著者は、落射蛍光顕微鏡に関する技術的助言のための博士レオニードボルコフとEricブシャールに感謝したいです。 財政的援助 GBに（＃1 MOP-93781を付与）カナダ衛生研究所によって資金を供給

動物のケアは、シャーブルック大学の動物の管理と使用委員会に従いました。 1.チューブの準備<ol><li>細胞選別の前日には、5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブに熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）1〜2mlのを追加し、15ミリリットル、50 mlのポリプロピレン製コニカルチューブに。 重要なステップ：プロトコルで使用されるすべてのチューブが被覆されていることを確認してください。 注意：FBSコーティングは、管壁に付着する生殖細胞を防ぐことができます。 </li><li>ゆっくりとチューブが均一に回転子を使用して被覆するために4℃での反転により、O / Nを混ぜます。 </li><li>翌日、デカントすることにより、コーティングされたチューブからFBSを削除します。 <ol><li> *重要なステップ：5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブおよび細胞調製のために使用される15、50 mlチューブは、（プロトコルは2.11から2.1ステップ）完全にファニング（サイドストリームのすなわち、不正確な偏差）を防止するために、FBSを空にしていることを確認します。 FBSを削除するには、P200のピペットを使用してください。 <br/&gt;注：残留FBSチューブでソートする前には、細胞または細胞選別の際に使用される他の管の汚染の損失につながる可能性</li><li>精製された細胞を収集するために使用される下部チューブラウンド5ミリリットルポリプロピレンでFBSの小残留量（約100〜200μl）を残して下さい。 </li></ol></li></ol> 2.細胞調製<ol><li> CO 2窒息続く（5％誘導はその後、2％に維持）、O 2 /イソフルランを使用して麻酔下で1人の男性にマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>消費税​​及び1.5ミリリットルチューブにバッファをソートする500μlの小さなハサミでカプセル開放を行う両方の精巣およびミンチ。 </li><li>フラッシュ生殖最初切り捨て100-1,000μlの先端で1.5ミリリットルチューブで優しく上下にピペッティングにより精細管からの細胞、およびその後そのまま100-1,000μlの先端で。 </li><li> 40μmのセルストレーナーを使用して、1つの濾過工程によって破片や塊を取り除き、50mlのコニカルチューブの前にろ液を集めますiouslyステップ1でFBSをコーティングしました。 </li><li>以前手順1でコーティングされた15ミリリットルコニカルチューブに合計3 mlの容量と転送ろ液までのバッファを並べ替えて、フィルタを1回洗浄します。 </li><li> 0.8 mMのEDTAの最終濃度を得るために、細胞懸濁液（3ミリリットル48μl）を1ミリリットル当たり50ミリモルのEDTA pHが8の16μLを追加します。 </li><li>生殖細胞を固定するために、ゆっくりと乳白色の懸濁液が生成される穏やかな撹拌（低速でボルテックス）で10mlのピペットを使用して、氷冷100％エタノール3容量を追加します。 重要なステップ：ゆっくりとエタノールを加え細胞調製物の完全性を維持することが重要と重要です。私たちは、エタノールの急速な添加は効率をソートの主な減少で得られた細胞溶解を引き起こすことを指摘しました。 3ミリリットルの細胞懸濁液は、エタノール9mlを約1分で添加されるべきです。 </li><li>反転による時々混合しながら氷上で15分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 5分間800×gで遠心し細胞懸濁液とクリアを削除上清。 </li><li>静かにバッファをソート2ml中の固定された生殖細胞を再​​懸濁します。 </li><li> SYTO16 DNA色素（DMSO中の1 mM溶液）の4μlを添加して、（光から保護）は、少なくとも30分間インキュベートします。 注：これは容易に精子細胞の高度に圧縮された核内に組み込まれる透過性DNA色素であるため、最高のソート結果をSYTO16を用いて得られます。 </li></ol> 3.セルソーターを設定注：ここでは、4-レーザー（405nmの - 紫、488nmの - 青、561 nmの - 黄緑色、633nmの - 赤）20パラメータBDFACSAria IIIセルソーターを用いています。 BD FACSDiva 6.1.3ソフトウェアは、データを視覚化し、分析するために使用されます。設定が使用ソータの種類に応じて変えることができます。 <ol><li>選別前に流体のシャットダウン手順（ソフトウェアで「サイトメーター」メニュー）の間にシース液として70％エタノールを実行して、FACSソーターを滅菌します。ソフトウェアのツールバーにある「サイトメーター」を選択し、「流体のshを選択。 &quot;をutdownプロセスで述べた手順に従ってください。 </li><li>準備し、任意の結晶および汚染物質を除去するように、0.22μmのフィルターを用いて1×PBSをフィルタリングします。タンク内の上側の溶接線にシースタンクを埋めます。 </li><li>ソフトウェアを起動し、ログインします。選別前に少なくとも30分間レーザーを温めるために、FACSソーターを開始します。流体工学からエタノールを洗い流すために、2つの流体起動プロセスを実行します。ソフトウェアのツールバーにある「サイトメーター」を選択し、「流体の起動」を選択します。プロセスで述べた手順に従ってください。 注意：これは、通常のシース液（1×PBS）で流体工学を復元します。 </li><li>ブロックソート、蒸留水で偏向板をきれいにし、それらを徹底的に乾燥させます。超音波処理浴中で2分間蒸留水管に入れ100μmのノズルを超音波処理します。徹底的にノズルを拭きます。 </li><li>フローセルに100μmのノズルを挿入し、12にノズルロックレバーを時計回りに回します時間位置。 20 PSIにシース圧を設定します。 </li><li>ストリームをオンにして、周波数の目標値を取得するために振幅を調整（30前後）、ドロップ1（150前後）とギャップ（12前後）、安定した液滴切り離しパターン（数サテライト滴）を確立します。減衰をオフにします。 </li><li>ストリームがストレートで、ソートブロックの角度を変更することにより、廃棄物の吸引器の中心に当たることを確認します。注：10 psiで130μmのノズルも試験したと明らかな差は見られませんでした。 </li><li>黄緑色レーザ用、青紫、赤のため-77.39、37.33および-39.85 0に設定レーザー遅延。 </li><li>黄緑色レーザ用、青紫赤1.0、0.75と0.96のための1.14へのスケーリング設定の領域。 </li><li> （ソフトウェアの「サイドストリーム」ウィンドウ内の）試験ソートを使用して、サイ​​ドストリームがファニングされていないことを確認してください。彼らはmiddlを打つように、「サイドストリーム」ウィンドウでは、各副流の電圧スライダーを調整テストコレクションチューブのE。中央ストリームが固まっていない場合は、中央の流れを制限するために、2位、3位、および4 番目のドロップ設定を調整します。 </li><li>サイトメーターのセットアップとソフトウェアの追跡（CS＆T）アプリケーション（「サイトメーター」メニュー）を起動します。 </li><li>製造元の指示を使用して、サイ​​トメーターの性能の特徴付けおよび追跡を自動化するために、350μlのあたり1滴でサイトメーターセットアップおよび追跡ビーズを使用してください。 </li><li> CS＆Tのアプリケーションを終了します。 CS＆Tの設定を適用し、ストリーム・パラメータがまだ安定した液滴切離しパターンを可能にし、（「切り離しウィンドウ」で）を、製造業者の説明書に記載されているようにスイートスポットボタンをオンにしてください。 </li><li>蛍光ビーズを使用してドロップ遅延値を最適化（材料の表を参照のこと）。 <ol><li>ホルダーに収集チューブを取り付けます。ソートブロックのドアを開きます。 「サイドストリーム」ウィンドウで、「選択した電圧をオンにしますテストソート」と引き出しを開き、コレクションチューブにアクセスできるようにアスピレーター引き出しボタンをクリックします。 </li><li>彼らは、チューブの中央に入るように、サイドストリームを最適化します。必要に応じて値スライダを調整します。 </li><li>ソートブロックのドアを閉じて、中央に明るいビーズスポットを得るために、マイクロメーターダイヤルを調整してください。選択を解除廃棄引き出し、テストの並べ替えと電圧。コレクションチューブを外します。 </li><li>製造者の指示に従って降下遅延を最適化します。 <ol><li>簡単に説明すると、ビーズバイアルを激しく振とうし、PBS 0.5mlのビーズの1滴を希釈します。 </li><li>製造者の指示を使用して、ソフトウェアで使用可能なドロップディレイ実験テンプレートを使用して、ドロップ遅延を設定します。また、ドロップ遅延を設定するには、[自動ドロップ遅延機能を使用しています。 </li><li>蛍光ビーズのチューブをロードし、しきい値率が〜3,000〜4,000のイベント/秒になるまで流量を調整します。 「初期」と最後にソート精度を設定します。LY「ソートレイアウト」ウィンドウの「微調整」します。光学フィルタを選択して、ビーズを並べ替えます。 〜100％を左にソートされるまで、ドロップディレイを調整します。 注：この手順は必ず側流への関心の種の細胞ことを確認することが重要です。ビーズと光学フィルタ100％滴偏差に近い達成するために使用されます。 </li></ol></li></ol></li><li> FSC検出器ブロックの左端にFSC 1.5 ND（減光）フィルターを置きます。 （「サイトメーター」ウィンドウで、「レーザー」タブで）1.00に2.00マイクロ秒とFSCエリアのスケーリングにウィンドウの拡張機能を設定します。 </li><li>サンプルチューブをロードする前に、凝集を避けるために、サンプルラインの最後に50μmのサンプルフィルタラインを配置します。これを行うには、「サイトメーター」メニューの「サンプルフィルタを変更」を選択します。 </li><li>サイドストリーム間ファニングずに良好な分離を達成するために、試料流体の組成をテストしpolypropyleに付着する細胞を防ぐためにNEチューブ。 <ol><li>サンプルチューブをロードし、偏向板をオンにして引き出しを閉じた状態で「テストの並べ替え」を選択します。分離はあまりファニングせずに発生した場合、サイドストリームを見てください。 注：ファニング起因サンプル緩衝液中に高タンパク質濃度に思われます。 </li></ol></li><li> FACS装置にサンプルチューブをロードします。 300 rpmでのサンプルの攪拌と4℃の試料温度を選択します。 「取得ダッシュボード」の「データを取得」を選択します。 </li><li>必要に応じて、（3.0の最大流量で）5,000イベント/秒の最大値に適切なイベント・レートを達成するために、サンプルを希釈します。選別された細胞の純度を維持するように厳密にこれらの制限を尊重しています。 </li><li>分析し、細胞を選別するために、関心の集団に干渉することなく、破片を除去するためにFSC閾値を最適化します。対数目盛では、作るために530/30フィルタを備えた光電子増倍管（PMT）検出器の電圧を調整総人口の蛍光シグナルが陽性集団（ 図1、ゲート1）のスケールに収まると、ゲートことを確認してください。 </li><li> SYTO16陽性集団の前方散乱面積（FSC-A）/側方散乱エリア（SSC-A）のプロットを生成し、約110 VリニアスケールでにFSC-Aを調整し、SSC-A約150 Vに非常に大規模な細胞および細胞凝集体を排除しながら、対数スケールですべてのイベントを可視化しました。 </li><li> 「ソートレイアウト」ウィンドウで、「ソート精度モード」に設定」4ウェイ純度」に（収量マスク：0、純度マスク：32、位相マスク：0）。連続ソートのための「ターゲットイベント」メニューから「連続」を選択します。 </li><li> （「ソートレイアウト」ウィンドウ）のチューブに対応するフィールドでソートする集団を追加します。高い真ん中の周波数と端部で低い周波数を持つものと集団を置きます。 、並べ替え中に2,500 Vに電圧プレートを設定し、サンプル収集トンを保ちます氷上ubes。 </li></ol> 4.セルソーティング<ol><li>すぐにソートする前に、丸底チューブを先にコーティングされた5ミリリットルポリプロピレン50μmのフィルターを用いてフィルタセル。 </li><li>バッファをソート1-2 mlの広範囲にフィルターを洗ってください。 </li><li> 図1に詳述ゲーティング方式以下の488 nmレーザーを搭載したセルソーターを使用してソート固定生殖細胞は、以前に氷の上のセクション1でコーティングされた5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブ内の精製画分を収集します。 <ol><li> FBSの100〜200μlのが管壁に選別された細胞の付着を回避するために、コレクションチューブに保たれていることを確認します。 </li><li> SYTO16の濃度が仕分け期間中に蛍光の変動を回避するために飽和していることを確認します。仕分けグラフィックでアレクサフルオロ488パラメータ（DNA染色）での細胞染色強度のさらなる変化がない場合SYTO16が飽和しています。必要に応じて、1μlを添加します飽和状態に達するまでの仕分けチューブにSYTO16。 </li><li>アレクサフルオロ488-A VSイベントの数：次のパラメータを表示し、グラフィック上の総イベントを表示します。 </li><li> 図1に示すように、ゲート1の正DNA染色細胞を選択します。 <ol><li>パラメータとしてFSC-A対SSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1から表示セル<ol><li> 図1に示したように、ゲート2でセルを選択します。 </li><li>パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対FSC-Aを使用してグラフィック上にゲート2から表示セル。 </li><li> 図1に示したように、ゲート2のグラフィックの上にゲート5とゲート6とセルを選択します。 </li><li>パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対アレクサフルオロ488-Wを使用してグラフィックに表示され、別々にゲート5及びゲート6。 </li><li>選択して精子形成は、図1に示したように、ゲート5グラフィックと精子は、ゲート6グラフィックスに10-12精子細胞をステップに1-9精子細胞を繰り返します。 </li></ol></li><li>表示パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対FSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1からの細胞<ol><li> 図1に示したように、ゲート3とゲート4とのセルを選択します。 </li><li>パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対アレクサフルオロ488-Wを使用してグラフィックスの表示を別々ゲート3とゲート4。 </li><li>選択して精子形成は、図1に示したように、ゲート3のグラフィックと精子は、ゲート4のグラフィックに15-16精子細胞を、手順に13-14精子細胞を繰り返します。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

精子形成細胞は常に精上皮の複雑さだけでなく、in vitro培養の限られた成功を与えて研究する挑戦されています。長年にわたり、様々な種から生殖細胞を精製するための多くの手法が開発されました。パーコールまたはウシ血清アルブミン勾配で重力を用いて沈降精製技術は通常、無傷の胚細胞の良好な収率を提供するが、このような減数分裂四倍体細胞および精子細胞10のよ?...

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece3, cell junction dynamics4, RNA dynamics5, chromatin remodeling process6,7 or genomic stability8. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size. 
Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.
A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>For mouse anesthesia before euthanasia</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>For tube coating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA staining</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sorted cells collection</td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anaesthetic vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>Homemade mouse gas chamber</td><td></td><td></td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon cell strainer</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m sample line filters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &amp;micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 &amp;mu;m filtered and keep at 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry

マウスの精子細胞の分化は、無傷のゲノムと機能的雄性配偶子の製造のための1つの重要なプロセスは、次の世代に伝達されます。これまでのところ、この形態転移の分子研究はその後の分析のために精子細胞分化のこれらの重要なステップの適切な分離を可能にする方法の欠如によって妨げられてきました。フローサイトメトリーを使用して、これらの細胞の適切なゲーティングでの初期の試みが原因クロマチンリモデリングを受けて精子細胞におけるDNA蛍光の独特の増加のために困難であったかもしれません。この観察に基づいて、我々は、エタノールで固定したマウス精子の4集団、核リモデリングプロセスに異なる状態を表す各の再現性精製を可能にする、シンプルなフローサイトメトリー方式の詳細を提供します。人口濃縮は段階特異的なマーカーおよび形態学的規準を用いて確認されています。精製された精子細胞は、ゲノムやプロテオームのために使用することができますIC分析します。

フローサイトメトリーで使用されるゲーティング戦略 図1は、4つの高純度の精子細胞集団をソートするフローサイトメトリーに使用されるゲート戦略を表します。簡単に言うと、正のDNA染色を有する細胞（アレクサフルオロ488-A）が第1のサイズ対granulosity（SSC-A）を示すドットプロットで精子から1精子細胞は?...

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.5K ビュー.  Université de Sherbrooke. We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

発生生物学

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>胚発生を研究するためのマウスラウンド精子細胞注入手順

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスラウンド精子細胞注射

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

マウスラウンド精子細胞注射

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

要約

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エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

要約

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エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

精細管スカッシュマウスモデルを用いた精子の細胞学的解析法