This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.

1. Konstruktion und Herstellung der MDF-Chip <ol><li> Zeichnen Sie einen individuellen Acrylschicht Muster unter Verwendung kommerzieller Software wie AutoCAD, und speichern Sie das Muster. <ol><li> Überprüfen Sie die Gestaltung des Vier-Schicht-Acrylglas-Muster in 1A und bestätigen Sie die Durchkontaktierungen. </li></ol></li><li> Herzustellen alle Acrylglasplatten und das doppelseitige Klebeband durch Laserablation unter Verwendung eines CO 2 -Lasers scriber (1B, 2A und 2B). 16 <ol><li> Schalten Sie den Laser-Anreißer und schließen Sie das Gerät an die Steuerung Laptop. </li><li> Führen Sie das kommerzielle Software und öffnen Sie das Muster in Schritt 1.1 ausgelegt, indem Sie auf &quot;konzipiert Pattern-Datei.&quot; </li><li> Legen Sie ein Stück leere Acrylglas oder doppelseitigen Klebeband auf der XYZ-Bühne des Laser-Anreißer. </li><li> Einstellen des Fokus des Laserstrahls auf der Oberfläche der Acrylfolie oder doppelseitiges Klebeband mit einem Auto-alignment-Stick vom Hersteller des Laserreißnadel vorgesehen. </li><li> Senden die entworfenen Muster zum Laserritz zur direkten Bearbeitung der Acrylglasplatte oder doppelseitiges Klebeband. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Schutzpapier von der Acrylglasplatten mit einer Pinzette und blasen die Oberfläche sauber mit Stickstoffgas. </li><li> Ablegen der Acrylplatten und miteinander zu verbinden unter einem Druck von 2 kg / cm 2 in einem Thermobonder 45 min bei 110 ° C, um den Strom / elektrische Stimulation Kanalanordnung zu bilden. </li><li> Bereiten Sie die Mikroskop-Deckglas als Zellkultursubstrat im Chip. <ol><li> Legen Sie das Deckglas in Küvette und füllen das Glas mit einer zehnfachen Verdünnung des Waschmittels in der Materialliste aufgeführt. </li><li> Legen Sie das Deckglas und Küvette in einem Ultraschall-Steri-Reiniger und reinigen Sie das Deckglas 15 min. </li><li> Gießen Sie die verdünnten Reinigungsmittel aus der Küvette füllen Sie das Gefäß mit destilliertem Wasser, und wiederholen Sie Schritt 1.5.2 3 mal. </li><li> Trocknen des gereinigten Abdeckglas durch Ausblasen mit Stickstoff, bevor zu dem doppelseitigen Klebeband Ankleben. </li></ol></li><li> Halten Sie die gereinigte Deckglas auf das Fluss / elektrische Stimulation Kanalanordnung mit dem doppelseitigen Klebeband in Schritt 1.2 gemustert. </li><li> Anhaften 13 Stücke Acryl Adaptoren an die einzelnen Öffnungen in der Schicht 1 der MDF-Chip-Montage mit Sekundenkleber. Die MDF-Chip-Montage ist dann abgeschlossen (2D). </li><li> Sterilisieren Sie die komplette MDF-Chip-Montage mit 30 Minuten der UV-Bestrahlung vor der Verwendung. </li></ol> 2. Einrichten der Salzbrücke Netzwerk der MDF-Chip <ol><li> Vor der Verwendung zu sterilisieren alle Kunststoff-Rohre, fingerfest Muttern und Mikrozentrifugenröhrchen in 3B gezeigt ist, durch Einstellen einer Haltezeit von 15 min bei 121 ° C im Autoklaven. </li><li> Schließen Sie die Fluorkunststoffrohre (3B-i) auf die MDF-Chip-Montage über den Mitteleingangund Ausgangsadaptern in 1A gezeigt. </li><li> Verbinden Sie den Luer-Konus des Mediums Einlass- und Auslass-Kunststoffrohre in 3B-i an die 3-Wege-Hähne. </li><li> Nehmen 2,5 ml CO 2 -equilibrated phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 3 ml-Spritze und verbinden die Spritze mit dem 3-Wege-Hahn des Einlasskunststoffrohr. Schließen Sie eine leere 3-ml-Spritze mit dem 3-Wege-Hahn der Austrittskunststoffrohr. Die beiden Spritzen werden somit durch die MDF-Chip verbunden sind. HINWEIS: Inkubieren Sie die PBS in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturinkubator O / N zu erhalten, CO 2 -equilibrated PBS. </li><li> Verschließen Sie die Öffnungen der blauen und der grünen Adapter (Abbildung 1A) auf dem Layer 1 PMMA-Platte mit weißen Festhandfest Muttern (3B-III). </li><li> Füllen Sie die Salzbrücke Kanälen und Kulturkammern mit dem CO 2 -equilibrated PBS in der im Setup-Schritt 2.4 beschrieben Spritze. Vermeidendie Bildung von Blasen. </li><li> Als nächstes setzen Sie den CO 2 -equilibrated PBS-haltigen MDF-Chip in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturbrutschrank für O / N Inkubation. Dies ermöglicht die gelöste Luft in dem doppelseitigen Klebeband um Blasen in den Kammern bilden. </li><li> Wegspülen die Blasen in den Kanälen durch eine schnelle PBS Strömung im Kanal mit Hilfe der zwei Spritzen. Pumpen Sie den PBS hin und her, wenn nötig. </li><li> Ablassen PBS in den Kanälen über die 3-Wege-Hahn zum Medium Auslaßrohr verbunden ist. </li><li> Unter Verwendung einer neuen 3-ml-Spritze nehmen 2,5 ml CO 2 -equilibrated Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (siehe Schritt 3.5), und ersetzen Sie die Spritze mit dem Einlass mit dem neuen verbunden. Füllen Sie die Kanäle mit dem Medium. </li><li> Herstellung der Salzbrücke Netzwerk. <ol><li> Zeitlich entfernen Sie die Feststoffmuttern (3B-iii) auf den grünen Adapter (Abbildung 1A) und injizieren 3% heiß (&gt; 70 ° C) Agarose in die Salz briDGE Kanal durch die Öffnung in dem Grün Adaptern (1A). HINWEIS: Herstellung von heißen Agarose: Man löst 1,5 g Agarose-Pulver in 50 ml PBS. Sterilisieren durch Einstellen einer Haltezeit von 20 min bei 121 ° C im Autoklaven. </li><li> Das Einspritzen der Agarose, wenn die Flüssigkeit drei Viertel der Länge des Salzbrückenkanal ausfüllt. </li><li> Versiegeln der Poren auf die grünen Adapter (1A) durch Einschrauben der Feststoffmuttern (3B-iii) nach der Agarose-Injektion. </li><li> Ersetzen Sie die Feststoffmuttern an den blauen Adaptern (Abbildung 1A) mit den durchscheinenden Rohrhandfest Muttern (3B). </li><li> Laden der 3% Agarose in die Rohrmuttern (3B-iv) vorgewärmt. </li><li> Betten Sie die Ag / AgCl-Elektroden (3B-v) in die rohrförmigen Muttern (3B-IV), bevor dieVerfestigung der Agarose. </li></ol></li><li> Nach Abschluss der Einrichtung der Salzbrücke Netzwerk, injizieren die CL1-5 Lungenkrebszellen in die Kulturkammern, eine Kammer zu einer Zeit. </li></ol> 3. Herstellung von Krebszellen und zum beliebig Electrotactic Experiment <ol><li> Regelmäßige Kultur der Lungenkrebszelllinie CL1-5. <ol><li> Kultur die CL1-5 Lungenkrebszellen, von Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in der Vollmedium in einem 75T Zellkulturflasche bei 37 erhalten ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Der komplette Medium besteht aus DMEM und 10% fötalem Rinderserum (FBS) zusammengesetzt ist. Subkultur der Zellen alle 3 bis 4 Tage. Die zur Durchführung electro Experimenten verwendeten Zellen sind weniger als 25 Passagen von der ursprünglichen Quelle. </li></ol></li><li> 2 ml 0,25% Trypsin-Puffer auf die exponentiell wachsenden Zellen CL1-5 und Inkubation für 2 min in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturbrutschrank zur Zell detachment. </li><li> Beenden des Ablöseprozesses mit 6 ml 10% FBS DMEM und zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 5 min bei RT. Dann werfen Sie die mittlere und die Aussetzung der Zellpellet mit 5 ml PBS. </li><li> Zählen die Anzahl von Zellen in der PBS. Dann nehmen Sie 1 x 10 6 Zellen und Zentrifuge bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Entsorgen Sie die PBS. Aussetzung der Zellen mit vorgewärmtem CO 2 -equilibrated DMEM und stellen Sie die Zelldichte auf 1 × 10 6 Zellen / ml liegen. HINWEIS: Inkubieren Sie die Vollmedium in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturinkubator O / N, um das CO 2 zu erhalten -equilibrated DMEM. </li></ol> 4. Richten Sie für Electrotactic Experiment <ol><li> Von dem Auslaß der MDF-Chip injiziert 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, der Zellen in dem Chip. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen ausgesät MDF-Chip in der Zellkultur-Inkubator (bei 37 gesetzt ° C und 5% CO 2) für 2-4 Std. </li><li> Setup von MDF MikroFluidsystems. <ol><li> Installieren Sie die MDF mikrofluidischen System auf einen transparenten Indiumzinnoxid-Glas (ITO) Heizung. Messen Sie die Temperatur des MDF-Chip mit einer K-Typ-Thermoelement zwischen dem MDF-Chip und dem ITO-Glas abgeschnitten. Steuern Sie die ITO-Heizung mit einer Proportional-Integral-Differential (PID) Steuerung. Stellen Sie die MDF mikrofluidischen System Inkubationstemperatur auf 37 ° C mit dem PID-Regler. HINWEIS: Die Herstellung des ITO Heizer und der Aufbau der Zellkultur Heizsystem in früheren Berichten beschrieben 18,19. </li><li> Montieren Sie den temperaturgesteuerten MDF-Chip-Montage auf der computergesteuerten XYZ Motortisch auf einem inversen Mikroskop. Die Nutzung des motorisierten Stufe wird in Schritt 5.1 beschrieben. Pumpe das Vollmedium in die Kulturkammern durch die Einlässe mit einem Vierkanal-Spritzenpumpe. </li></ol></li><li> Pumpe das Vollmedium in die MDF-Chip mit einer Flussrate von 20 ul / h. Die Kultur Abfälle aus der auslässt sich in den Reaktionsgefäßen (als &quot;Abfall&quot; in 3A gezeigt) gesammelt. </li><li> Die Zellen für weitere 16-18 h bei 37 ° C in der MDF-Chip. </li><li> Um das Medium zu ersetzen, die Pumpe das Medium, das 50, 25, 5 und 0 &amp; mgr; M-Kinase-Inhibitor jeweils in jeder Kulturkammer mit einer Flussrate von 20 ul / min für 10 min. HINWEIS: Die Herstellung einer 10 mM Stammlösung des Rho-assoziierten Proteinkinaseinhibitor Y27632 durch Zugabe von 3 ml steriles Wasser zu der 10,6 mg-Kinase-Inhibitor. Verdünne die 10 mM Stammlösung zu 50, 25 und 5 &amp; mgr; M unter Verwendung von 10% FBS DMEM Medium. </li><li> Die Zellen in der Kinase-Inhibitor zur weiteren 60 min bei 37 ° C. Stellen Sie den mittleren Strömungsgeschwindigkeit auf 20 &amp; mgr; l / h. Verwenden Sie die gleiche Kultur Temperatur und Strömungs oben in späteren Schritten beschrieben Rate. </li><li> Verwenden elektrischer Drähte an eine Gleichstromversorgung an die MDF-Chip über die Ag / AgCl-Elektroden, die auf dem Chip zu verbinden. </li><li> Seriell verbinden ein Amperemeter in die elektrische Schaltung. Verwenden Sie das Amperemeter, um den elektrischen Strom in der MDF-Chips überwachen. </li><li> Schalten Sie die DC-Stromversorgung und den Strommesser Strom um 86,94 &amp; mgr; A durch Einstellen der Stromversorgungsspannung zwischen 15 und 19 V. BEMERKUNG: Die Größe des Ohmschen Gesetzes, E = I / (&amp; Sgr; A eff), wobei I der elektrische Strom durch das Schüttgut strömt, dh das Kulturmedium in electrotactic Kammer, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) ist das Leitfähigkeit des Kulturmediums A eff (= 0,21 mm 2 für eine 3 mm Breite · 0,07 mm Höhe) ist die effektive Querschnittsfläche des electrotactic Kammer und der elektrische Strom (I) erforderlich, um eine 300 mV / mm erzeugen EF in der MDF-Chip ist 86,94 &amp; mgr; A. </li></ol> 5. Aufnahme und Analyse von Zellbildern <ol><li> Steuern Sie den Motortisch mit Hilfe eines MATLAB GUI-Programm. Mit der MDF mikrofluidischen System auf der microsco montiertpe, bewegen Sie den Chip an den Beobachtungsbereichen mit Hilfe der motorisierten Bühne. </li><li> Rekordzelle Bilder mit einem digitalen Spiegelreflex (SLR) am Mikroskop montiert. </li><li> Nehmen mikroskopischen Bildern mit einem 4X Objektiv in Intervallen von 15 min für 2 Stunden. </li><li> Zellmigration Analyse. <ol><li> Führen NIH ImageJ 1,47 V. </li><li> Analyse der Abstand von der Anfangs- in die Endstellung des Schwerpunkts der Zelle. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → &quot;Import&quot; → &quot;Bildsequenz&quot;, und importieren Sie neun Bilder für Zellmigration Analyse. Das erste Bild ist das Ergebnis der Zeit Null, und das letzte Bild ist das Ergebnis von 120 min. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Analyze&quot; → &quot;Messungen&quot; und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben &quot;Centroid&quot; </li><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Freihand-Auswahl&quot;. </li><li> Stellen den Rand der ausgewählten Zellen in dem ersten Bild. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; → </em&gt; &quot;Auswahl&quot; → &quot;um-Manager hinzufügen&quot; </li><li> Zum neunten Bild und stellen den Rand der gleichen Zellen auf das erste Bild ausgewählt. Die Zellpositionen können mit dem zweiten bis achten Bilder zurückverfolgt werden. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; → &quot;Auswahl&quot; → &quot;um-Manager hinzufügen&quot; </li><li> Die Schritte 5.4.5 bis 5.4.9, um Daten von 90 bis 100 Zellen zu sammeln. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Analyze&quot; → &quot;Messen&quot;, um das Ergebnis der ersten und letzten Positionen der ausgewählten Zellen zu erhalten. HINWEIS: Die Migrationsgeschwindigkeit als der durchschnittliche Zellbewegung Länge pro Stunde definiert. Die Gerichtetheit wird als Cosinus, wobei der Winkel zwischen dem Vektor der dcEF (von der Anode zur Kathode) und der Vektor von dem Ausgangspunkt einer Zelle in ihre Endposition definiert. Die Gerichtet -1 ist für Zellen, die Migration in Richtung der Anode und +1 für Zellen migrieren zu der Kathode. Für eine Gruppe der statistisch miGitterzellen, die Gerichtetheit ist 0. 2 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir haben den Prozess der haftenden Acryladapter auf Schicht 1 des MDF-Chip tricky sein. Der Einsatz von nur 1 bis 2 &amp; mgr; l Superkleber ist ausreichend, um fest zu halten den Adapter auf die MDF-Chip. Größere Mengen von Kleber führte zu einer unvollständigen Polymerisation der Superkleber und Misserfolg zu haften. Sobald die Acryl-Adapter wurden fest auf das MDF-Chip geklebt, Flüssigkeitsleckage in der mikrofluidischen System nur selten aufgetreten. Außerdem O / N Inkubation in der Vakuumkammer dazu beigetra...

Das Verhalten von adhärenten Zellen sich in Richtung einer Anode oder Kathode unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die electrotactic Verhalten von Zellen spielt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, die Nervenregeneration und Wundheilung. 1-Tumorzellen wie Ratte Prostatakrebszellen, Brustkrebszellen, 2, 3 und Lungenadenokarzinomzellen 4-8 haben electrotactic Bewegung unter einem angelegten dcEF gezeigten . Die physiologische EF in Drüsengeweben gemessen. 9,10 electro wurde auch in Drüse assoziierten Tumorzellen berichtet. 2,3 Zusammen bilden die Elektrotaxis von Krebszellen wird als Metastasierung Faktor. 11 Steuerung der elektrischen Leitung von Krebszellen unter dcEF kann ein möglicher Ansatz für die zukünftige Behandlung von Krebs. Heute bleibt jedoch die detaillierte molekulare Mechanismus electro umstritten. Daher eine Untersuchung der influence der elektrischen Stimulation auf Krebszellmigration können die Entwicklung von Strategien für die Krebsbehandlung zu erleichtern. Vor kurzem haben Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Untersuchung zellulärer Reaktionen in vitro fließen Scherkraft, 12 chemische Gradienten, 13 und elektrische Reize 4 hergestellt worden. Die Herstellung von Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen mit Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethylmethacrylat (PMMA, als Acryl bekannt) erfolgreich verringert die Ausfallrate solcher Experimente. Darüber hinaus mit Acrylbasis mikrofluidischen Vorrichtungen als Prototyp für die Untersuchung von biologischen Fächern ist einfacher als mit PDMS-Chips. Verschiedene Funktionen in Acrylbasis Geräte sind für die Elektrotaxis Studie entwickelt. Jedoch keine der vorgenannten Ausführungen sind in der Lage, gleichzeitig zu testen, die Auswirkungen von verschiedenen chemischen Bedingungen und die elektrische Feld auf Zellen für electro Studie. So eine Mikrofluidikvorrichtung-MU entwickelten wirltichannel Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip-haltigen vier unabhängige Kulturkanäle und acht verschiedenen experimentellen Bedingungen in einem Chip. Die auf Acrylbasis MDF-Chip, die zuerst von Hou et al berichtet., 8 integriert elektrische Stimulation und mehrere chemisch getrennte Kanäle. Diese chemisch isoliert Kanäle können zur Kultur verschiedene Arten von Zellen in einem Experiment verwendet werden. Die dcEF in den Kanälen wird durch eine elektrische Stromversorgung hergestellt wird. Zwei unabhängige elektrische Felder, eine mit angelegten elektrischen Feldstärke (EFS) und ein weiteres mit 0 EFS, sind in jedem chemisch isolierten Kanal durchgeführt. Auf diese Weise bietet der Chip besser gesteuert koexistierenden EF und chemische Stimulation. Ferner ergibt sich aus der numerischen Simulation der chemischen Diffusion innerhalb der MDF-Chips anzuzeigen, dass keine Kontamination zwischen den Kanälen nach 24 h Versuchsdauer aufgetreten. 8 Gegenüber dem Device von Li berichtet, et al., bietet 14 der MDF-Chip einen größeren Kulturbereich, der für die weitere biochemische Analyse der elektrisch stimulierten Zellen ermöglicht. Zusätzlich mit größeren Beobachtungsbereich der MDF-Chips, mehr Zellen können in dem Test beobachtet werden, so dass die Analyse der Migrationsgeschwindigkeit bzw. Gerichtetheit der elektrisch stimulierten Zellen ist genauer. Einkanal-Chip-Designs früherer Studien von Huang et al. 4 und Tsai et al. 15 berichtet erlauben nur einen Zelltyp oder zu testenden Chemikalie. Jedoch kann die MDF-Chip verwendet, um die Wirkungen von verschiedenen Chemikalien auf electro sowie die Wirkungen der elektrischen Stimulation auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Mit anderen Worten ermöglicht die effiziente Untersuchung von chemischen Dosis Abhängigkeiten der MDF-Chip.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Reagent</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM medium</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td >Gibco,Invitrogen, USA</td>
			<td >25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Basic Life</td>
			<td >BL2651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Y-27632 (hydrochloride)</td>
			<td >Cayman Chemical Co</td>
			<td >10005583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agarose</td>
			<td >LONZO, USA</td>
			<td >SeaKem LE AGAROSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>3 ml with Luer taper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-way stopcock</td>
			<td>Nipro</td>
			<td >with Luer taper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMMA (acrylic)</td>
			<td >HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td >thickness 1mm, 2mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >acrylic adaptor</td>
			<td >KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td>
			<td >1/4-28 port, 10x10x6 mm</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >nut</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td >UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glass</td>
			<td >Deckgl&#228;ser, Germany</td>
			<td >24x60 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-sided tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >PET 8018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >super glue</td>
			<td >3M</td>
			<td >Scotch Liquid Plus Super Glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon tube</td>
			<td >HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan</td>
			<td >UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING</td>
			<td>outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scienti&#64257;c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TFD4 detergent</td>
			<td >Franklab, France</td>
			<td >TFD4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultrasonic steri cleaner</td>
			<td >LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo bonder</td>
			<td >KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 laser scriber</td>
			<td >LTT group, Taiwan</td>
			<td >ISL-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >indium tin oxide glass (ITO glass)</td>
			<td >AimCore Technology Co., Ltd</td>
			<td >TN/STN, &#8806;10&#937;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >proportional-integral-derivative (PID) controller</td>
			<td>JETEC Electronics Co., Japen</td>
			<td >TTM-J40-R-AB,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >K-type thermocouple</td>
			<td >TECPEL</td>
			<td >TPK-02A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-channel syringe pump</td>
			<td >KdScientific, USA</td>
			<td >250P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DC power supply</td>
			<td >GWInstek, Taiwan</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-Y-Z motor stage</td>
			<td >TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >inverted microscope</td>
			<td >Olympus, Japan</td>
			<td >CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >digital SLR camera</td>
			<td >Canon, Japan</td>
			<td >60D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip

Das Verhalten des Richtzellmigration unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die bedeutende Rolle von physiologischen dcEF in Führungszellbewegung während der Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und bei der Wundheilung wurde in vielen Studien gezeigt worden. Durch Anlegen Mikrofluidik-Chips mit einem electro Assay wird der Untersuchungsprozess verkürzt und experimentelle Fehler minimiert werden. In den letzten Jahren mikrofluidischen Vorrichtungen Polymersubstanzen (beispielsweise Polymethylmethacrylat, PMMA, oder Acryl) oder Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden weithin bei der Untersuchung der Reaktionen von Zellen auf eine elektrische Stimulation verwendet wird. Im Gegensatz zu den zahlreichen Schritte erforderlich, um eine PDMS-Gerät herzustellen, macht jedoch den einfachen und schnellen Aufbau der Acrylmikro fluidischen Chip ist für beide Geräte Prototyping und die Produktion geeignet. Die effiziente Untersuchung der simultanen chemischen und dcE noch keiner der gemeldeten Geräten erleichternF Wirkungen auf Zellen. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung eines Acrylbasierten Multichannel-Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip, um die gleichzeitige Wirkung der chemischen und elektrischen Stimulation auf Lungenkrebszellen zu untersuchen. Die MDF-Chip bietet acht Kombinationen von elektrischen / chemischen Reize in einem einzigen Test. Der Chip nicht nur stark verkürzt die erforderliche Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit in electro Studien.

Herstellung und Montage der Vorrichtung MDF Ein schematisches Diagramm des Acrylbasis MDF-Chip ist in 1A gezeigt. Vier Acrylplatten, einem Deckglas, 13 Acryl Adapter, und ein Stück doppelseitiges Klebeband wurde bei der Montage des fertig gestellten MDF-Chips (2D) verwendet. Es gibt nur vier unabhängige Kulturkanäle in der MDF-Gerät. Jedoch die On-Chip-Salzbrücke Netzwerk...

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Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

electrotaxis-studies-lung-cancer-cells-using-multichannel-dual

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.6K Aufrufe.  Academia Sinica. Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Serie: Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...