Neovaskularisation, die Erzeugung neuer Blutgefäße ist ein stark regulierter Prozess sowohl in normalen als auch in pathologischen Ereignissen. Um die Neovaskularisation besser zu verstehen, ist es wichtig, den Prozess in der natürlichen zellulären Mikroumgebung in vitro zu rekonstruieren. Wir haben einen mikrofluidischen Chip und eine automatische Steuerung entwickelt.
Hocheffiziente Zirkulationen werden durchgeführt, um Perfusionsmikroröhren zu bilden und zu simulieren, um das Protein zu verwenden, um auf das anfängliche Ereignis einer neuen Vaskularisation zu rekapitulieren. Der mikrofluidische Keimchip bestand aus drei Kanälen. Ein endotheliale Zellkulturkanal und ein Flüssigkeitskanal wurden durch einen breiten zentralen Hydrogelkanal getrennt.
Das mikrofluidische Steuerungssystem bestand aus einer Mikrospritzepumpe und einem elektromagnetischen Pinchventil. Ein Blasenfalle-Chip, ein mikrofluidischer Keimchip, eine mikroperistaltische Pumpe und ein Kulturmedium-Reservoir. Mit einem mikrofluidischen System könnten Endothelzellen durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktorverteilungen gleichzeitig stimuliert werden.
Pipette 20 Mikroliter von 125 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin in einen Medieninjektionsport des Zellkulturkanals. Schneiden Sie eine Pipettenspitze, um den Port des Zellkulturkanals mit einer Schere zu passen. Setzen Sie die Pipettenspitze in den anderen Medieninjektionsport des Zellkulturkanals ein.
Dann Pipette aus Luft aus Zellkulturkanal, um es mit Fibronectin zu füllen. Die Chips bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Vor der Zellaussaat 20 Mikroliter Endothelzellmedium in jeden Medieninjektionsport eingießen und die Chips 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten.
Dann pipette aus allen Medien in allen Medien-Injektions-Ports. Als nächstes Pipette fünf Mikroliter Zellsuspension in einem Medien-Injektionsport des Zellkulturkanals. Dann breiten sich Endothelzellen unter differenziellem hydrostatischem Druck schnell über den gesamten Kanal aus.
Fügen Sie etwa vier bis sechs Mikroliter ECM-Medien zum anderen Port hinzu, um den hydrostatischen Druck einzustellen und die Zellbewegung zu stoppen. Remote die Chips zum Zell-Inkubator. Dann drehen Sie die Chips alle 30 Minuten um, bis endotheliale Zellen zwei Stunden später um die innere Oberfläche des Zellkulturkanals schichten.
Verwenden Sie Pipettenspitze, um angeschlossene Zellen in den Injektionsöffnungen sehr sorgfältig zu entfernen. Legen Sie dann vier Stachelbuchsen-Luer-Adapter in die Medieninjektionsports ein und füllen Sie sie mit ECM-Medien. Entfernen Sie die Chips in den Zellinkubator, ändern Sie eCM-Medien und Luer-Adapter alle 12 Stunden.
Zur Montage des mikrofluidischen Steuerungssystems bereiten Sie zwei Polytetrafluorethylen-Röhren, zwei kurze Silikonröhren, drei lange Silikonröhren, einen Stachelbuchsen-Luer-Adapter, einen Y-Steckverbinder und dann drei L-Steckverbinder vor. Füllen Sie die Spritze mit 10 Milliliter vorgeheiztem ECM-Medium. Verbinden Sie ein Polytetrafluorethylen-Rohr mit der Spritze durch einen Stachelweibchen Luer-Adapter.
Schließen Sie dann das andere Ende des Polytetrafluorethylenrohrs an einen Y-Steckverbinder an. Als nächstes verbinden Sie zwei lange Silikonrohre mit den beiden anderen Enden des Y-Steckverbinders. Wir verwenden eine Röhre, um Reservoir zu verbinden und die andere Rohr, um Blasenfallen Chip zu verbinden.
Schließen Sie ein weiteres langes Silikonrohr an das Reservoir an. Als nächstes verwenden Sie zwei kurze Silikonrohre, um alle Ein- und Auslasslöcher auf der obersten Schicht des Blasenfangchips zu verbinden. Schließen Sie ein Polytetrafluorethylen-Rohr an das Backend des Chips an.
Als nächstes befestigen Sie eine Spritze auf der Mikrospritzepumpe. Clip zwei lange Silikonrohre in das elektromagnetische Kneifventil. Schalten Sie als Nächstes das elektromagnetische Pinch-Ventil ein, um die Rohrleitung zwischen Spritze und Reservoir zu öffnen.
Injizieren Sie Medien in das Reservoir mit Mikrospritzpumpe, um Luft in der Röhre abzuschöpfen. Wechseln Sie dann das Ventil erneut, um die Rohrleitung zwischen Spritze und Blasenfalle zu öffnen. Injizieren Sie Medien, um die Flüssigkeitskammer und das Backend-Rohr des Blasenfallenchips zu füllen.
Nehmen Sie endotheliale Sprossen aus dem Zellinkubator heraus, dann entfernen Sie Luer-Adapter auf der Zellkulturseite. Stecken Sie zwei Rohrstecker in die Hydrogel-Injektionsöffnungen des mikrofluidischen Keimchips. Schließen Sie das Back-End-Rohr des Blasenfangchips an einen Port des Zellkulturkanals an.
Setzen Sie einen T-Stecker an den anderen Anschluss und verbinden Sie ihn mit einem langen Siliziumrohr, das mit dem Reservoir verbunden ist. Beklemmen Sie das lange Silikonrohr in die mikroperistaltische Pumpe. Legen Sie dann einen Luftfilter in das Reservoir ein.
Als nächstes montieren Sie den mikrofluidischen Keimchip zum Bühnen-Inkubator. Als nächstes schließen Sie die Vakuumpumpe über ein TPU-Rohr an die Löcher in der unteren Schicht des Blasenfalle-Chips an. Legen Sie das entgegengesetzte Zirkulationsvolumen und eine Durchflussrate im kundenspezifischen Programm fest, das die Mikrospritzpumpe und das elektromagnetische Kneifventil gleichzeitig steuert.
Als nächstes richten Sie den Durchfluss der mikroperistaltischen Pumpe ein. Schalten Sie die Mikrospritze-Pumpe ein. Dann wird das Zirkulationskontrollsystem eingerichtet.
Wir testen die Barrierefunktion einiger Mikrogefäße in unserem Modell, indem wir den Diffusionsdurchlässigkeitskoeffizienten von 40 kDa F-I-T-C Dextrin messen. Wie in der Abbildung dargestellt wird, beträgt der Diffusionsdurchlässigkeitskoeffizient des statischen Kulturchips mit Zellauskleidung 0,1 plus oder minus 0,3 Mikrometer pro Sekunde. Und der Diffusionsdurchlässigkeitskoeffizient des leeren Kanals ohne Zellauskleidung beträgt 5,4 plus oder minus 0,7 Mikrometer pro Sekunde.
Endothelspriegel-Sprossen-Assay zeigte, dass Endothelzellen weitgehend nach 24 Stunden statischer Kultivierung in das zentrale Hydrogel sprießten, während der Keimgrad mit der Zunahme der Luminalscherspannung signifikant abnahm. Quantitativ verringerte sich die Luminalscherspannung in Bezug auf die Sprossenfläche, die durchschnittliche Sprossenlänge und die längste Sprossenlänge signifikant. Mit unserem System konnte die Scherbelastung der Endothelzellen während des Experiments optional jederzeit verändert werden, während der transendotheliale Fluss auf physiologischer Ebene blieb.
Dieses in vitro biomimetische Modell kann direkt auf die Untersuchung des Neovasularisierungsmechanismus angewendet werden und birgt das potenzielle Versprechen als kostengünstige Plattform für Arzneimittelscreenings und toxikologische Anwendungen.
