Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Leonid Volkov e Éric Bouchard per la loro consulenza tecnica in materia di epifluorescenza. Sostegno finanziario Finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (sovvenzione # MOP-93.781) a GB

Cura degli animali era in conformità con la cura degli animali e l&#39;uso comitato Université de Sherbrooke. 1. Preparazione del tubo <ol><li> Il giorno prima separazione delle cellule, aggiungere 1-2 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) a 5 ml in polipropilene provette con fondo arrotondato, e di 15 ml e 50 ml tubi in polipropilene coniche. Passaggio fondamentale: Assicurarsi che ogni tubo utilizzato nel protocollo è rivestito. Nota: Rivestimento FBS impedisce alle cellule germinali di attaccarsi alle pareti del tubo. </li><li> Mescolare lentamente O / N per inversione a 4 ° C per rivestire i tubi in modo uniforme con un rotatore. </li><li> Il giorno successivo, togliere FBS da tubi rivestiti per decantazione. <ol><li> * Passo critico: Assicurarsi che i 5 ml in polipropilene provette con fondo arrotondato e le 15 e 50 ml tubi utilizzati per la preparazione delle cellule (protocollo passaggi 2,1-2,11) sono completamente svuotati di FBS per prevenire Fanning (ad esempio, deviazione imprecisa dei torrenti laterali). Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere le FBS. <br/&gt; Nota: residua FBS in tubi prima di smistamento può portare a una perdita di cellule o la contaminazione di altri tubi utilizzati durante l&#39;ordinamento delle cellule, </li><li> Lascia un piccolo volume residuo di FBS (circa 100-200 ml) in polipropilene da 5 ml tubi tondi fondo utilizzati per la raccolta delle cellule purificate. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delle cellule <ol><li> Sacrifica un topo maschio in anestesia con O 2 / isoflurano (induzione al 5% poi mantenuto al 2%), seguito da CO 2 asfissia. </li><li> Accise e decapsulate entrambi i testicoli e tritare con piccole forbici in 500 ml di smistamento tampone in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Cellule germinali Flush da tubuli seminiferi di dolce pipettando su e giù nel tubo 1,5 ml, prima con una punta tronca 100-1000 ml, e poi con un intatto punta 100-1000 ml. </li><li> Rimuovere i detriti e ciuffi dopo passo una filtrazione con un colino cella 40 micron e raccogliere filtrato nei 50 ml prev tubo conicoiously rivestito con FBS al punto 1. </li><li> Lavare il filtro una volta con tampone di smistamento fino ad un volume totale di 3 ml e trasferimento filtrato nel tubo da 15 ml precedentemente rivestito in passaggio 1. </li><li> Aggiungere 16 ml di 50 mM EDTA pH 8 per millilitro di sospensione cellulare (48 ml per 3 ml) in modo da ottenere una concentrazione finale di 0,8 mM EDTA. </li><li> Per risolvere le cellule germinali, lentamente aggiungere 3 volumi di ghiacciata etanolo al 100% con un 10 ml pipetta con agitazione (vortex a bassa velocità), che produrrà una sospensione lattiginosa. Step critico: lentamente aggiungendo etanolo è cruciale e importante preservare l&#39;integrità della preparazione cellulare. Abbiamo notato che la rapida aggiunta di etanolo provoca la lisi delle cellule con una conseguente notevole diminuzione dell&#39;efficienza della selezione. Per una sospensione cellulare 3 ml, 9 ml di etanolo dovrebbe essere aggiunto in circa 1 min. </li><li> Incubare le cellule in ghiaccio per 15 minuti con miscelazione occasionali per inversione. </li><li> Sospensione cellulare a 800 xg Centrifugare per 5 min e rimuovere il chiarosurnatante. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule germinali fissati in 2 ml di cernita tampone. </li><li> Aggiungere 4 ml di colorante DNA SYTO16 (soluzione 1 mM in DMSO) e incubare per almeno 30 min (protetto dalla luce). Nota: I risultati migliori si ottengono utilizzando ordinamento SYTO16 poiché è un colorante DNA permeabile che è facilmente incorporato in nuclei altamente compattati di spermatidi. </li></ol> Sorter 3. cellulare Set Up Viene utilizzato 20 parametri cell sorter BDFACSAria III Ecco, un 4-Laser (rosso 405 nm - viola, 488 nm - blu, 561 nm - - giallo-verde, 633 nm): Nota. Il software BD FACSDiva 6.1.3 viene utilizzato per visualizzare e analizzare i dati. Le impostazioni possono variare a seconda del tipo di sorter utilizzato. <ol><li> Sterilizzare il sorter FACS eseguendo il 70% di etanolo come fluido di trasporto durante la procedura di spegnimento fluidica (menu &quot;Cytometer&quot; del software) prima di smistamento. Selezionare &quot;Citometro&quot; nella barra degli strumenti del software e scegliere &quot;sh Fluidicutdown &quot;. Seguire la procedura citati dai processi. </li><li> Preparare e filtrata 1x PBS con un filtro da 0,22 micron in modo da eliminare eventuali cristalli e contaminanti. Riempire il serbatoio guaina la linea di saldatura superiore all&#39;interno del serbatoio. </li><li> Avviare il software ed eseguire il login. Avviare il sorter FACS a scaldare i laser per almeno 30 minuti prima di smistamento. Eseguire due processi di avvio fluidici per scovare l&#39;etanolo dai fluidica. Selezionare &quot;Citometro&quot; nella barra degli strumenti del software e scegliere &quot;avvio Fluidic&quot;. Seguire i passaggi indicati dai processi. Nota: Questo ripristina fluidica con normale liquido guaina (1x PBS). </li><li> Pulire il blocco di ordinamento e le piastre di deflessione con acqua distillata e asciugare accuratamente. Sonicare un ugello 100 micron posto in un tubo di acqua distillata per 2 minuti in un bagno di sonicazione. Pulire a fondo l&#39;ugello. </li><li> Inserire l&#39;ugello 100 micron nella cella di flusso e ruotare l&#39;ugello leva di bloccaggio in senso orario al 12Posizione hr. Impostare la pressione della guaina di 20 psi. </li><li> Accendere il torrente e regolare l&#39;ampiezza di ottenere valori di riferimento per la frequenza (circa 30), Goccia 1 (circa 150) e Gap (circa 12), e di stabilire un modello di gocce di troncaggio stabile (gocce pochi satellite). Spegnere attenuazione. </li><li> Assicurarsi che il flusso sia diritto e colpisce il centro dell&#39;aspiratore rifiuti cambiando l&#39;angolo del blocco genere. Nota: Un ugello 130 micron a 10 psi è stato anche testato ed è stato trovato nessuna differenza evidente. </li><li> Impostare ritardo laser a 0 per il blu, -77,39 per il rosso, 37.33 per il viola e -39,85 per i laser di colore giallo-verde. </li><li> Impostazione delle aree di scala di 1,14 per il blu, 1.0 per il rosso, 0,75 per la viola e 0.96 per i laser di colore giallo-verde. </li><li> Utilizzando un Sort Test (nella finestra &quot;laterale Stream&quot; del software), fare in modo che i flussi laterali non sono Fanning. Nella finestra &quot;laterale Stream&quot;, regolare i cursori di tensione di ogni flusso lato in modo che hanno colpito il middle di tubo di raccolta di prova. Se il flusso centrale non è stretto, regolare il 2 °, 3 ° e 4 impostazioni ° drop per limitare il flusso centrale. </li><li> Avviare l&#39;installazione citometro e tracking (CS &amp; T) applicazione nel (menu &quot;Cytometer&quot;) del software. </li><li> Utilizzare l&#39;Installazione e monitoraggio perline citometro a 1 goccia per 350 ml per automatizzare la caratterizzazione e il monitoraggio delle prestazioni citometro utilizzando le istruzioni del produttore. </li><li> Chiudere l&#39;applicazione CS &amp; T. Applicare impostazione CS &amp; T, assicurarsi che i parametri di flusso consentono ancora un andamento stabile delle gocce di troncaggio, e attivare il pulsante di Sweet Spot come descritto nelle istruzioni del produttore (nella &quot;finestra breakoff&quot;). </li><li> Ottimizzare il valore di goccia di ritardo utilizzando perline fluorescenti (vedi Tabella dei Materiali). <ol><li> Installare i tubi di raccolta nel supporto. Aprire la porta blocco tipo. Nella finestra &quot;laterale Stream&quot;, accendere la tensione, quindi selezionare &quot;Test di sorta &quot;e fare clic sul pulsante aspiratore cassetto per aprire il cassetto e avere accesso ai tubi di raccolta. </li><li> Ottimizzare i flussi laterali così vanno al centro del tubo. Regolare i valori e cursori come necessario. </li><li> Chiudere la porta blocco tipo e assicurarsi di regolare il quadrante del micrometro per ottenere il posto tallone luminoso al centro. Cassetto rifiuti deselezionare, prova sorta e la tensione. Rimuovere i tubi di raccolta. </li><li> Ottimizzare il ritardo calo secondo le istruzioni del fabbricante. <ol><li> In breve, agitare tallone fiala vigorosamente e diluire 1 goccia di perline in 0,5 ml di PBS. </li><li> Utilizzando le istruzioni del produttore, impostare il ritardo goccia utilizzando il modello esperimento goccia Ritardo disponibili nel software. In alternativa, utilizzare la funzione Auto Goccia Ritardo per impostare il ritardo goccia. </li><li> Caricare il tubo di perline fluorescenti e regolare la portata fino a quando il tasso di soglia è ~ 3.000 a 4.000 eventi / secondo. Impostare la precisione sorta di &quot;iniziale&quot; e finalemente a &quot;sintonizzare&quot; nella finestra &quot;Layout Sort&quot;. Selezionare il filtro ottico e ordinare perline. Regolare il ritardo di goccia fino ~ 100% sono allineati a sinistra. Nota: Questo passaggio è fondamentale per fare in modo che le cellule di interesse specie in un flusso laterale. Le perline e il filtro ottico sono utilizzati per ottenere vicino a una deviazione gocciolina 100%. </li></ol></li></ol></li><li> Posizionare un ND (neutral density) Filtro FSC 1.5 all&#39;estremità sinistra del blocco rilevatore FSC. Impostare l&#39;estensione della finestra di 2.00 ms e il ridimensionamento FSC area a 1,00 (nella scheda &quot;Laser&quot; nella finestra &quot;citometro&quot;). </li><li> Prima di caricare provetta posizionare una linea di filtro campione di 50 um alla fine della linea di campionamento per evitare grumi. Per farlo, selezionate &quot;Modifica filtro campione&quot; nel menu &quot;citometro&quot;. </li><li> Testare la composizione del fluido campione per ottenere una buona separazione senza ventaglio tra flusso laterale e per evitare che le cellule di attaccarsi alla poliprotubi ne. <ol><li> Caricare la provetta, accendere le piastre di deflessione e selezionare &quot;Test tipo&quot; con il cassetto chiuso. Guardate i flussi laterali in caso di separazione senza troppi Fanning. Nota: Fanning è probabilmente dovuto ad un alta concentrazione di proteine ​​nel tampone. </li></ol></li><li> Caricare la provetta nello strumento FACS. Selezionare un campione di agitazione 300 rpm ed una temperatura del campione di 4 ° C. Selezionare &quot;Acquisire dati&quot; nella &quot;Acquisizione Dashboard&quot;. </li><li> Se necessario, diluire il campione per ottenere un tasso di evento appropriato ad un massimo di 5000 eventi / sec (ad una portata massima di 3,0). Rigorosamente rispettare questi limiti in modo da mantenere la purezza delle cellule ordinati. </li><li> Per analizzare e ordinare le celle, ottimizzare il valore di soglia FSC per eliminare i residui senza interferire con la popolazione di interesse. In scala logaritmica, regolare la tensione del rivelatore con il filtro 530/30 tubo fotomoltiplicatore (PMT) per rendereAssicurarsi che il segnale di fluorescenza della popolazione totale si inserisce all&#39;interno della scala, e porta sulla popolazione positivo (Figura 1, Gate 1). </li><li> Produrre un Forward Scatter-zona (FSC-A) / Side Scatter-zona (SSC-A) diagramma della popolazione positivo SYTO16 e regolare la FSC-A a circa 110 V in scala lineare, e la SSC-A a circa 150 V in scala logaritmica per visualizzare tutti gli eventi escludendo molto grandi cellule e aggregati cellulari. </li><li> Nella finestra &quot;Ordina Layout&quot;, impostare il &quot;modo Ordinamento Precision&quot; a &quot;purezza 4-way&quot; (maschera Yield: 0, Purezza Maschera: 32, Fase Maschera: 0). Selezionare &quot;Continua&quot; dal menu &quot;Target Eventi&quot; per l&#39;ordinamento continuo. </li><li> Aggiungere popolazioni per ordinare nel campo corrispondente ai tubi (nella finestra &quot;Sort Layout&quot;). Popolazioni posto con frequenze più alte al centro e quelli con frequenze più basse alle estremità. Impostare le piastre di tensione a 2.500 V. Durante l&#39;ordinamento, mantenere la raccolta del campione tUBE su ghiaccio. </li></ol> 4. cella Ordinamento <ol><li> Immediatamente prima di smistamento, celle filtranti usando un filtro 50 micron in un precedentemente rivestito 5 ml in polipropilene tubo tondo fondo. </li><li> Lavare il filtro a lungo con 1-2 ml di cernita tampone. </li><li> Cellule germinali Ordina fissi utilizzando un attrezzato laser cell sorter 488 nm secondo lo schema di gating dettagliato in figura 1. Raccogliere frazioni purificate in polipropilene 5 ml provette con fondo arrotondato precedentemente rivestite nella sezione 1 su ghiaccio. <ol><li> Assicurarsi che 100-200 ml di FBS è conservato nei tubi di raccolta per evitare incollaggio delle cellule ordinati alla parete del tubo. </li><li> Assicurarsi che la concentrazione di SYTO16 è saturare per evitare fluttuazioni di fluorescenza durante il periodo di smistamento. SYTO16 è saturare quando non c&#39;è un&#39;ulteriore variazione di intensità di colorazione della cellula al 488 parametro Alexa Fluor (colorazione DNA) nella grafica smistamento. Se necessario, aggiungere 1 ml diSYTO16 al tubo di smistamento per raggiungere la saturazione. </li><li> Visualizzare gli eventi totali su un grafico che visualizza i seguenti parametri: numero di eventi vs Alexa Fluor 488-A. </li><li> Selezionare le celle colorazione DNA positivi con Gate 1, come mostrato in Figura 1. <ol><li> Celle di visualizzazione dalla porta 1 su un grafico con SSC-A vs FSC-A come parametri <ol><li> Selezionare le celle con Gate 2, come mostrato in Figura 1. </li><li> Celle di visualizzazione dalla Porta 2 su un grafico utilizzando FSC A vs Alexa Fluor 488-A come parametri. </li><li> Selezionare celle con Gate 5 e 6 su Gate Porta 2 grafica, come mostrato in Figura 1. </li><li> Visualizza separatamente Gate 5 e Gate 6 sulla grafica che utilizzano Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A come parametri. </li><li> Selezionare spermiogenesi i passaggi 1-9 spermatidi sul Gate 5 grafica e spermiogenesis passaggi 10-12 spermatidi sul cancello 6 grafici, come mostrato in Figura 1. </li></ol></li><li> Displaycellule dalla porta 1 su un grafico utilizzando FSC A vs Alexa Fluor 488-A come parametri <ol><li> Selezionare le celle con Gate 3 e Gate 4, come mostrato in Figura 1. </li><li> Visualizza separatamente Gate 3 e Gate 4 sulla grafica che utilizzano Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A come parametri. </li><li> Selezionare spermiogenesi passaggi 13-14 spermatidi sul Gate 3 grafica e spermiogenesis passaggi 15-16 spermatidi sulla Porta 4 grafico, come mostrato in Figura 1. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines.">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472 (2011).</li><li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -. J., Yang, W. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis.">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li><li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+junction+dynamics+in+the+testis:+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development.">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li><li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis.">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice.">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li><li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis.">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li><li>Gr&#233;goire, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells.">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li><li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids.">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li><li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urz&#250;a, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat.">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis.">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li><li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice.">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair.">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lef&#232;vre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis.">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Cellule spermatogenic sono sempre stati difficili da studiare data la complessità del seminifero, nonché il limitato successo della coltura in vitro. Nel corso degli anni, molti approcci per purificare cellule germinali di varie specie sono stati sviluppati. Tecniche di sedimentazione che utilizzano purificazione gravità con Percoll o bovina siero gradienti di albumina solitamente forniscono una buona resa di cellule germinali intatte, ma mancano di adeguata definizione tra alcuni tipi di cellule come le cel...

Haploid round spermatids differentiate into spermatozoa by a process called spermiogenesis. This involves many different steps including the acquisition of a flagellum, chromatin and cytoskeleton remodeling, condensation of the nucleus as well as the loss of most of the cytoplasm. These unique cellular events must be finely regulated in order to produce a mature functional gamete with an intact genome suitable for fertilization. Spermiogenesis can hardly be studied in vitro since no reliable cell culture system has so far been able to support progression through the different steps of the process. Moreover, actual in vitro techniques lead to a poor yield1,2. In vivo, proper transitions through the different steps of spermiogenesis are crucial for the natural functional integrity of the male gamete. Successful purification of spermatids according to their differentiation steps has never been accomplished with a level of enrichment sufficient to allow molecular characterization of spermiogenesis. For instance, purification of key steps of the spermatidal differentiation would be especially useful to study the developing acrosome, formation of the midpiece3, cell junction dynamics4, RNA dynamics5, chromatin remodeling process6,7 or genomic stability8. Purification of spermatids has been hampered by their progressive morphological transformation, the lack of known stage-specific external biomarkers, and their peculiar shape and size. 
Although most male germ cells display a direct relationship between DNA staining and ploidy (DNA content), we noticed that such positive correlation is no longer applicable to spermatids. This stems from our early observation that seminiferous tubule sections show variable intensity of DNA staining throughout the different spermiogenesis steps. Although DNA staining is consistent with their haploid set of chromosomes from spermiogenesis steps 1 to 7 (round spermatids), we observed a sharp increase in fluorescence intensity with DAPI or SYTO 16 around the onset of nuclear reorganization and chromatin remodeling (spermiogenesis step 8) reaching a peak at the onset of nuclear condensation (spermiogenesis steps 11-12). Following condensation of the nucleus, DNA staining intensity decreases until spermiation (spermiogenesis step 16). We surmised that this was likely associated with the formation of their peculiar chromatin structure transition where histones are replaced by protamines. We therefore developed a reliable flow cytometry method that allows the separation of spermatids using the variation of DNA intensity of spermatids as a main selection parameter.
A simple flow cytometry approach is described to separate mouse spermatids with high purity (95-100%) based on their apparent DNA content (SYTO16 staining), size and granulosity. Spermatids are separated into four populations; spermiogenesis steps 1-9, 10-12, 13-14 and 15-16. Purified spermatids are suitable for genetic/genomic analysis, as well as proteomic applications as described in a recent publication from our group9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>For mouse anesthesia before euthanasia</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>For tube coating</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>For sorting buffer preparation</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>DNA staining</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round bottom tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>Sorted cells collection</td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical bottom tubes</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>TEC4 anaesthetic vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>Homemade mouse gas chamber</td><td></td><td></td><td>For mouse euthanasia</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon cell strainer</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m sample line filters</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>For cell fixation</td></tr><tr><td>Dynac centrifuge</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &amp;micro;m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser-euipped cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 &amp;mu;m filtered and keep at 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

step-specific sorting of mouse spermatids by flow cytometry

La differenziazione di spermatidi topo è uno processo critico per la produzione di un gamete maschile funzionale con un genoma intatto da trasmettere alla generazione successiva. Finora, gli studi molecolari di questa transizione morfologica sono stati ostacolati dalla mancanza di un metodo che consente un&#39;adeguata separazione di queste importanti fasi di differenziazione spermatid per analisi successive. Precedenti tentativi di gate adeguato di queste cellule in citometria a flusso potrebbe essere stato difficile a causa di un particolare aumento della fluorescenza del DNA in spermatidi in fase di rimodellamento della cromatina. Sulla base di questa osservazione, noi forniamo i dettagli di un semplice sistema di citometria a flusso, che permette la purificazione riproducibile di quattro popolazioni di spermatidi topo fissate con etanolo, ognuno dei quali rappresenta uno stato diverso nel processo di rimodellamento nucleare. L&#39;arricchimento della popolazione è confermato per mezzo di marcatori specifici per step e criteri morfologici. Gli spermatidi purificati possono essere utilizzati per genomica e proteomic analisi.

Strategia di gating utilizzato con citometria a flusso La figura 1 rappresenta la strategia di gating utilizzato in citometria a flusso per ordinare quattro popolazioni spermatidi altamente puri. In breve, le cellule con colorazione del DNA positivo (Alexa Fluor 488-A) sono selezionati prima con Porta 1. spermatidi da spermiogenesis Predellino 1-12 sono selezionati (Porta 2) su un diagramma a punti che mostra ...

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.5K Views.  Université de Sherbrooke. We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Video: Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Procedura di iniezione di spermatidi rotondi murini per studiare lo sviluppo embrionale

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Iniezione di spermatide rotondo di topo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari