Name: step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Leonid Volkov und Éric Bouchard für ihre anwendungstechnische Beratung über Epifluoreszenzmikroskopie danken. Finanzielle Unterstützung Finanziert von der kanadischen Institutes of Health Research (Zuschuss # MOP-93781) zu GB

Tierpflege war in Übereinstimmung mit der Université de Sherbrooke Animal Care und Verwenden Ausschuss. 1. Rohrvorbereitung <ol><li> Am Tag vor der Zellsortierung, 1-2 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu 5 ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden und auf 15 ml und 50 ml-Polypropylen-konischen Röhrchen. Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr in der Protokoll ist beschichtet. Hinweis: FBS Beschichtung verhindert Keimzellen vom Kleben an Rohrwänden. </li><li> Langsam Einmischen O / N durch Inversion bei 4 ° C zur Beschichtung der Rohre gleichförmig unter Verwendung eines Rotators. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen FBS aus beschichteten Röhrchen durch Dekantieren. <ol><li> * Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die 5-ml-Polypropylenrundrohre und die 15 und 50-ml-Röhrchen für Zellzubereitung verwendet (Protokoll Schritte 2,1-2,11) vollständig von FBS zu entleeren, um Fanning (dh ungenaue Abweichung der Seitenströme) zu verhindern. Verwenden Sie ein P200-Pipette, um die FBS zu entfernen. <br/&gt; Hinweis: Rest FBS in Rohren vor dem Sortieren kann zu einem Verlust von Zellen oder Kontamination anderer Rohre während der Zellsortierung verwendet werden, führen, </li><li> Lassen Sie eine kleine Restvolumen von FBS (etwa 100-200 &amp; mgr; l) in der 5 ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen zum Sammeln gereinigten Zellen verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Zellpräparation <ol><li> Opfern eine männliche Maus unter Narkose mit O 2 / Isofluran (Induktion bei 5% dann bei 2% gehalten), gefolgt von CO 2 Ersticken. </li><li> Verbrauchsteuern und decapsulate beide Hoden und Hackfleisch mit einer kleinen Schere in 500 ul Sortierpuffer in ein 1,5-ml-Tube. </li><li> Flush Keimzellen aus Samenleiter durch leichtes nach oben und unten Pipettieren in der 1,5-ml-Röhrchen, zuerst mit einer abgeschnittenen 100-1000 ul Spitze, und dann mit einem intakten 100-1000 ul Spitze. </li><li> Entfernen Sie die Ablagerungen und Klumpen von einem Filtrationsschritt unter Verwendung eines 40 &amp; mgr; m Zellsieb und sammeln Filtrat in das 50 ml konischen Röhrchen zurückiously mit FBS in Schritt 1 überzogen. </li><li> Das Filter einmal zu waschen mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von 3 ml und Transfer Filtrat in 15 ml konischen Röhrchen zuvor in Schritt 1 beschichtet. </li><li> 16 ul 50 mM EDTA pH 8 pro ml Zellsuspension (48 &amp; mgr; l für 3 ml), um eine Endkonzentration von 0,8 mM EDTA erhalten. </li><li> Um dies zu beheben Keimzellen, langsam 3 Volumina eiskaltem 100% Ethanol mit einem 10-ml-Pipette unter leichtem Schütteln (Vortex bei niedriger Geschwindigkeit), die eine milchige Suspension erzeugt. Kritischer Schritt: Langsame Zugabe Ethanol ist entscheidend und wichtig, um die Integrität der Zellpräparation zu erhalten. Wir haben festgestellt, dass eine schnelle Zugabe von Ethanol verursacht Zelllyse was zu einer großen Abnahme der Sortiereffizienz. Für einen 3 ml Zellsuspension sollte 9 ml Ethanol in ca. 1 min zugefügt werden. </li><li> Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min unter gelegentlichem Mischen durch Umdrehen. </li><li> Centrifuge Zellsuspension bei 800 xg für 5 min und entfernen Sie die klareÜberstand. </li><li> Vorsichtig resuspendieren festen Keimzellen in 2 ml Sortierpuffer. </li><li> In 4 ul SYTO16 DNA-Farbstoff (1 mM Lösung in DMSO) und Inkubation für mindestens 30 min (lichtgeschützt). Hinweis: Die besten Ergebnisse werden mit Sortier SYTO16 da es eine durchlässige DNA-Farbstoff, der leicht in die stark verdichteten Kerne von Spermatiden eingebaut erhalten. </li></ol> 3. Cell Sorter einrichten Hinweis: Hier ein 4-Laser (405 nm - violett, 488 nm - blau, 561 nm - gelb-grün, 633 nm - rot) 20-Parameter BDFACSAria III Zellsortierer verwendet. Der BD FACSDiva 6.1.3 Software dient zur Visualisierung und Analyse der Daten. Die Einstellungen können abhängig von der Art von Sortierer variieren. <ol><li> Sterilisieren Sie die FACS-Sorter, indem Sie 70% Ethanol als Mantelflüssigkeit während der Fluidik Shutdown-Vorgang (Menü &quot;Cytometer&quot; in der Software) vor der Sortierung. Wählen Sie &quot;Cytometer&quot; in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie &quot;Fluidic shutdown &quot;. Folgen Sie den durch die Prozesse genannten Schritte. </li><li> Vorzubereiten und zu filtern 1x PBS mit einem 0,22 um-Filter, um jegliche Kristalle und Verunreinigungen zu beseitigen. Füllen der Hülle mit dem oberen Tank Schweißlinie auf der Innenseite des Tanks. </li><li> Starten Sie die Software und melden Sie sich an. Starten Sie den FACS-Sorter, um vor der Sortierung Aufwärmen der Laser für mindestens 30 min. Führen Sie zwei fluidische Startprozesse von den Fluidik spülen, die Ethanol. Wählen Sie &quot;Cytometer&quot; in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie &quot;Fluidic startup&quot;. Befolgen Sie die von den Prozessen genannten Schritte. Hinweis: Diese stellt Fluidik mit normaler Hüllflüssigkeit (1x PBS). </li><li> Reinigen Sie die Sortierblock und die Ablenkplatten mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie gründlich. Beschallen eine 100 &amp; mgr; m Düse in einem Rohr aus destilliertem Wasser für 2 Minuten in einem Ultraschallbad gestellt. Wischen Sie die Düse gründlich. </li><li> Legen Sie die 100 &amp; mgr; m Düse in die Durchflusszelle und drehen Sie die Düse-Verriegelungshebel im Uhrzeigersinn, um die 12-hr Position. Stellen Sie den Mantel Druck auf 20 psi. </li><li> Schalten Sie den Strom und stellen Sie die Amplitude, um Zielwerte für Frequenz (rund 30) zu erhalten, Tropfen 1 (um 150) und Gap (rund 12) und um eine stabile Tröpfchenabbruchmuster (einige Satellitentropfen) zu etablieren. Schalten Sie Dämpfung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Strom ist gerade und mittig auf dem Abfall Absauger durch Veränderung des Winkels der Art Block. Hinweis: Eine 130 &amp; mgr; m Düse bei 10 psi wurde ebenfalls getestet und kein offensichtlicher Unterschied gefunden wurde. </li><li> Set Laserverzögerung auf 0 für den blauen, -77,39 für den roten, 37,33 für die violetten und -39,85 für die gelb-grünen Lasern. </li><li> Set Bereichen Skalierung auf 1,14 für die blaue, 1,0 für den roten, 0,75 für die violetten und 0,96 für die gelb-grünen Lasern. </li><li> Verwendung eines Test Sort (im Fenster &quot;Nebenstrom&quot; der Software), stellen Sie sicher, dass die Nebenströme nicht schüren. Im Fenster &quot;Nebenstrom&quot;, passen Sie die Schieberegler, Spannungs jeder Nebenstrom, so dass sie die middl getroffene von Testsammelröhrchen. Wenn die Mitte-Stream ist nicht fest, passen Sie die 2., 3., und 4. Tropfen-Einstellungen, um das Zentrum Strom zu begrenzen. </li><li> Starten Sie das Setup-Cytometer und Tracking (CS &amp; T) Anwendung in der Software (Menü &quot;Cytometer&quot;). </li><li> Verwenden Sie die Zytometer Einrichtung und Tracking-Kügelchen bei 1 Tropfen je 350 &amp; mgr; l, um die Charakterisierung und Verfolgung der Zytometer Leistung durch Herstellerangaben zu automatisieren. </li><li> Beenden Sie das CS &amp; T-Anwendung. Übernehmen CS &amp; T-Einstellung sicher, dass die Stromparameter eine stabile Tröpfchenabbruchmuster immer noch erlauben, und schalten Sie den Sweet Spot-Taste nach Herstellerangaben (in der &quot;Abbruchfenster&quot;). </li><li> Optimieren Sie die Tropfen-Verzögerungswert unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen (siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Installieren Sie die Sammelröhrchen in den Halter. Öffnen Sie die Art Blocktür. Im Fenster &quot;Nebenstrom&quot;, schalten Sie Spannung wählen Sie dann &quot;Test-Art &quot;und klicken Sie auf den Aspirator Drawer-Taste, um die Lade zu öffnen und Zugang zu den Sammelröhrchen. </li><li> Optimieren Sie die Seitenströme, so dass sie in die Mitte des Rohres zu gehen. Einstellen von Werten und Schieberegler nach Bedarf. </li><li> Schließen Sie die Art Blocktür und stellen Sie sicher, um die Messuhr anpassen, um die hellsten Perle Ort in der Mitte zu erhalten. Unselect Abfallschublade, Test Art und Spannung. Die Sammelröhrchen zu entfernen. </li><li> Optimieren Sie das Drop-Verzögerung nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Kurz schütteln Wulst Fläschchen kräftig und verdünnter 1 Tropfen Perlen in 0,5 ml PBS. </li><li> Verwenden von Anweisungen des Herstellers, setzen Sie das Drop-Verzögerung mit der Tröpfchenverzögerungs Experiment Vorlage in der Software verfügbar. Alternativ können Sie die Auto-Tropfen-Verzögerungsfunktion, um die Drop Verzögerung einstellen. </li><li> Legen Sie das Rohr des fluoreszierenden Kügelchen und stellen Sie die Durchflussrate, bis die Schwellenwertrate ist ~ 3000 bis 4000 Ereignisse / Sekunde. Legen Sie die Sortiergenauigkeit zu &quot;Initial&quot; und letztely zur &quot;Feinabstimmung&quot; im Fenster &quot;Layout Sortieren&quot;. Wählen Sie das optische Filter und Sortier Perlen. Stellen Sie die Drop-Verzögerung, bis ~ 100% werden nach links sortiert. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass Zellen von Interesse Art in einem Seitenstrom. Die Kügelchen und das optische Filter verwendet Nähe einer 100% Tröpfchenabweichung zu erzielen. </li></ol></li></ol></li><li> Legen Sie eine FSC 1.5 ND (Neutraldichte-Filter) am linken Ende des FSC Detektorblock. Stellen Sie das Fenster-Erweiterung bis 2,00 &amp; mgr; s und der FSC Bereich Skalierung auf 1,00 (im Register &quot;Laser&quot; im Fenster &quot;Cytometer&quot;). </li><li> Vor dem Laden Probenröhrchen, legen Sie eine Probe Filterlinie von 50 um am Ende der Probenleitung, um Klumpenbildung zu vermeiden. Um dies zu tun, wählen Sie &quot;Ändern Probe Filter&quot; im Menü &quot;Cytometer&quot;. </li><li> Testen der Zusammensetzung der Probenflüssigkeit, um eine gute Trennung ohne Auffächern zwischen den Seitenstrom zu erreichen und um die Zellen ein Anhaften an die Polypropyle verhindernne Rohre. <ol><li> Laden Sie das Probenröhrchen, schalten Sie den Ablenkplatten und wählen Sie &quot;Test Art&quot; mit die Schublade geschlossen ist. Schauen Sie sich Seitenströme, wenn die Trennung erfolgt, ohne zu viel Fanning. Anmerkung: Fanning wahrscheinlich aufgrund einer hohen Proteinkonzentration in der Probenpuffer. </li></ol></li><li> Laden Sie das Probenröhrchen in die FACS-Instrument. Wählen einer Probe Rühren mit 300 Umdrehungen pro Minute und einer Probentemperatur von 4ºC. Wählen Sie &quot;Acquire Data&quot; in der &quot;Acquisition-Dashboard&quot;. </li><li> Wenn nötig, verdünnen die Probe, um einen geeigneten Ereignisrate auf maximal 5.000 Veranstaltungen / s (bei einer maximalen Durchflussrate von 3,0) zu erreichen. Streng an diese Grenzen, so daß die Reinheit der sortierten Zellen aufrechtzuerhalten. </li><li> Zu analysieren und zu sortieren, die Zellen, die Optimierung der FSC Schwellenwert, um Schmutz, ohne sich mit der Bevölkerung von Interesse zu beseitigen. Im logarithmischen Maßstab, damit Einstellung der Spannung der Photomultiplierröhre (PMT) Detektor mit dem 530/30 Filtersicher, dass das Fluoreszenzsignal der Gesamtbevölkerung passt innerhalb der Skala und Gate auf dem positiven Population (Abbildung 1, Gate 1). </li><li> Produzieren eine Forward Scatter-Bereich (FSC-A) / Side Scatter-Bereich (SSC-A) Plot des SYTO16 positive Bevölkerung und stellen Sie die FSC-A auf etwa 110 V im linearen Skala und die SSC-A auf etwa 150 V im logarithmischen Maßstab, um alle Ereignisse zu visualisieren, während ohne sehr große Zellen und Zellaggregate. </li><li> Im Fenster &quot;Sortieren Layout&quot;, stellen Sie den &quot;Sortieren Präzisionsmodus&quot; auf &quot;4-Wege-Reinheit&quot; (Yield Maske: 0, Reinheit Maske: 32, Phasenmaske: 0). Wählen Sie aus dem Menü &quot;Ziel-Events&quot; für die kontinuierliche Sortierung &quot;Continuous&quot;. </li><li> Hinzufügen Populationen auf dem Gebiet entsprechend den Rohren zu sortieren (im Fenster &quot;Sort Layout&quot;). Stelle Populationen mit höheren Frequenzen in der Mitte und die mit niedrigeren Frequenzen an den Enden. Stellen Sie die Spannungsplatten bis 2500 V. Bei Sortierung, halten Sie die Probensammlung tUBEs auf Eis. </li></ol> 4. Zellsortierung <ol><li> Unmittelbar vor dem Sortieren, Filterzellen unter Verwendung eines Filters 50 &amp; mgr; m in einem zuvor beschichteten 5 ml Polypropylen-Rundrohr. </li><li> Den Filter ausgiebig waschen mit 1-2 ml Sortierpuffer. </li><li> Sortieren festen Keimzellen unter Verwendung eines 488 nm-Laser ausgestattetes Zellsortierer nach dem Gating-Schema in Abbildung 1 beschrieben. Collect gereinigten Fraktionen in 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen zuvor in Abschnitt 1 auf Eis überzogen. <ol><li> Sicherstellen, dass 100-200 ul FBS in den Sammelröhrchen gehalten werden, um ein Verkleben der sortierten Zellen an der Rohrwand zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von SYTO16 wird sättigen, um Fluoreszenzfluktuationen während des Sortierzeit zu vermeiden. SYTO16 wird sättigt, wenn es keine weitere Veränderung der Zellfärbung Intensität am Alexa Fluor 488-Parameter (DNA-Färbung) in den Sortier Grafik. Falls erforderlich, fügen 1 ulSYTO16 zur Sortierrohr, um eine Sättigung zu erreichen. </li><li> Zeigen Sie die Gesamt Veranstaltungen auf einer grafischen Anzeige der folgenden Parameter: Anzahl der Ereignisse vs Alexa Fluor 488-A. </li><li> Wählen Sie die positive DNA-Färbung Zellen mit Gate 1, wie in Abbildung 1 dargestellt. <ol><li> Anzeigezellen von Tor 1 auf einer Grafik mit SSC-A vs FSC-A als Parameter <ol><li> Markieren Sie die Zellen mit Gate 2, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Display-Zellen von Gate 2 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter. </li><li> Wählen Sie Zellen mit Gate 5 und Gate 6 am Gate 2 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Separat Gate 5 und Gate 6 Anzeige auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter. </li><li> Wählen Spermiogenese Schritte 1-9 Spermatiden auf dem Gate 5 Grafik und Spermiogenese Schritte 10-12 Spermatiden auf dem Gate 6 Grafiken, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li></ol></li><li> AnzeigenZellen von Tor 1 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter <ol><li> Wählen Sie Zellen mit Tor 3 und Tor 4, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Separat Tor 3 und Tor 4 Zeigen Sie auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter. </li><li> Wählen Spermiogenese Schritte 13-14 Spermatiden auf dem Gate 3 Grafik und Spermiogenese Schritte 15-16 Spermatiden auf dem Gate 4 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Spermatogenen Zellen waren schon immer eine Herausforderung, angesichts der Komplexität der Keimepithel sowie den begrenzten Erfolg der In-vitro-Kultur zu studieren. Im Laufe der Jahre sind viele Ansätze zur Reinigung von Keimzellen aus verschiedenen Spezies entwickelt. Sedimentation Techniken unter Verwendung von Schwerkraftaufbereitung mit Percoll oder Rinderserumalbumin Gradienten bieten in der Regel eine gute Ausbeute an intakten Keimzellen, aber nicht über angemessene Definition zwischen einigen Zelltyp...

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece3, cell junction dynamics4, RNA dynamics5, chromatin remodeling process6,7 or genomic stability8. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size. 
Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.
A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>For mouse anesthesia before euthanasia</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>For tube coating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA staining</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sorted cells collection</td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anaesthetic vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>Homemade mouse gas chamber</td><td></td><td></td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon cell strainer</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m sample line filters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &amp;micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 &amp;mu;m filtered and keep at 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry

Die Differenzierung der Maus Spermatiden eines kritischen Verfahren zur Herstellung einer funktionellen männlichen Keimzellen mit intakter Genoms auf die nächste Generation übertragen werden. Bisher wurden molekulare Studien dieser morphologischen Übergang durch das Fehlen eines Verfahrens ermöglicht eine angemessene Trennung dieser wichtigen Schritte spermatid Differenzierung für nachfolgende Analysen behindert. Frühere Versuche zur richtigen Gating dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie kann schwierig gewesen, weil der eine eigentümliche Steigerung der DNA-Fluoreszenz in Spermatiden unterziehen Chromatin-Remodeling. Basierend auf dieser Beobachtung, bieten wir die Details eines einfachen Durchflusszytometrie Schema, wodurch reproduzierbare Reinigung von vier Populationen mit Ethanol fixiert Maus Spermatiden, die jeweils einen anderen Zustand in der Kernumbauprozess. Bevölkerung Anreicherung mit Schritt-spezifische Marker und morphologischen Kriterien bestätigt. Die gereinigten Spermatiden für Genom- und Proteom verwendet werdenic-Analysen.

Gating-Strategie mit der Durchflusszytometrie verwendet Abbildung 1 stellt die Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie verwendet werden, um vier hochreine spermatid Populationen zu sortieren. Kurz gesagt, Zellen mit positiven DNA-Färbung (Alexa Fluor 488-A) zunächst mit Tor 1. Spermatiden von Spermiogenese Schritte 1-12 ausgewählt sind (Tor 2) auf einer Punkt-Diagramm, das die granulosity (SSC-A) vs Gr...

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.5K Aufrufe.  Université de Sherbrooke. We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Serie: Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Verfahren zur Injektion von runden Spermatiden an der Maus zur Untersuchung der Embryonalentwicklung

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen