Diese Arbeit wird durch die KAIST finanzierten K-Tal RED &amp; B-Projekt für 2014 und der Basic Science-Research-Programm durch die National Research Foundation of Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023) unterstützt.

Achtung: Siehe Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor der Verwendung von Aceton und Chloroform, die krebserregend sind. 1. Herstellung von Phospholipidschicht an einer Wohnung Luft-Wasser- <ol><li> Bildung einer Phospholipidschicht <ol><li> Herstellung einer Phospholipidlösung <ol><li> Reinigen Sie eine 4 ml mit einem Polytetrafluorethylen Kappe mit Aceton, Ethanol und entionisiertem Wasser mindestens dreimal Fläschchen, und blasen Stickstoffgas gründlich in das Fläschchen, um Wasser zu entfernen. </li><li> Man löst 1 mg Phospholipid (zB Dioleoylphosphatidylcholin, DOPC) auf 1 ml Chloroform in dem Fläschchen auf 1 mg / ml Konzentration zu erhalten. Führen Sie dieses Verfahren in einem Abzug für die Sicherheit. Verwenden Sie niedrigere oder höhere Konzentrationen von Phospholipid-Lösung, falls erforderlich. </li><li> Farbstoff hinzuzufügen markierte Phospholipide (beispielsweise Rhodamin Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Rhodamin DPPE) mit weniger als 1 Mol-% des Phospholipids solution, um die Phospholipidschicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Führen Sie dieses Verfahren in einem Abzug für die Sicherheit. </li><li> Wickeln Sie das Fläschchen mit einem Polytetrafluorethylen-Band auf Lösungsmittelverdampfung zu verhindern, und lagern Sie die Probe in einem Gefrierschrank bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Abscheidung von Phospholipiden auf die Luft-Wasser-Grenz <ol><li> Reinigen einer Petrischale (55 mm Durchmesser und 12 mm Höhe) mit Ethanol und entionisiertem Wasser mindestens dreimal. </li><li> Füllen Sie die Petrischale mit 10 ml VE-Wasser, um ein Luft-Wasser-Grenzfläche zu schaffen. </li><li> Verteilt einige Mikroliter der Phospholipid-Lösung mit einer Mikrospritze auf ein sauberes Schnittstelle, um die gewünschte Flächenpressung zu erreichen, und eine Wartezeit von 30 min vollständig vor tut das Experiment verdampfe das Lösungsmittel. Hinweis: Ein Langmuir-Trog kann anstelle einer Petrischale verwendet werden, wenn eine genaue Steuerung der Oberflächendruck erforderlich ist. </li></ol></li></ol></li><li> Sun-Schnittstelle Druckmessung <ol><li> Messen Sie die Oberflächendruck des Phospholipid-Monoschicht mit einer Wilhelmy-Platte Tensiometer. Warten Sie mindestens 30 Minuten zu bekommen, das Filterpapier benetzt genug, wenn Filterpapier wird als ein Wilhelmy-Platte verwendet. Die ausführliche Protokoll ist in Kuhn et al. 20. </li><li> Einstellen der abgeschiedenen Menge des Phospholipid um den Oberflächendruck genau zu steuern. In 4 ul der DOPC-Lösung (1 mg / ml) auf die 30,25 cm 2 -Bereich der Schnittstelle, wenn ~ 5 mN / m der Oberflächendruck erforderlich ist. Hinweis: Wenn das Filterpapier nicht vollständig benetzt werden, ändert Oberflächendruck drastisch während der ersten 30 min des Versuchs aufgrund der Gewichtsänderung des Filterpapiers. </li></ol></li><li> Minimierung der Konvektionsströmung der Mono <ol><li> Verwenden Sie eine kegelförmige Vorrichtung, die eine 3 mm Reservoir mit zwei dünnen Kanälen enthält, zu einem großen Teil von der Petrischale verbunden ist, um die konvektive Strömung des zu unterdrückendie Monoschicht, die Morphologie Bildgebung und Oberflächendruckmessung stören können. </li><li> Achten Sie darauf, die Wasserstände zwischen der Innen- und Außenseite der Kegelform Gerät entsprechen, um sicherzustellen, dass Phospholipide frei bewegen über den gesamten Bereich vor dem Abscheiden Phospholipide auf die Luft-Wasser-Grenzfläche. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Phospholipid-Monoschicht an der gekrümmten Oberfläche eines Tropfens <ol><li> Verjüngende Prozess einer Glaskapillare mit Mikropipettenzieher <ol><li> Legen Sie eine Glaskapillare (od 1 mm, ID 0,78 mm, Länge 100 mm) auf einem Kapillarhalter einer Mikropipette Abzieher. </li><li> Entwerfen Sie ein Programm zum Ziehen der Kapillaren mit entsprechenden Parameterwerte (Heat: Rampe, Ziehen: 60, Vel: 70 Verzögerung: 70 und Druck 200) und die Kapillaren mit dem konzipiertes Programm nach Herstellerprotokoll zu ziehen. Anmerkung: Eine Kapillare Ende mit einigen Mikrometern Durchmesser ist erforderlich, um eine 100 &amp; mgr; m-Tröpfchen durch appl bildenying einen Druck mit ~ 10 kPa. Wenn das Spitzenende der Kapillare zu gering ist, viel höheren Druck,&gt; 600 kPa, ist erforderlich, um den Tropfen zu erhalten, während es schwierig ist, die Größe der Tröpfchen mit einem zu großen Kapillarspitze Ende zu steuern. </li></ol></li><li> Absorption von Phospholipiden auf der Tröpfchenoberfläche Hinweis: Um eine Phospholipidschicht an der gekrümmten Schnittstelle eines Tröpfchens bilden, ein Phospholipid-Lösung ohne Farbstoff markierte Phospholipide verwendet, um einen Intensitätskontrast zu erhalten, gegen die flache Monoschicht nach Verfahren 1 hergestellt Zusätzlich beide Verfahren 2.2.1 und 2.2 0,2 sind hier zulässig. Wenn eine präzise Steuerung der Oberflächendruck an der Tropfenoberfläche notwendig ist, wird Verfahren 2.2.2 sehr zu empfehlen. Aber wenn nicht, Verfahren 2.2.1, die eine viel einfachere Weise als Verfahren 2.2.2, ist nützlich. <ol><li> Beschichtungsverfahren von Phospholipiden an einem Spitzenende <ol><li> Reinigen einer Glasobjektträger unter Verwendung von Aceton, Ethanol und entionisiertem Wasser mindestens dreimal. </li><li> Place den sich verjüngenden Kapillare auf einem gereinigten Glasobjektträger, und kippen Sie die Kapillare zur Erleichterung der Berührung der Glasobjektträger mit einem spitzen Ende. </li><li> Fallen einige Tröpfchen von Phospholipid-Lösung (1 mg / ml) auf die Spitze einer Kapillare, die auf dem Glasträger mit einer Glasspritze angeklebt ist, und warten mindestens 30 min vollständig verdampfen des Lösungsmittels. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Spitze der Kapillare auf den Objektträger während des Verfahrens 2.2.1.3 haften, da der Umfang des Spitzenende zu klein ist, um das Tröpfchen der Phospholipide an der Endspitze nur durch Kapillarkraft zu halten. </li></ol></li><li> Herstellung eines Vesikellösung <ol><li> Reinigen Sie ein Fläschchen, und Wasser zu entfernen aus dem Fläschchen, wie in Verfahren 1.1.1.1 eingeführt. </li><li> Trocknen Sie eine 2 ml Volumen von Phospholipid-Lösung (1 mg / ml), indem Stickstoffgas sanft und trocknet das Fläschchen für 1 h bei RT zu beseitigen alle verbleibenden Lösungsmittels. Führen Sie dieses Verfahren in einem Abzug für die Sicherheit. </li><li> In 2ml VE-Wasser in das Fläschchen mit getrockneten Lipide, und Inkubation das Fläschchen in einem Ofen bei 60 ° C für 1 Stunde. </li><li> Schütteln Sie die Ampulle mehrmals, und beschallen (HF-Frequenz: Bis zu 40 kHz, Leistung: 370 W) für 30 Minuten, um Vesikel zu erhalten. </li><li> Zuführen Extrusion und Gefrier-Auftau-Prozesse, um monodisperse unilamellare Vesikel zu erhalten. Die ausführliche Protokoll zur Herstellung von Vesikeln in Mayer et al. 21 beschrieben. Anmerkung: Oberflächendruck der Tröpfchengrenzfläche genau durch Einstellen der Wartezeit nach der Bildung der Tröpfchen, das monodisperse unilamellare Vesikel enthält gesteuert. Verwendung einer Pendant Drop Methode 22, ist es notwendig, die Änderung des Oberflächendrucks nach der Zeit vor tut das Experiment zu messen. </li></ol></li></ol></li><li> Bildung eines Tröpfchens, das eine Phospholipidschicht an der gekrümmten Oberfläche enthält <ol><li> Füllen Sie das verjüngende Kapillare mit 10 ul entionisiertem Wasser aus procedure 2.2.1. Alternativ können Sie 10 ul der Vesikel-Lösung von Verfahren 2.2.2. </li><li> Verbinden die Kapillare an einem automatisierten Mikro Injektor, um den Druck, um das Tröpfchen zu bilden. </li><li> Halterung der Kapillare, die zu einem Mikro Injektor mit einem Mikromanipulator verbunden ist, um die Position der Kapillare genau zu steuern. </li><li> Bereiten Sie eine Hellfeld-Mikroskop (Mikroskop 1, Objektiv: 10x NA 0,3) zur Abbildung der Seitenansicht der Kapillare mit einer CCD-Kamera. Mikroskop 1 ermöglicht somit die exakte Position des Tröpfchens entlang der z-Achse zu beobachten war und die Größe der Tröpfchen. </li><li> Bewegen das Spitzenende zu einer Position, wo die Seitenansicht des vorderen Endes wird auch durch ein Mikroskop 1 visualisiert mit einem Mikromanipulator, und Anwendung einer variablen Druck (~ 100 hPa) mit dem Spitzenende der Kapillare, bis eine geeignete Größe (~ 100 &amp; mgr; m im Durchmesser) von Tröpfchen gebildet. Hinweis: Es wird empfohlen, automatisierte Mikro-Injektor und Mikromanipulator Nutzen seind, wenn eine Feinsteuerung der Tröpfchengröße und Ort des Tropfens erforderlich. Es ist auch möglich, eine manuelle Platte verwenden. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Fluorescence Recovery After Droplet Merging Anmerkung: Die Grundprinzipien dieses Protokoll sind identisch zu denen des FRAP-Technik, mit Ausnahme der Tropfenkoaleszenz Prozess. Die detaillierten Protokoll und verwandte Theorien der FRAP sind in A. Lopez et al. 15 und D. Axelrod et al. 16. <ol><li> Überwachen und Steuern der Position des Tröpfchens <ol><li> Bereiten Sie ein inverses Mikroskop gesetzt (Mikroskop 2, Objektiv: 10x NA 0,3, Rohr Linse: Brennweite 17 cm), die sowohl eine Fluoreszenzmikroskop ermöglicht mit einer geeigneten Filtersatz für Rhodamin-DPPES (Anregung bei 560 nm, Emission bei 583 nm) und eine Hellfeld-Mikroskop. Verwenden Sie eine CCD-Kamera hier zur Visualisierung der Draufsichten auf die Tröpfchen mit einem Fluoreszenzmikroskop mOde und eine Hellfeld-Mikroskop-Modus. </li><li> Bewegen des Tröpfchens mit einem Phospholipid mit einem flachen Luft Wasser-Grenzfläche entlang der Z-Achse überzogen, aber noch nicht das Tröpfchen verschmelzen unter Verwendung des Mikromanipulators. Verwenden Mikroskop 1 die Seitenansicht des Tröpfchens zu visualisieren. </li><li> Lokalisieren das Tröpfchen in der Mitte in der Draufsicht des flachen Monoschicht unter Verwendung des Mikromanipulators. Verwenden Sie das Hellfeld-Mikroskop-Modus des Mikroskop 2 zur Draufsicht auf flachen Monolage zu visualisieren. </li></ol></li><li> Zusammenführung der Tröpfchen auf die flache Luft-Wasser-Grenzfläche <ol><li> Bewegen Sie den Tröpfchen weiter in Richtung der flachen Schnittstelle, bis der Tropfen geht auf die Schnittstelle, mit der Mikromanipulator. Wenn die Zusammenführungsprozess erfolgreich war, ein dunkler Bereich mit einer Kreisform, die durch einen weißen Hintergrund umgeben ist, wird unter Verwendung des Fluoreszenzmodus des Mikroskops 2 beobachtet. </li><li> Notieren Sie sich die Reihe von Fluoreszenzbilder nach Zeit nach der Zusammenführung der Tröpfchen unter Verwendung der Fluoreszenz-Modus des Microsbewältigen 2. Verwenden Sie eine schnellere Bildrate als die Diffusionszeitskala der Monoschicht hier. In DOPC-Monoschicht, dauert es ein paar Minuten, um in die 200 &amp; mgr; m-Dunkel-Bereich vollständig diffundieren. </li></ol></li></ol> 4. Bestimmung der Diffusionskoeffizient durch Bildanalyse Hinweis: Um aus einer Reihe von Bildern zu bestimmen, der Diffusionskoeffizient, individuelles Programm zur Bildanalyse aufgebaut wie unten beschrieben. Eine detaillierte Quellcode dieses Programms ist in JoVE Website. <ol><li> Nachweis von einem kreisförmigen Bereich von Interesse <ol><li> Detektion der Mitte der Region von Interesse <ol><li> Besorgen Sie sich eine Reihe von Fluoreszenzbilder, die während eines Wiederherstellungsprozesses, der einen kreisförmigen dunklen Bereich und einem weißen Hintergrund enthält aufgezeichnet worden sind, und legen Sie das erste Bild der Serie als ein Referenzbild. Hier ist R D der Radius des dunklen Bereich in einem Bezugsbild. </li><li> Konvolut das Referenzbild mit einem weißen Kreis, diese Intensität gleichförmig über eine ganze Region. Verwenden Sie eingebettete Funktion namens &#39;CONV2&#39; für die Faltung, wie in der Quellcode der maßgeschneiderte Programmzeile 124. Hier gezeigt wird, ist der Radius des weißen Kreises etwas kleiner als R D. </li><li> Finden Sie eine Position, die einen Minimalwert in der Faltungsberechnung zeigt, und setzen Sie diese Position als Zentrum der Region von Interesse in dem Referenzbild. </li></ol></li><li> Bestimmen eines Radius der Region von Interesse <ol><li> Konvolut das Referenzbild mit einem weißen Kreis, die eine Mittelstellung, nach einem Verfahren 4.1 und gleichmäßige Intensität über eine ganze Region ermittelt enthält. Hier ist R S der Radius des weißen Kreises. Verwenden Iteration wie &#39;for&#39; oder &#39;while&#39; mit Gleichung eines Kreises um den weißen Kreis, wie in den Quellcode des Anwenderprogrammzeile 102 bis 109 dargestellt werden. </li><li> Konvolut das Referenzbild mit einem anderen weißen Kreis, die eine etwas hatgrößeren Radius (5% -10%), R L, als R S. Verwenden Sie dieselbe Methode mit Verfahren 4.1.2.1, um den Kreis, wie in der Quellcode der maßgeschneiderte Programmzeile 113 bis 120 dargestellt werden. </li><li> Besorgen Sie sich die Wertdifferenz zwischen den beiden Faltungsberechnungen 4.1.2.1 und 4.1.2.2. </li><li> Wiederholen der vorstehenden Verfahren von R S = R D / 2 R S = 2R D, durch Erhöhung sowohl der R S und R L mit einem Pixel-Ebene. Stellen Sie eine Iteration, die gesamten Quellcodes von Verfahren 4.1.2.1 enthält, um 4.1.2.3 zu wiederholen. </li><li> Finden Sie den Radius R S, die die maximale Wertunterschied zwischen den beiden Faltungsberechnungen zeigt. Verwenden Sie eingebettete Funktion mit dem Namen &#39;max&#39;, um den Radius zu finden gibt die maximale Differenz der Werte wie in den Quellcode des Anwenderprogrammzeile 148 bis 149. gezeigt Diese Rs zeigt somit an den Radius des dunklen Bereich in dem Referenzbild. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Berechnung einer Bruchstärke <ol><li> Legen Sie einen Kreis, der eine Mittelposition und einen Radius von 4,1 Verfahren als eine Region von Interesse bestimmt, enthält. </li><li> Berechnen der durchschnittlichen Intensität der dem interessierenden Bereich in einer Reihe von Fluoreszenzbildern nach der Zeit. Convolute jedes Rahmens mit dem Bereich von Interesse und teile es durch Fläche des Bereichs von Interesse, den mittleren Intensitäts berechnen. Die Einzelheiten sind in den Quellcode des Anwenderprogramms, die in JoVE Website ist. </li><li> Berechnen eines Bruchintensität, definiert als die nachstehende Gleichung, wobei F (t) ist die mittlere Intensität im Kreis, der einen interessierenden Bereich nach der Zeit, M i der Ausgangsintensität in dem Kreis und F o die Intensität einen weißen Hintergrund. f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (Gleichung 1). </li></ol></li><li> Einbau der fractional Intensität FRAP Theorie <ol><li> Den Bruch Intensität, mit der folgenden Gleichung, wo τ ist eine charakteristische Diffusionszeit und I 0, I 1 sind Besselfunktionen modifiziert, mit einem passenden Programm und erhalten τ <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Gleichung 2). </li><li> Erhalten einen Diffusionskoeffizienten basierend auf der Beziehung, τ = eine 2/4 D, wobei D der Diffusionskoeffizient und a der Radius des dunklen Bereich. Anmerkung: Während des Anpassungsprozesses, ist es möglich, den Bruchintensitätsprofil entlang einer Zeitachse zu verschieben, wenn der Wiederherstellungsvorgang bereits begonnen hat, vor dem Aufzeichnen der Bilder. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interest.

FRAM teilt eine Menge von grundlegenden Prinzipien mit FRAP, vor allem für die Messung der Fluoreszenz Erholung nach dem Bleichen einen bestimmten Bereich, aber FRAM verwendet einen Prozess der Zusammenführung ein Tröpfchen auf die flache Schnittstelle, einen gebleichten Bereich zu bilden, anstelle der Anwendung ein intensives Licht. Der Zusammenführungsprozess ist somit wichtigste Schritt im FRAM und vor allem die Form der dunklen Fleck auf dem flachen Monoschicht nach dem Zusammenführen eines Tröpfchens bestimmt die Genauigkeit der Diffusionsmessung. Insbesondere auf der Grundlage einer aktuellen Methode, wir nur den Kreis mit einem Radius R festgelegt als ein Bereich von Interesse, um die durchschnittliche Intensität der dunklen Fleck, in Verfahren 4 gezeigt zu berechnen, und wenn es eine zu starke Abweichung von der Kreisform, dies würde die genaue Messung des Diffusionskoeffizienten stören. Daher ist es notwendig, einen kreisförmigen dunklen Bereich zu erhalten, aber nicht kreisförmigen Formen werden manchmal aus verschiedenen Gründen gebildet. Erstens, wenn es eine konvektive Strömung in dem Haustierri Schale wird die Form des dunklen Bereichs entlang der Strömungsrichtung langgestreckt ist. Wie in Verfahren 1.3 erwähnt, hilft eine Kegelform Gerät, um die konvektive Strömung zu unterdrücken, und diese Dehnung minimiert werden würde. Zweitens, wenn das Spitzenende der Kapillare die flache Schnittstelle während eines Zusammenführungsprozess berührt, der dunkle Bereich ist mit einer Vielzahl von Formen gebildet, da die Kapillare Ende der Zusammenführungsprozess unterbricht. Mit dem Erwerb einer Tröpfchen, die nur hängen vom Ende der Kapillare, kann diese Unterbrechung verhindert werden. Insbesondere eine Hydrophobierung der Kapillare unterstützt die Tröpfchen am Ende der Kapillare sitzt. Daher obigen Probleme Schießereien und Modifikationen ermöglichen uns, Diffusionseigenschaften genauer zu messen. Dieses gut Störungsbehebung Verfahren erlaubt somit FRAM, mehrere wesentliche Vorteile gegenüber FRAP haben. Zuerst FRAM erfordert einfachere Geräte im Vergleich zum FRAP. Für FRAM, die ausreicht, um eine einfache Fluoreszenz Mikros benutzen ist esgerecht zu werden, statt eines teuren konfokalen Mikroskop mit einem Hochleistungslaser, dessen Wellenlänge muß mit dem Absorptionsspektrum des Farbstoffes zu treffen. Darüber hinaus ist es notwendig, eine zusätzliche Vorrichtung verwenden, um die Größe auf dem gebleichten Bereich im FRAP einzustellen, während der FRAM steuert die Größe der Fläche, durch Einstellen der Größe der Tröpfchen oder der Oberflächendruck an der Tropfenoberfläche. Zweitens ist es möglich, verschiedene Arten von Farbstoffen in FRAM verwenden. FRAP verwendet nur Farbstoffmoleküle, deren Bleichverfahren ist viel schneller als die Diffusionsprozesses. Wenn während des Bleichprozesses die Diffusion der Farbstoffe auftritt, ist es schwierig, die Diffusionseigenschaft genau zu schätzen. Der FRAM, jedoch nicht ein Verfahren zum Bleichen von Farbstoffen erfordern, und dies ermöglicht somit die Verwendung von verschiedenen Arten von Farbstoffen in der Fluoreszenz-Bildgebungs. Darüber hinaus ist die FRAP erfordert zusätzliche Hochleistungslasern und Filtersätze, um die Farbstoffspezies verändern, während es nur notwendig ist, um die Filtersätze in der FRAM ersetzen. EndlichDa die Monoschichten an der Tropfenoberfläche und der ebenen Schnittstelle kann unabhängig ausgebildet werden, wodurch die Untersuchung von Interdiffusion oder Vermischung zwischen zwei Lipid-Monoschichten durch Zusammenführen A-Typ Monoschicht B-Typ-Monoschicht, während die FRAP misst nur die Selbstdiffusion einer Monoschicht. Trotz dieser Vorteile kann der Prozess der Zusammenführung ein Tröpfchen auf eine flache Luft-Wasser-Grenzfläche diese Technik möglicherweise begrenzen auf mehrere Fragen, die von Bedeutung sein könnten, wie beispielsweise ein Oberflächendruck Missverhältnis zwischen den beiden Monoschichten, die Zeitskala der Zusammenführungsprozess und eine Erhöhung des Oberflächendrucks des flachen Monoschicht nach dem Zusammenführen Tröpfchen. Diese Probleme jedoch nicht signifikant auf die Diffusionsmessung aus den folgenden Gründen. Erstens, auch wenn die Oberflächendrücke an den beiden unterschiedlichen Monoschichten sind sehr unterschiedlich, eine Gleichgewichtseinstellung in einem sehr frühen Stadium bei der Wiederherstellung abgeschlossen ist. Wenn beispielsweise ter Oberflächendruck der Monoschicht an der Tropfenoberfläche ist höher als der der Monoschicht an der flachen Luft-Wasser-Grenzfläche, dehnt der dunkle Bereich, bis der Oberflächendruck ausgleicht. Da dieses Verfahren innerhalb von 10 ms beendet ist, wird der Oberflächendruck equilibriert, bevor es beeinflusst die Diffusion. Zweitens, wenn der Zeitmaßstab der Zusammenführungsprozess schnell genug ist, es nicht die Diffusionsmessung begrenzen überhaupt. Glücklicherweise ist eine typische Zusammenführungsprozess auch innerhalb von 10 ms abgeschlossen. Schließlich ist sogar mehrere Verschmelzen der Tröpfchen auf die flache Grenzfläche nicht den Oberflächendruck, da die Oberfläche des Trogs erhöht wesentlich größer ist als die Oberfläche des Tropfens. Entsprechend den Größen der Mulde und die Tröpfchen in dem Protokoll beschrieben, ist die Fläche pro Molekül erhöht weniger als 0,015% durch Zusammenführen eines Tröpfchens. Dementsprechend ist die Erhöhung der Oberflächendruck aufgrund der Änderung der Fläche pro Molekül weniger als 0,1%, das ist negligible weil sie viel kleiner als die typischen Fehler im Oberflächendruck, wie von Wilhelmy-Platten-Tensiometers gemessen. Zusammenfassend haben wir eine neue Methode, um die laterale Diffusion Eigenschaft eines Phospholipid-Monoschicht durch die Zusammenlegung eines Tröpfchens Monoschicht auf der flachen Schnittstelle zu messen. Diese Technik erfordert eine relativ einfache Ausrüstung und ermöglicht auch die Verwendung von verschiedenen Arten von Farbstoffspezies. Der FRAM ist daher potentiell geeignet für Diffusions Messung einer oberflächenaktiven Mitteln, einschließlich Phospholipide, Blockcopolymere, Proteine ​​und auch Nanopartikel in einem Flüssig-Flüssig-Grenzfläche. Darüber hinaus erwarten wir, dass die FRAM bietet einen neuen Weg, um die Interdiffusion oder Vermischung zwischen zwei verschiedenen oberflächenaktiven Mittel zu untersuchen.

<html> Phospholipide sind wichtige Bestandteile der Zellmembranen und die Membranen von Organellen, und die Fließfähigkeit dieser Membranschichten oft auf Zellfunktionen durch Veränderung der Aktivität von Membranproteinen 1-3. B. Membran &#160; Lipidhomöostase durch Regulieren Membranfluidität, die von Membranproteinen detektiert wird erreicht, und ein ungewöhnlich hohes Fließvermögen verursacht schwere Krankheiten, wie Fettleber und Cholestase 4. Zusätzlich Fluidität einer Phospholipidschicht an der Luft-Fluid-Grenzfläche Alveolen hat wichtige Auswirkungen auf seine Funktionen. Hohe Fluidität des Lungensurfactant Phospholipidschicht erleichtert Ausbreiten der Schicht während der Inhalation, während eine geringe Fließfähigkeit ermöglicht die Schicht in den Alveolen während der Ausatmung 5,6 bleiben. Es ist daher wichtig, die Fließfähigkeit der Phospholipidschichten abzuschätzen, ihre Rollen zu verstehen. _content &quot;&gt; ein direktes Maß für die Fließfähigkeit ist, die Viskosität und die Viskosität der Phospholipidschichten wurde durch die Verwendung von Mikrometergröße Kolloide 7, magnetische Nadeln 8,9 und magnetische Mikrotasten 6,10,11 gemessen. Diese Techniken sind relativ steifen Folien begrenzt und kann nicht weniger viskose Filmen zu messen. In solchen Fällen wäre Diffusivität eine Alternative zur Fluidität Phospholipidschichten quantifizieren. Seit mehreren Jahrzehnten wurden eine Vielzahl von Techniken, um die Diffusionseigenschaften der Phospholipidschichten messen entwickelt, wie Fluoreszenz Abschreckverfahren 12, gepulster Feldgradient NMR 13 und die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) 14. Eine der repräsentativen Methoden fluorescence recovery after photo (FRAP) 15,16. Aufgrund der Einfachheit des Messverfahrens und der damit verbundenen Theorien, mehrere Studien über die Diffusionseigenschaften Phospholipidschichten wurden durchgeführt unter Verwendung FRAP <sup&gt; 17-19. Allerdings FRAP erfordert in der Regel eine teure konfokalen Mikroskop Setup mit einem Hochleistungslaser. Hier präsentieren wir eine neue Technik, um die laterale Diffusion von Phospholipid-Monoschichten, als Fluoreszenz bezeichnet Erholung nach der Zusammenführung (FRAM) zu messen. Der wesentliche Unterschied zwischen FRAP und FRAM ist, dass die Photobleichschritt wird durch das Zusammenwachsen von Tropfen ersetzt. Zusammenführen eines Tröpfchens durch nicht-Fluoreszenz-Monoschicht abgedeckt auf eine fluoreszenzmarkierte flache Monoschicht hinterlässt einen kreisförmigen dunklen Fleck auf einem hellen flachen Monoschicht, wodurch die Einrichtung des gleichen Anfangszustand mit dem Photobleichschritt. Wir beobachten dann die Fluoreszenz-Erholung in den dunklen Fleck mit der Zeit, um die laterale Diffusionsfähigkeit zu messen. Diese neue &quot;Bleichen&quot; Schritt Tropfenkoaleszenz bietet erhebliche Vorteile gegenüber FRAP: FRAM erfordert nur eine Fluoreszenzmikroskop anstatt eines teuren konfokalen Mikroskop mit einem Hochleistungslaser, die für FRAP notwendig ist. ichn Darüber hinaus hat FRAM eine breite Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen, da sie nicht die Photobleichprozess einzubeziehen. Schließlich können die zwei unterschiedlichen Monoschichten ein Tröpfchen Monoschicht und einer flachen Monoschicht können unabhängig hergestellt werden, so dass die Interdiffusion zu messen, wobei FRAP misst nur die Selbstdiffusion von Monoschichten. FRAM bietet eine breite Palette von Diffusionsmessungen von hochviskosen Materialien auf nahezu reibungsfreie Materialien. Prinzipiell kann FRAM die maximale Diffusionsvermögen von 10 6 &amp; mgr; m 2 / sec, die vergleichbar ist mit existierenden Techniken zu messen, wenn die Diffusion während der Zeit für den Abfall Koaleszenzprozeß (~ 10 ms), tritt über die Fläche 100 um 100 um. Darüber hinaus kann langsamen Diffusionsprozesses leicht gemessen werden, es sei denn Monoschichten sind fest. FRAM kann für beliebige Arten von oberflächenaktiven Materialien, solange geeignete fluoreszenzmarkierten Molekülen zur Verfügung stehen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1288">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:269px;">OCI corporation</td>
			<td style="width:251px;">Acetone 3.8L Extra Pure</td>
			<td style="width:552px;">Purity: &#8805; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethanol</td>
			<td>OCI corporation</td>
			<td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td>
			<td>Purity: &#8805; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Deionized water/Water purify system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli-Q liocel</td>
			<td>&#62;18.2 M&#937;&#903;cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Chloroform</td>
			<td>LiChrosolv</td>
			<td>Chloroform ultrapure (A3633)</td>
			<td>Purity: &#8805; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine DPPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C, 810158P</td>
			<td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wilhelmy plate tensiometer</td>
			<td>R&#38;K ultrathin organic film technology</td>
			<td>Wilhelmy tensiometer</td>
			<td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-injector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Femtojet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Micromanipulator 5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 1</td>
			<td>Objective lens: Olympus</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope 2</td>
			<td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td>
			<td>Objective lens: UPlanFl 10x</td>
			<td>Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 1</td>
			<td>Jai</td>
			<td>CV 950 camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD for Microscope 2</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter set</td>
			<td>Chroma technology</td>
			<td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td>
			<td>Prepare suitable for dye molecules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>Wiseclean WUC-D06H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Eine Serie von Fluoreszenzbilder wurden mit der Zeit während der Wiederherstellung nach dem Zusammenführen ein Tröpfchen mit einer DOPC Monoschicht beschichtet auf eine flache DOPC Monoschicht erhalten wurde, wie in Figur 1 aufgeführt. Die DOPC Monoschicht an der flachen Luft-Wasser-Grenzfläche wurde mit geringen Mengen von dotiertem Rhodamin-DPPE und dieses somit wurde es möglich, einen Hintergrund mit einer hellen Farbe und einem dunklen Bereich neu an das flache Schnittstelle hinzugefügt visualisieren. Es wurde ein Recovery-Prozess auf 23 mN / m fester Oberflächendrucks beobachtet. Eine Anpassung von Gleichung 1, um die Änderung der Bruchintensität nach der Zeit ist in Abbildung 2 dargestellt. Der R 2 -Wert von diesem Sitz ist 0,999 und dieser Sitz noch funktioniert gut, auch bei niedrigeren oder höheren Flächenpressungen. Der Diffusionskoeffizient der DOPC-Monoschicht auf dieser fit betrug 27,54 &amp; mgr; m 2 / s bei 23 mN / m Oberflächendruck. Zur weiteren Validierung des FRAM, Diffusionskoeffizienten des DOPC und Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) Monolayer wurden nach Oberflächendruck gemessen. Wie in 3 gezeigt ist, erfasst FRAM die rasche Abnahme der Diffusionskoeffizient des DPPC-Monoschicht auf ~ 9 mN / m Oberflächendruck, wobei eine LC (Flüssigkeit kondensiert) - LE (flüssig expandiert) Phasenübergang 10, und die Werte von Diffusionskoeffizienten sind ebenfalls gut mit den zuvor Messungen durch Peters et al. 19 vereinbart. Zusätzlich wurde ein exponentielles Abklingen des Diffusionskoeffizienten der Oberflächendruck in der DOPC Monoschicht beobachtet wird, und diese Tendenz ist nahezu identisch mit dem von Caruso et al. 12 gemessen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des FRAM (Fluoreszenz-Erholung nach dem Zusammenführen) -Technik. Wie der Lippeid Monoschicht beschichtet Tröpfchen auf flache Luft-Wasser-Grenzfläche zusammengeführt, die Lipidmonoschicht ohne Fluoreszenz-markierten Lipid in flachen Leuchtstofflipidmonoschicht eingelegt. (B) Fluoreszenzmikroskop Bilder mit der Zeit bei der Wiederherstellung einer DOPC-Monoschicht auf 23 mN / m der Oberflächendruck (Maßstab = 100 &amp; mgr; m). Der dunkle Bereich des DOPC-Monoschicht vollständig durch den Diffusionsprozess innerhalb weniger Minuten wiederhergestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fractional Intensität als Funktion der Zeit. Schwarze Kreise und die graue gestrichelte Linie zeigen die Werte für Spitzenintensitäten von Bildanalyse (Verfahren 4.1 und 4.2) und die Anpassung von Gleichung 1 zu den Bruch Intensitäten mit der Zeit erhalten wird,in Verfahren 4.3 gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> Abbildung 3. Diffusionskoeffizienten von DOPC (Dreieck) und DPPC (leeres Quadrat) Monoschichten als Funktion der Flächenpressung. Die Leitungen mit dem hellen grauen Farbe und mit der dunkelgrauen Farbe geben die Werte des Diffusionskoeffizienten zuvor von Peters et al. und Caruso et al., auf. Diese Zahl wurde von Jeong et al. 23 geändert. Mit freundlicher Genehmigung von Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14.369-14.374 nachgedruckt. Copyright 2014 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a>e, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Serie: Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

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Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...