Los autores desean agradecer al Dr. Leonid Volkov y Éric Bouchard por su asesoramiento técnico en relación con la microscopía de epifluorescencia. Apoyo financiero Financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (subvención # MOP-93781) de GB

Cuidado de los animales estaba en conformidad con el cuidado de los animales y el uso comité de la Universidad de Sherbrooke. 1. Preparación del tubo <ol><li> El día antes de la clasificación de células, añadir 1-2 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo, y a 15 ml y 50 ml tubos cónicos de polipropileno. Paso crítico: Asegúrese de que todos los tubos utilizados en el protocolo es revestido. Nota: recubrimiento FBS evita que las células germinales se pegue a las paredes del tubo. </li><li> Poco a poco la mezcla de O / N por inversión a 4 ° C para revestir usando los tubos de manera uniforme un rotador. </li><li> El día siguiente, eliminar FBS a partir de tubos recubiertos por decantación. <ol><li> * Paso crítico: Asegúrese de que los 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo y los 15 y 50 ml tubos utilizados para la preparación de células (protocolo de los pasos 2.1 a 2.11) están completamente vacíos de FBS para evitar Fanning (es decir, la desviación imprecisa de las corrientes laterales). Utilice una pipeta P200 para eliminar las FBS. <br/&gt; Nota: Residual FBS en los tubos antes de la clasificación puede conducir a una pérdida de las células o la contaminación de otros tubos utilizados durante la clasificación de células, </li><li> Deja un pequeño volumen residual de FBS (alrededor de 100 a 200 l) en el 5 ml de polipropileno ronda tubos de fondo utilizados para la recolección de células purificadas. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la célula <ol><li> Sacrificar uno ratón macho bajo anestesia usando O 2 / isoflurano (inducción al 5% después se mantuvo a 2%), seguido por asfixia con CO2. </li><li> Impuestos Especiales y desencapsulan ambos testículos y picar con pequeñas tijeras en 500 l de tampón de clasificación en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Células germinales rasantes de túbulos seminíferos de suave pipeteo hacia arriba y abajo en el tubo de 1,5 ml, primero con un tronco de 100-1.000 l punta, y luego con una punta de 100-1.000 l intacta. </li><li> Retirar los escombros y matas por el paso uno de filtración usando un filtro de células de 40 micras y recoger filtrado en los 50 ml prev tubo cónicoiamente recubierto con FBS en el paso 1. </li><li> Lavar el filtro una vez con tampón de clasificación hasta un volumen total de 3 ml y la transferencia de filtrado en el tubo cónico de 15 ml previamente recubierto en el paso 1. </li><li> Añadir 16 l de EDTA 50 mM pH 8 por mililitro de suspensión celular (48 l para 3 ml) para obtener una concentración final de EDTA 0,8 mM. </li><li> Para fijar las células germinales, se añade lentamente 3 volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo utilizando una pipeta de 10 ml con agitación suave (vórtice a baja velocidad), que producirá una suspensión lechosa. Paso crítico: añadiendo lentamente etanol es crucial e importante para preservar la integridad de la preparación celular. Hemos observado que la adición rápida de etanol provoca la lisis celular que resulta en una disminución importante de la clasificación eficiencia. Para obtener una suspensión de células 3 ml, se deben añadir 9 ml de etanol en aproximadamente 1 min. </li><li> Se incuban las células en hielo durante 15 min con mezcla ocasional por inversión. </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 800 xg durante 5 min y retirar la claraflotante. </li><li> Resuspender suavemente las células germinales fijos en 2 ml de tampón de clasificación. </li><li> Añadir 4 l de tinte de ADN SYTO16 (solución 1 mM en DMSO) y se incuba durante al menos 30 min (protegido de la luz). Nota: Los mejores resultados de clasificación se obtienen utilizando SYTO16 ya que es un tinte de ADN permeable que se incorpora fácilmente en los núcleos altamente compactadas de espermátidas. </li></ol> Clasificador 3. Cell Set Up Se utiliza 20-parámetro clasificador celular BDFACSAria III Aquí, un 4-láser (rojo 405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - - amarillo-verde, 633 nm): Nota. El software BD FACSDiva 6.1.3 se utiliza para visualizar y analizar los datos. Los ajustes pueden variar en función del tipo de clasificador utilizado. <ol><li> Esterilizar el clasificador FACS mediante la ejecución de 70% de etanol como fluido envolvente durante el procedimiento de fluidos de apagado (menú &quot;citómetro&quot; en el software) antes de la clasificación. Seleccione &quot;citómetro&quot; en la barra de herramientas del software y elija &quot;sh neumáticoutdown &quot;. Siga los pasos mencionados por los procesos. </li><li> Preparar y filtrar 1x PBS con un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier cristal y contaminantes. Llenar el depósito de la vaina a la línea de soldadura superior en el interior del tanque. </li><li> Inicie el software e ingrese. Inicie el clasificador FACS para calentar el láser durante al menos 30 minutos antes de la clasificación. Ejecutar dos procesos de inicio de fluidos para eliminar el etanol a partir de los fluidos. Seleccione &quot;citómetro&quot; en la barra de herramientas del software y elija &quot;arranque neumático&quot;. Siga los pasos mencionados por los procesos. Nota: Esto restaura fluidos con fluido envolvente normal (1x PBS). </li><li> Limpie el bloque de clasificación y las placas de deflexión con agua destilada y secar a fondo. Sonicar una boquilla de 100 micras colocó en un tubo de agua destilada durante 2 min en un baño de sonicación. Limpie la boquilla a fondo. </li><li> Inserte la boquilla de 100 micras en la celda de flujo y gire la palanca de la boquilla de bloqueo de las agujas del reloj a la 12posición h. Ajuste la presión de funda a 20 psi. </li><li> Encienda la corriente y ajustar la amplitud de obtener valores objetivo para la frecuencia (alrededor de 30), la gota 1 (alrededor de 150) y Gap (alrededor de 12) y establecer un patrón breakoff gotita estable (gotas pocos satélite). Apague la atenuación. </li><li> Asegúrese de que la corriente es recta y golpea el centro del aspirador de residuos cambiando el ángulo del bloque tipo. Nota: Una boquilla de 130 micras, con 10 psi también se ensayó y no se encontró ninguna diferencia obvia. </li><li> Establecer retraso láser a 0 para el -77,39 azul, para el rojo, 37,33 para el violeta y -39.85 por los láseres de color amarillo-verde. </li><li> Establecer zonas de escala a 1,14 para el 1.0 azul, para el rojo, 0,75 para el violeta y 0,96 para los láseres de color amarillo-verde. </li><li> El uso de un Ordenar de prueba (en la ventana de &quot;Side Stream&quot; del software), asegúrese de que las corrientes laterales no están Fanning. En la ventana &quot;Side Stream&quot;, ajuste los controles deslizantes de tensión de cada corriente lateral para que lleguen al middle de tubo de recogida de prueba. Si la corriente de centro no es apretado, ajustar el 2º, 3º y 4 º ajustes de caída para limitar la corriente central. </li><li> Inicie el programa de instalación citómetro y Seguimiento (CS &amp; T) aplicación en el (menú &quot;citómetro&quot;) de software. </li><li> Utilice la configuración y el seguimiento de cuentas de citómetro a 1 gota por cada 350 l para automatizar la caracterización y el seguimiento de la actuación citómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Salga de la aplicación CS &amp; T. Aplicar configuración de CS &amp; T, asegúrese de que los parámetros de la corriente todavía permiten un patrón breakoff gotita estable, y encienda el botón de Sweet Spot como se describe en las instrucciones del fabricante (en la &quot;ventana Breakoff&quot;). </li><li> Optimizar el valor gota Delay usando perlas fluorescentes (véase la Tabla de Materiales). <ol><li> Instale los tubos de recogida en el soporte. Abra la puerta del bloque de tipo. En la ventana &quot;Side Stream&quot;, active la tensión a continuación, seleccione &quot;Prueba de tipo &quot;y haga clic en el botón aspirador cajón para abrir el cajón y tener acceso a los tubos de recogida. </li><li> Optimizar las corrientes laterales así que van hacia el centro del tubo. Ajustar valores y deslizadores, según sea necesario. </li><li> Cierre la puerta del bloque de clase y asegúrese de ajustar el micrómetro para obtener el punto de perlas más brillantes en el centro. Cajón de residuos Deseleccionar, prueba de tipo y la tensión. Retire los tubos de recogida. </li><li> Optimizar el retraso caída de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> En pocas palabras, agitar vigorosamente el vial de cuentas y diluir 1 gota de los granos en 0,5 ml de PBS. </li><li> Usando las instrucciones del fabricante, establecer el retraso gota usando la plantilla experimento de la gota de retardo disponibles en el software. También puede utilizar la función Auto gota retardo para ajustar el retardo de caída. </li><li> Cargar el tubo de perlas fluorescentes y ajustar la velocidad de flujo hasta que la tasa de umbral es de ~ 3.000 a 4.000 acontecimientos / segundo. Establecer la precisión de clasificación para &quot;Inicial&quot; y últimamente a &quot;Sintonía fina&quot; en la ventana &quot;Ordenar diseño&quot;. Seleccione el filtro óptico y clasificar los granos. Ajuste el retardo gota hasta ~ 100% están ordenadas a la izquierda. Nota: Este paso es crítico para asegurarse de que las células de interés especie en una corriente lateral. Las perlas y el filtro óptico se utilizan para lograr cerca de una desviación de gotas 100%. </li></ol></li></ol></li><li> Coloque un filtro ND (densidad neutra) FSC 1.5 en el extremo izquierdo del bloque detector FSC. Establecer la extensión ventana al 2,00 microsegundo y el escalado FSC Área de 1.00 (en la pestaña de &quot;láser&quot; en la ventana &quot;citómetro&quot;). </li><li> Antes de cargar el tubo de la muestra, coloque una línea de filtro de muestra de 50 micras, con el final de la línea de muestreo para evitar la formación de grumos. Para ello, seleccione &quot;Cambiar Filtro de ejemplo&quot; en el menú &quot;citómetro&quot;. </li><li> Prueba de la composición de la muestra de fluido para lograr una buena separación entre avivar sin corriente lateral y para evitar que las células se peguen a la polypropyletubos ne. <ol><li> Cargue el tubo de la muestra, encender las placas de deflexión y seleccione &quot;prueba tipo&quot; con el cajón cerrado. Mira arroyos secundarios si se produce la separación sin demasiado Fanning. Nota: Fanning es probablemente debido a una alta concentración de proteína en el tampón de muestra. </li></ol></li><li> Cargar el tubo de muestra en el instrumento FACS. Seleccionar una muestra de agitación 300 rpm y una temperatura de muestra de 4 ° C. Seleccione &quot;Adquirir de datos&quot; en la &quot;Adquisición Dashboard&quot;. </li><li> Si es necesario, diluir la muestra para lograr una tasa de eventos apropiado para un máximo de 5.000 eventos / seg (con un caudal máximo de 3,0). Estrictamente respetar estos límites con el fin de mantener la pureza de las células clasificadas. </li><li> Para analizar y clasificar las células, optimizar el valor umbral de FSC para eliminar los escombros sin interferir en la población de interés. En escala logarítmica, ajustar el voltaje del detector de tubo fotomultiplicador (PMT) con el filtro de 530/30 a fin de hacerasegurarse de que la señal de fluorescencia de la población total se ajusta dentro de la escala, y la puerta en la población positiva (Figura 1, puerta 1). </li><li> Producir un Forward Scatter-zona (FSC-A) / dispersión lateral del área (SSC-A) parcela de la población positiva SYTO16 y ajustar el FSC-A a alrededor de 110 V en la escala lineal y la SSC-A a alrededor de 150 V en escala logarítmica para visualizar todos los eventos excluyendo muy grandes células y agregados de células. </li><li> En la ventana &quot;Ordenar Diseño&quot;, establecer el &quot;modo de ordenación de precisión&quot; a &quot;4 vías pureza&quot; (máscara Rendimiento: 0, Pureza Máscara: 32, Máscara Fase: 0). Seleccione &quot;Continuo&quot; en el menú &quot;Eventos objetivo&quot; para la clasificación continua. </li><li> Añadir poblaciones para ordenar en el campo correspondiente a los tubos (en la ventana &quot;Ordenar Layout&quot;). Coloque las poblaciones con frecuencias más altas en el centro y los que tienen frecuencias más bajas en los extremos. Establecer las placas de voltaje a 2500 V. Durante la clasificación, mantener la recolección de la muestra tUBE en el hielo. </li></ol> 4. Cell Sorting <ol><li> Inmediatamente antes de la clasificación, las células de filtro utilizando un filtro de 50 micras en un 5 ml previamente recubierto de polipropileno ronda tubo inferior. </li><li> Lave el filtro extensamente con 1-2 ml de tampón de clasificación. </li><li> Células germinales Ordenar fijos utilizando un 488 nm láser equipado clasificador de células siguiendo el esquema gating se detalla en la Figura 1. Recoger fracciones purificadas en 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo recubiertas previamente en la sección 1 en el hielo. <ol><li> Asegúrese de que de 100-200 l de FBS se mantiene en los tubos de recogida para evitar la adherencia de las células clasificadas a la pared del tubo. </li><li> Asegúrese de que la concentración de SYTO16 está saturando de evitar las fluctuaciones de fluorescencia durante el período de clasificación. SYTO16 está saturando cuando no hay más variación de intensidad de la tinción de células en el parámetro 488 (tinción de ADN) Alexa Fluor en los gráficos de clasificación. Si es necesario, añadir 1 l deSYTO16 al tubo de clasificación para alcanzar la saturación. </li><li> Mostrar los eventos totales en un gráfico que muestra los siguientes parámetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A. </li><li> Seleccione las celdas de tinción de ADN positivos con la Puerta 1, como se muestra en la Figura 1. <ol><li> Mostrar las células de la puerta 1 en un gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parámetros <ol><li> Seleccione las celdas con la puerta 2, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Mostrar las células de la puerta 2 en un gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros. </li><li> Seleccionar celdas con Puerta 5 y 6 en la Puerta Puerta 2 gráfico, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Mostrar separado Puerta 5 y 6 en la Puerta de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros. </li><li> Seleccione espermiogénesis pasos 1-9 espermátidas en la Puerta 5 gráfico y espermiogénesis pasos 10-12 espermátidas en la puerta 6 gráficos, como se muestra en la Figura 1. </li></ol></li><li> Monitorlas células de la puerta 1 en un gráfico utilizando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros <ol><li> Seleccionar las células con la puerta 3 y Puerta 4, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Mostrar separado Puerta 3 y la puerta 4 de gráficos con Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros. </li><li> Seleccione espermiogénesis pasos 13-14 espermátidas en el gráfico de la Puerta 3 y espermiogénesis pasos 15-16 espermátidas en el gráfico de la puerta 4, como se muestra en la Figura 1. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Células de espermatogénesis siempre han sido difíciles de estudiar debido a la complejidad del epitelio seminífero, así como el éxito limitado de cultivo in vitro. A través de los años, muchos enfoques para purificar se desarrollaron las células germinales a partir de diversas especies. Utilizando técnicas de sedimentación de purificación de la gravedad con Percoll o gradientes de albúmina de suero bovino por lo general proporcionan un buen rendimiento de células germinales intactas, pero carecen ...

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece3, cell junction dynamics4, RNA dynamics5, chromatin remodeling process6,7 or genomic stability8. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size. 
Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.
A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>For mouse anesthesia before euthanasia</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>For tube coating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA staining</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sorted cells collection</td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anaesthetic vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>Homemade mouse gas chamber</td><td></td><td></td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon cell strainer</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m sample line filters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &amp;micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 &amp;mu;m filtered and keep at 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry

La diferenciación de espermátidas de ratón es uno proceso crítico para la producción de un gameto masculino funcional con un genoma intacto para ser transmitido a la siguiente generación. Hasta ahora, los estudios moleculares de esta transición morfológica se han visto obstaculizados por la falta de un método que permite una separación adecuada de estos pasos importantes de la diferenciación espermátide para análisis posteriores. Los anteriores intentos de la selección adecuada de estas células usando citometría de flujo pueden haber sido difícil debido a un aumento en la fluorescencia peculiar ADN en espermátidas sometidos a remodelación de la cromatina. Sobre la base de esta observación, proporcionamos los detalles de un flujo sencillo citometría de esquema, lo que permite la purificación reproducible de cuatro poblaciones de espermátidas de ratón fijados con etanol, cada uno representando un estado diferente en el proceso de remodelación nuclear. Enriquecimiento de Población se confirma el uso de marcadores de pasos específicos y criterios morfológicos. Las espermátidas purificadas se pueden utilizar para genómico y proteomic analiza.

Estrategia de apertura de puerta se usa con citometría de flujo La Figura 1 representa la estrategia gating utilizado en citometría de flujo para clasificar cuatro poblaciones spermatid altamente puros. Brevemente, las células con tinción de ADN positivo (Alexa Fluor 488-A) se seleccionan en primer lugar con la Puerta 1. Espermátidas de espermiogénesis pasos son seleccionados 1-12 (puerta 2) en un gráfi...

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.5K vistas.  Université de Sherbrooke. We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento de inyección de espermatida redonda murina para estudiar el desarrollo embrionario

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Inyección de espermatida redonda de ratón

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Inyección de espermatida redonda de ratón

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

Resumen

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Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares