivate zur zytoplasmatischen ROS zu messen, während die Zell-impermeante Dextran-oder Protein-gekoppelten Derivate zur extrazellulären ROS messen. Insbesondere haben OBG BSA-beschichteten Kügelchen bereits zur phagosomalen ROS-Produktion in Säugerzellen 5 zu erkennen. Allerdings kann die Mikroplatten-Reader-Ansatz geben nur eine gemittelte ROS Erzeugungskurve aus einer Population von Zellen. Mit der vorliegenden Protokolls unter Verwendung Dictyostelium, eine professionelle Phagozyten und optimierte Versuchsbedingungen erhalten wir stabile und effiziente Phagozytose ohne jede Konjugation Opsonin auf die Perlen. DHE in verschiedenen Modellsystemen, wie Säuger Neutrophilen und Makrophagen verwendet worden, um zu erkennen ROS 6-9. Inzwischen gibt es einige Kontroversen über die Spezifität und Sensitivität der Methode 8,10. Als verbesserte Version Amplex Red, der Fluoreszenzintensität von AUR weniger empfindlich auf pH-Wert, die es geeignet macht, um zu messenROS in nicht neutrale oder schwach sauren Milieus. AUR wurde kürzlich in mehreren Säugetiersystemen 11,12 aufgebracht, aber ihre Verwendung in Säuger-Modelle, die ziemlich oft erforderlich schwach sauren Wachstumsmedien, wurde noch nicht berichtet worden. Darüber hinaus gibt es keine veröffentlichten Protokoll quantitativ und dynamisch zu messen ROS-Produktion und Lokalisierung in der sozialen Amöbe Dictyostelium. Das Ziel der dargestellte Satz von Protokollen ist, eine einfache und vielseitige Lösung für verschiedene ROS und deren Lokalisation überwachen und weitere Einblicke in ROS bezogenen zellulären Mechanismen. Für die OBG-Test, haben wir Live-Mikroskopie, um den gesamten Prozess der phagosomalen ROS Generation nach Aufnahme von OBG-beschichtete Beads Dictyostelium-Zellen zu überwachen, und ein neuer Ansatz, den Mechanismus der intraphagosomal Abtötung von Bakterien zu untersuchen. Wir haben mittel-Durchsatz DHE und AUR-Assays in Dictyostelium optimiert, um die intrazelluläre Superoxid messenide und extrazellulären H 2 O 2-Produktion, bzw. mit Hilfe LPS als potenter Stimulator ROS. Beachten Sie, dass LPS wurde kürzlich gezeigt, dass die bakterizide Aktivität von Dictyostelium Richtung Phagozytose Bakterien 13 zu erhöhen. Zusätzlich Behandlung mit DEDTC und Katalase ausdrücklich bestätigt, dass diese beiden Methoden speziell messen verschiedene Typen und subzellulärer Lokalisierungen von ROS in Dictyostelium. Schließlich kann der Test zur OBG anhaftendem phagozytische Zelle ferner opsonisierender der Kügelchen mit Liganden für die phagozytische Rezeptoren von tierischen Zellen angepasst werden. Im Prinzip können die DHE und AUR-Assays auch fein abgestimmt für Messungen in anhaftendem oder nicht-adhärenten Zell unter geeigneten experimentellen Bedingungen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O-13291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylated silica beads</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>PSi-3.0COOH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL5C medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>HLC0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>204010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex UltraRed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A36006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10108090001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3506-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>187364-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ibidi &#956;-Dish 35 mm, high</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td>Bottom made of optically clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek dish 35 mm</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Bottom made of a glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PHCC00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 96 well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>236108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy Mx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting, visualizing and quantitating the generation of reactive oxygen species in an amoeba model system

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von reaktiven und kurzlebigen, sauerstoffhaltigen Moleküle, die dynamisch ineinander oder entweder katalytisch oder spontan eliminiert. Aufgrund der kurzen Lebensdauer der meisten ROS und der Vielfalt ihrer Quellen und subzellulärer Lokalisierungen kann ein vollständiges Bild nur durch sorgfältige Messungen mit einer Kombination von Protokollen erhalten werden. Hier präsentieren wir eine Reihe von drei verschiedenen Protokolle mit OxyBurst Green (OBG)-beschichteten Perlen oder Dihydroethidium (DHE) und Amplex UltraRed (AUR), qualitativ und quantitativ zu überwachen verschiedenen ROS in professionellen Phagozyten wie Dictyostelium. Wir optimierten die Perlen Beschichtungsverfahren und gebrauchten OBG-beschichteten Perlen und Live-Mikroskopie intraphagosomal ROS Generation auf Einzelzellebene dynamisch visualisieren. Wir identifizierten Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli als potenter Stimulator für ROS Generation in Dictyostelium. Darüber hinaus haben wir dntwickelt Echtzeit, Mitteldurchsatz-Assays mit DHE und AUR zur ​​quantitativen Messung der intrazellulären Superoxid-und extrazellulären H 2 O 2-Produktion auf.

Die Erzeugung von ROS in Phagosomen qualitativ und dynamisch durch Mikroskopie (File S1) visualisiert werden. Die rote Fluoreszenz von Alexa Fluor 594 emittiert ist pH-unempfindlich und bleibt in der Umgebung phagosomalen konstant, während die Oxidation von OBG erhöht die Fluoreszenz im grünen Kanal. Die Emissionsspektren von in vitro oxidiert und oxidierte OBG-beschichteten Kügelchen sind in Fig. 1B verglichen wird, zeigt eine deutliche Erhöhung der Intensität nach der O...

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Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K Aufrufe.  University of Geneva.  Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können. 

Serie: Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Forschung

Biologie

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...