Die Injektion von runden Spermatiden kann das Problem der Fortpflanzung bei einigen Patienten mit nicht-obstruktiver Azoospermie lösen, aber ihre Wirksamkeit ist sehr gering. In unserer Studie wurden Mausen als Modelle verwendet, um nach Methoden zu suchen, um die Effizienz der embryonalen Entwicklung von ROSI bei Mäusen zu verbessern. Unvollständige Statistiken zeigen, dass weltweit weniger als 200 mit ROSI gezeugte menschliche Föten entbunden wurden.
Ein Wendepunkt im Verständnis des Potenzials der ROSI-Technologie erfolgte im Jahr 2015, als Tanaka und Kollegen über die erfolgreichen Geburten von 14 Föten durch die ROSI-Technologie berichteten und neues Vertrauen in ihre klinische Anwendung und Machbarkeit weckten. Der derzeitige Schwerpunkt der ROSI-Forschung liegt auf Anomalien bei epigenetischen Modifikationen und abnormaler Eizell-assistierter Aktivierung, während die genaue Identifizierung runder Spermiendaten ebenfalls eine Herausforderung darstellt. Die Entwicklungseffizienz von ROSI-Embryonen in der Maus ist in unserem Labor, ähnlich wie in anderen Labors, bereits sehr hoch.
Die Entwicklungseffizienz von Nicht-Nagetieren, wie dem Menschen, ist jedoch noch sehr neu. In Zukunft werden wir uns auf die Verbesserung der Entwicklungseffizienz von Nicht-Nagetieren konzentrieren. Zu Beginn injizieren Sie einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen Maus intraperitoneal um 17:00 Uhr jeweils 7,5 internationale Einheiten trächtiger Stutenserumgonadotropin und 48 Stunden später humanes Choriongonadotropin.
Stellen Sie sicher, dass nach der Injektion kein Kontakt mit männlichen Mäusen stattfindet. Öffnen Sie nach dem Einschläfern der Maus die Bauchhöhle. Durchtrennen Sie mit einer Schere die Eileiter in der Nähe beider Eierstöcke und legen Sie sie in einen auf 37 Grad Celsius vorgeheizten M2-Puffer.
Lokalisieren Sie unter dem 10-fachen Objektiv eines aufrechten Mikroskops den transparenten, vergrößerten Teil des Eileiters. Befestigen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Spritze den Eileiter, schneiden Sie den vergrößerten Teil ab und sammeln Sie die koronalen Kumuluskomplexe der Eizelle. Um Granulosazellen zu entfernen, legen Sie den Eizellenkomplex in eine vorgewärmte M2-Operationslösung mit 0,1 % Hyaluronidase und blasen Sie vorsichtig durch eine orale Pipette.
Übertragen Sie die Eizelle nacheinander in KSOMaa-Tröpfchen, spülen Sie sie dreimal aus und legen Sie sie in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Besorgen Sie sich zunächst eine euthanasierte acht bis 10 Wochen alte männliche C57BL/6-Maus. Öffnen Sie die Bauchhöhle und entfernen Sie den Nebenhoden in der Nähe des Hodens vorsichtig mit einer Schere.
Stellen Sie die Schale mit den Nebenhoden in M2-Medium unter das 10-fache Objektiv eines aufrechten Mikroskops. Und mit einer Ein-Milliliter-Spritze entfernen Sie vorsichtig die Nebenhoden, damit die Spermien herausfließen können. Saugen Sie die fließenden Spermien in Suspension in den Boden eines Röhrchens ab, das 0,5 Milliliter M2-Puffer enthält.
Für eine runde Spermatidenisolierung übertragen Sie den präparierten Hoden in den M2-Puffer. Schneiden Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze vorsichtig die weiße Membran unter dem Mikroskop und drücken Sie dann die gewundenen Samenkanälchen heraus und schneiden Sie sie heraus. Nach dem Extrahieren der Suspension mit einem 400-Mesh-Sieb filtrieren und die filtrierten Zellen zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und inkubieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Hoechst 33342 bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Legen Sie das Zytometrieröhrchen mit den gefärbten Zellen in das Durchflusszytometer. Nachdem Sie die Spannung angepasst haben, wählen Sie die Zellpopulation basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung aus.
Entfernen Sie dann die Zelladhäsionen entsprechend der Vorwärtsstreuung und lösen Sie die Pulsbreite aus. Sortieren Sie die runden Spermatiden mit zwei Detektionskanälen unter einem Laser mit einer Wellenlänge von 355 Nanometern und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Unter dem Mikroskop hatten die runden Spermatiden der Maus einen Durchmesser von etwa 10 Mikrometern und wiesen in der Mitte eine protrusionsartige Nukleolusstruktur auf.
Gewinnen Sie zunächst Eizellen und runde Spermatiden von Mäusen. Bereiten Sie dann die Halte- und Injektionsnadeln mit den entsprechenden Durchmessern vor. Legen Sie die Eizellen in 10 Mikroliter M2-Tröpfchen mit oder ohne Cytochalasin B, um die Gameten zu erweichen und zu lagern.
Legen Sie dann die runden M2-Tröpfchen der Spermatiden und montieren Sie die Operationsschale auf dem mikroskopischen Operationstisch. Passen Sie die Position der Injektion an und fixieren Sie die Nadel. Befeuchten und reinigen Sie die Injektionsnadel mit Polyvinylpyrrolidon oder PVP.
Als nächstes extrahieren Sie die runden Spermatiden in die Injektionsnadel. Drehen Sie die Eizelle mit der Haltenadel, um den Polkörper der Eizellen in der 12-Uhr-Position auszurichten. Platzieren Sie dann die Injektionsnadel vorsichtig in der Drei-Uhr-Position auf der Eizelle.
Erzeugen Sie mit einem PiezoXpert-Gerät ein Loch in die Zona pellucida der Eizellen. Führen Sie dann die Injektionsnadel vorsichtig horizontal in die Eizelle ein und reißen Sie die Eizellmembran auf. Injizieren Sie die runde Spermatide nach und nach in das Zytoplasma der Eizelle.
Ziehen Sie die Injektionsnadel zurück und saugen Sie eine kleine Menge der Eizellmembran in der Nähe der Öffnung ab, um sie zu verschließen. Für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion platzieren Sie die Spermien auf einer PVP-Landebahn. Aspirieren Sie die Spermien aus dem Schwanz und positionieren Sie ihren Hals an der Mündung der Injektionsnadel.
Wenden Sie einen Piezo an, um den Spermienkopf vom Schwanz zu trennen. Injizieren Sie dann das Sperma in die Eizelle, wie bereits gezeigt, mit einer Injektionsnadel mit einem Durchmesser von neun bis 10 Mikrometern. Für die assistierte Eizellaktivierung legen Sie die Eizellen in 20 Mikroliter Tröpfchen calcium- und magnesiumfreies CZB-Medium, das Strontiumchlorid-Hexahydrat enthält.
Übertragen Sie sie dann zur Kultivierung auf das KSOMaa-Kulturmedium. Gleichzeitig wird eine Gruppe für die Aktivierung der Parthenogenese gebildet, ohne runde Spermatiden oder Spermien für embryologische Studien zu injizieren. Nach der Aktivierung zur Kultivierung auf das KSOMaa-Kulturmedium übertragen.
Runde Spermatiden-injizierte Embryonen zeigten eine geringere Entwicklungseffizienz im Vergleich zu intrazytoplasmatischen Spermien-injizierten.
